Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Резюме

В настоящем документе описывается идентификация льда-связывающих белков с замораживанием терпимо растений путем оценки ингибирования активности льда рекристаллизации и последующего выделение нативных PIL, используя очистку льда сродства.

Аннотация

Ice-связывающие белки (PIL,) принадлежат к семейству индуцированных стрессом белков, которые синтезируются с помощью некоторых организмов, подвергшихся воздействию отрицательных температур. В растениях, повреждение замораживания происходит, когда внеклеточные кристаллы льда растет, что приводит к разрыву плазматической мембраны и возможной гибели клеток. Адсорбция PIL, чтобы кристаллов льда ограничивает дальнейший рост с помощью процесса, известного как лед рекристаллизации торможения (IRI), тем самым уменьшая повреждение клеток. PIL, также демонстрирует способность угнетает температуру замерзания раствора ниже точки плавления равновесия, свойство известного как тепловая гистерезиса (TH) активность. Эти защитные свойства повысили интерес к идентификации новых PIL, из-за их возможное использование в промышленных, медицинских и сельскохозяйственных применениях. Этот документ описывает идентификацию растений PIL, через 1) индукцию и извлечение PIL, в растительной ткани, 2) скрининг экстрактов для активности IRI и 3) выделение и PurifЦия ИБП. После индуцирования ИБФ при воздействии низкой температуры экстракты испытывают на активность IRI с использованием «анализа splat», который позволяет наблюдать рост кристаллов льда с использованием стандартного светового микроскопа. Этот анализ требует низкой концентрации белка и генерирует результаты, которые быстро получены и легко интерпретируются, обеспечивая начальный экран для активности связывания льда. Затем ИБП могут быть выделены из загрязняющих белков, используя свойство ИБФ для адсорбции на льду, с помощью методики, называемой «аффинная очистка льдом». Используя клеточные лизаты, собранные из растительных экстрактов, можно медленно выращивать ледяное полушарие на латунном зонде. Это включает IBPs в кристаллическую структуру поликристаллического льда. Не требуя априорных биохимических или структурных знаний о ИБФ, этот метод позволяет восстановить активный белок. Очищенные от льда белковые фракции могут быть использованы для нижестоящих применений, включая идентификацию pepприлив последовательности по масс-спектрометрии и биохимического анализа нативных белков.

Введение

Ice-связывающие белки (PIL , ) представляют собой разнородное семейство защитных белков , которые были обнаружены в ряде организмов , в том числе и растения, ^{насекомых-2, 3,} рыб и микробов ^4. Ключевой особенностью этих белков является их уникальная способность специфически и эффективно адсорбироваться кристаллов льда, изменяя их рост. PIL, имеют несколько документированных свойств, с двумя наиболее хорошо охарактеризованных будучи тепловой гистерезис (TH) и ингибирование льда рекристаллизации (IRI). TH активность более легко наблюдать в PIL, произведенных в замораживающих непереносимостью животных. Результаты этой деятельности в снижении точки замерзания кровеносной или интерстициальных жидкостей организмов для предотвращения замерзания. В противоположность этому, в морозильных толерантных организмов, которые неизбежно будут замерзать при отрицательных температурах, PIL, по всей видимости, обладают низкой активностью TH. Несмотря на низкой активности TH, высокая активность IRI ограничить лед крикStal рост часто наблюдается с этими белками. Для сублимационной терпимы организма, эта деятельность IRI предположительно помогает защитить клетки от неконтролируемого роста льда в внеклеточных отсеках.

Модель «Кнопка Матрас» может быть использован для описания механизма , с помощью которого PIL , предотвратить рост кристаллов льда ^5. В соответствии с этой моделью, PIL, специфически адсорбироваться на поверхности кристаллов льда с интервалами, таким образом, что молекулы воды могут только включают с ростом кристаллов льда решетки в пространстве между связанной PIL,. Это создает кривизну , что делает включение дополнительных молекул воды неблагоприятно, событие , которое может быть описано с помощью эффекта Гиббса-Томсон ^6. Якорь решетчатые воды гипотеза обеспечивает механизм для специфического связывания PIL, на поверхности кристаллов льда при этом наличие заряженных остатков, в частности, расположен на участке белка, связывающего льда, приводит к REOРГАНИЗАЦИЯ молекул воды , таким образом они соответствуют один или несколько плоскостей кристаллической решетки льда ^7.

TH активность может быть определена количественно путем измерения разности между плавления и замораживания температуры одного ледяного кристалла в присутствии IBP. В то время как активность TH является широко распространенным методом оценки активности, PIL, низкого зазора TH производимого заводом PIL, (как правило, лишь доли градуса) обычно требует высокой концентрации белка, специализированного оборудования и опыта оператора. Несмотря на то, не PIL, может ограничить рост кристаллов льда, это свойство, присущее всем PIL, и, таким образом, тестирование на активность IRI является эффективным начальный экран на наличие PIL, особенно для тех, с низкой активностью TH. Методология, используемая для проверки этой активности известен как «знак» анализа, в результате чего образец белка флэш заморожены для получения монослой мелких кристаллов льда, которые наблюдаются в течение определенного периода времени, чтобы определить, является лиРост кристаллов льда ограничен. В отличие от других методов, используемых для скрининга образца источника ткани на наличие PIL, этот метод применим к низкой концентрации белка в диапазоне 10-100 нг, использует легко панельном оборудование, и генерирует данные, которые быстро и легко интерпретировать. Тем не менее, важно подчеркнуть, что этот анализ обеспечивает начальный экран для PIL, которым необходимо следовать путем определения TH и формирования кристаллов льда.

Выделение нативных белков является сложной задачей, часто требует информации о структурных и биохимических свойств белка. Сродство PIL, для льда позволяет для выделения этих белков с использованием льда в качестве субстрата для целей очистки. Поскольку большинство молекул выталкиваются вперед границы льда-воды в процессе роста кристаллов льда, медленный рост ледяной полусферы в присутствии результатов выборки IBP в высоко очищенной пробе, лишенный большого quantitх года примесных белков и растворенные вещества. Этот метод был использован для идентификации PIL , от насекомых ^{8, 9, 10, 11} бактерий, рыб и растений ^{12 13, 14.} Кроме того, IBP-обогащенные фракции, полученные с помощью этого метода можно также использовать для нисходящего биохимического анализа. В настоящем документе описывается идентификацией PIL, в растениях путем индукции и извлечения PIL, анализ активности IRI, чтобы подтвердить наличие белков, а также выделение белков с помощью аффинной очистки льда.

протокол

Настройка устройства 1. Splat

1. Заполните температурно-программируемой ванны, циркулирующей воды с этиленгликолем (50% об / об в воде).
   Примечание: Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован.
2. Чтобы собрать внешнюю камеру, использовать изолированный пластиковые трубы, чтобы прикрепить ванну воды в стеклянную емкость с двойными стенками. Изолируйте стеклянный шар с пенополистиролом и крышка с пластиковой крышкой чашки Петри. Вырезать 3-4 дюйма отверстие в нижней части камеры полистирола, так что источник света можно увидеть через стеклянную камеру.
3. Установите внешнюю камеру на рассечение микроскоп, снабженный портом камеры и 4X поляризованной линзы объектива с 10-кратным хрусталика. Поместите дополнительный кусок поляризованной пленки в нижней части внешней камеры.
4. Зажим на 1-1,5 м трубки (~ 5 см в диаметре) на штатив и место внутри большого контейнера полистирола, наряду с охлаждающим блоком, расположеннымами под трубку на основании штатива.

2. Получение нативного белка экстрактов для анализа IRI

1. Для того, чтобы индуцировать экспрессию PIL, в замораживающих толерантных трав или других замораживающих устойчивых видов растений, холодных акклиматизации растений в течение 1 недели при температуре 4 ° С в условиях низкой освещенности (6 ч свет / 18 ч темного). Это не относится к образцам, собранных с поля, которые уже подверглись воздействию низких температурных условий и сроков акклиматизации.
2. Получают примерно 0,1 г ткани листьев путем разрезания у основания стебля, а затем поместить в 1,5 мл трубки. Сразу вспышка заморозить образец в жидком азоте и хранят при -80 ° С до использования.
3. Для того, чтобы лизировать клетки, измельчить образец ткани в мелкий порошок с помощью ступки и пестика в присутствии жидкого азота. Убедитесь, что жидкий азот не испаряется в процессе гомогенизации.
4. Сразу же место пробы грунта на лед и позволяют жидкий азот полностью испарился. Добавляют 1 мл нативного белка extractiна буфере, содержащий 10 мМ Трис-HCl, 25 мМ NaCl (рН 7,5), с двумя ЭДТОМ свободных ингибиторов протеазы таблеток добавлены непосредственно перед использованием. Пипетка для смешивания; не вихрь.
   Примечание: Дополнительные добавки, возможно, должны быть использованы, если лизат содержит вторичные метаболиты (см Обсуждения).
5. Осторожно встряхните образцы в течение ночи (18-24 ч) при температуре 4 ° С. Провести оставшиеся шаги при 4 ° С.
6. Удалить клеточный дебрис путем центрифугирования образцов при ~ 16000 мкг в течение 5 мин. Сохранить растворимую фракцию и центрифуги в течение еще 5 мин, если клеточный дебрис сохраняется. Очищенные образцы можно хранить при температуре от -20 ° С до использования.

3. Анализ Splat Предварительный эксперимент Настройка

1. Налейте 100 мл гексана во внешнюю камеру, созданной с поляризованной пленкой и добавить 5-6 десикацию шарики, чтобы предотвратить попадание влаги накапливаться на слайдах. Добавьте небольшое количество вакуумной смазки на пластины, закрывающей ванну и крутить, чтобы обеспечить герметичное уплотнение и предотвратить испарение гексана.
2. Охладите гексановую ванну между -4 ° C и -6 ° C с помощью программируемой водяной бани примерно за 2-3 часа до начала эксперимента. Перед началом эксперимента обязательно проверьте температуру гексана с помощью термометра.
3. Поместите охлаждающий блок в полистироловую коробку непосредственно под пластиковую трубку и закройте полностью сухим льдом за 40 минут до начала эксперимента.
4. Перед началом анализа убедитесь, что трубка ровная. Чтобы определить, где на охлаждающем блоке будет падать образец, сначала проверьте процедуру с водой и укажите, где образец падает с помощью маркера (как описано ниже).
5. Удалите сухой лед с верхней части холодного блока и поместите крышку стекла микроскопа слайд на метку капли, которая была определена с водой.
6. Непосредственно перед началом анализа включите источник света и очистите лед, образовавшийся на дне стеклянной камеры. Избегайте держать источник света включенным, если не кристаллы льдав настоящее время визуализируется, чтобы предотвратить нагревание гексана.

4. Проведение анализе Splat

1. Окуните одноразовый наконечник, прикрепленный к автоматической пипетки (1-20 мкл) в иммерсионного масла, используя бумажное полотенце удалить излишки масла. Этот шаг позволит образец падать, а не придерживаться внешней пипетки.
   Примечание: Удаление избытка масла из пипетки имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы капли масла не образуются на кристаллах льда, что делает визуализацию трудно.
2. Пипетка 10 мкл образца и поместить пипеткой непосредственно над пластиковой трубки перед выпуском образца. Отдельный «знак» звук должен быть услышан, когда образец попадет в стекле крышку слайд, создавая монослой кристаллов льда.
3. Быстро и осторожно снять стекло микроскопа с холодной блока с помощью пинцета и место в гексане ванны на верхней части поляризационной пленки.
4. Глядя под микроскопом, поставить стекло микроскопа в поле зрения и объявленияпросто линза объектива, так что кросс-поляризация позволяет для визуализации высокого контраста кристаллов льда. Отрегулировать увеличение до 40x.
5. Установите камеру к микроскопу и настроить параметры на «макро», чтобы позволить четкую визуализацию кристаллов льда и захвату изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидание до 1 ч, чтобы кристаллы льда расти может дать более четкую картину.
6. Повторите шаги 4.1-4.5 для всех образцов. Как правило, размещать до 6 слайдов с различным образцом в камере гексан.
7. Выключите источник света и поместите пластиковую пластину над гексаном ванной, что обеспечивает герметичное уплотнение. Разрешить кристаллы льда отжечь в течение ночи (12-24 ч, поддерживая постоянный период отжига в пределах конкретного анализа). После инкубации захвата изображения ледяных пленок, как описано выше.
   Примечание: Некоторые образцы могут рекристаллизации быстрее, чем другие. Если нет рекристаллизации не видно через 12 ч, кристаллы позволяют отжечь до 24 ч, чтобы гарантировать, что не recrystalliзация будет происходить.

Анализ 5. Анализ данных Splat

1. Загрузить фотографии на компьютер и непосредственно сравнить размер кристаллов льда до и после отжига. Образцы с активностью льда рекристаллизации не будет расти, тогда как образцы без IRI не будет активности рекристаллизации формированию заметно более крупные кристаллы льда. Свет помехи сделают крупные кристаллы льда появляются в нескольких различных оттенках и, таким образом, легко видеть.

6. Ice сродством Установка очистки оборудования

1. Заполните температурно-программируемой ванны, циркулирующей воды с этиленгликолем. Зеленый автомобильной этиленгликоль может быть использован.
2. Подключите ванну к полой, латуни зонду с использованием изолированных пластиковых трубок ^15.
3. Построить полистирол контейнер, в котором 150 мл химического стакан может поместиться ожидающим. Создайте крышку для контейнера с отверстием в центре для духового хладопроводе.

7.Приготовление образцов для льда-аффинной очистки

1. Холодное акклиматизироваться растительной ткани, как описано в разделе 2.1.
2. Собирают ~ 100-150 г измельченного биомассы (этап 2.3) в 20 мл пробирки и немедленно заморозить мигать. Образцы могут храниться при температуре -80 ° C до использования.
3. Подготовка образца, как описано в разделах 2.3-2.5. Используйте соотношение 1: 1 (мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка) для взмучивания листовой ткани. Используйте дополнительные таблетки ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации PIL, эндогенных протеаз.
   Примечание: Если образец ткани слишком концентрированный, регулировать соотношение до 1: 2 или 1: 3 (мг ткани: мл нативного буфера для экстракции белка).
4. Для того, чтобы удалить остатки клеток, сито лизата через 2 слоя марли, 3 раза. Гранулы мусора путем центрифугирования при 30000 х г в течение 40 мин при 4 ° С.
5. Увеличение объема образца до 120 мл с использованием нативного буфера для экстракции белка. Используйте лизат немедленно для очистки льда сродства кВо избежание какой-либо потери льда-связывающей активности.

8. Проведение ледово-аффинной очистки

1. До начала очистки, установить ванну программируемую воды для охлаждения от -0.5 ° C до -3 ° С со скоростью -0.04 ° C / ч.
   Примечание: Скорость охлаждения может быть скорректирована в зависимости от начального объема образца.
2. Охлаждает лед палец до -0,5 ° С, а затем погружать его в 50 мл пробирки, содержащей холодную дистиллированную воду. Добавьте несколько кусочков льда для облегчения льда зарождение и позволяют тонким слоем льда, образуя на пальце. Этот процесс обычно занимает от 20 до 30 мин.
   Примечание: Любые шишки на пальце со льдом покрытием должны быть сглажены с рукой в ​​перчатке до размещения в образце. Если слой льда не образуется при -0.5 ° С, понизить температуру до -0.75 ° C.
3. Поместите образец в стеклянном стакане объем 150 мл, содержащий небольшую магнитную мешалку в полистирольном контейнер на верхней часть магнитной мешалки. Убедитесь в том, что лед палецпо центру и опускается по меньшей мере, на полпути в жидкой пробе. Печать контейнера.
4. Позволяет программе работать в течение примерно двух дней, проверяя каждые 24 часа. После того, как 50% выборки заморожен, остановить программу. Включение PIL, в ледяном полушарие приведет к «льду травлению».
   Примечание: Очистные эксперименты можно сделать с использованием больших объемов образцов с длиной времени, в котором работает программа скорректированной соответствующим образом.
5. Для того, чтобы удалить лед полушарие, теплый зонд до 4 ° С, полоскание полусферу с дистиллированной водой для удаления несвязанного белка, а затем оттаивают при температуре 4 ° С.
   Примечание: Большинство PIL , не стабильны в воде и соответствующего буфера (т.е. 50 мМ Трис-HCl, рН 8 или 50 мМ бикарбоната аммония, рН 8) должны быть добавлены периодически в процессе оттаивания (приблизительно 1 мл / 2 ч) , Лед полушария могут быть заворачивали в алюминиевой фольге и хранили при -20 ° C до оттаивания.
6. Если ледяная полусфера все еще содержитс пигментом, или для увеличения очистки образца, повторите шаги 8.1-8.5 2-3 раза.
   Примечание: Хотя концентрация IBP может быть ниже после нескольких раундов очистки, чистота является более ценным, чем выход, если очищенные образцы будут проанализированы с помощью MS. Если достаточное количество материала доступно, рекомендуются три раунда очистки льда сродства.

9. Определение PIL,

1. Так как PIL, содержатся в большом объеме следующего таяния ледяного полушария, концентрат образцов. Концентрат образцов, содержащих ~ 100 г ткани до ~ 1-3 мл с помощью центробежных концентрационных пробирок с 3000 Да молекулярной массой отсечением, чтобы избежать потерь мелких белков.
2. Перед отправкой образцов для MS, определяет концентрацию белка с помощью количественного анализа белка, таких как BCA или Бредфорд. Оценка чистоты образцов методом гель-электрофореза, таких как SDS-PAGE. Тест очищенных белков для активности IRI до сутиnding для MS, чтобы гарантировать, что активный белок был сохранен за счет стадий очистки и концентрации.
3. Использование концентрированных образцов непосредственно для масс - спектрометрического анализа ^10.

Результаты

Для простоты установки, рис 1 и На рисунке 2, включены в качестве визуальных представлений оборудования , используемого для анализа IRI и очистки льда сродства, соответственно. Результаты анализа IRI с использованием экстрактов ,...

Обсуждение

Для успешного анализа и очистки PIL, важно понимать, чувствительная к температуре характера некоторых из этих белков. Некоторые растения PIL, становится нестабильной при температуре выше 0 ° С, что приводит к развертке, осадков и бездействию. Для того чтобы получить активный PIL, часто бывае...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic