Identificazione di Plant proteine ​​Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione

Riepilogo

Questo documento delinea l'identificazione di proteine ​​di ghiaccio-binding da piante freeze-tolleranti attraverso la valutazione di attività di inibizione ghiaccio ricristallizzazione e successivo isolamento di IBPS native che utilizzano la purificazione ghiaccio affinità.

Abstract

proteine ​​ghiaccio-binding (IBPS) appartengono a una famiglia di proteine ​​indotte da stress che sono sintetizzate da alcuni organismi esposti a temperature inferiori allo zero. Nelle piante, danni da congelamento si verifica quando i cristalli di ghiaccio extracellulari crescere, con conseguente rottura delle membrane plasmatiche ed eventuale morte cellulare. Adsorbimento di IBPS di cristalli di ghiaccio limita ulteriormente la crescita con un processo noto come inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI), riducendo così i danni cellulari. IBPS inoltre dimostrare la capacità di abbassare il punto di congelamento di una soluzione al di sotto del punto di fusione di equilibrio, una proprietà nota come isteresi termica (TH) attività. Queste proprietà protettive hanno sollevato interesse per l'identificazione di nuovi IBPS causa del loro potenziale utilizzo in applicazioni industriali, mediche e agricole. Questo documento descrive l'identificazione di pianta IBPS attraverso 1) l'induzione ed estrazione di IBPS nei tessuti vegetali, 2) lo screening di estratti per attività IRI, e 3) l'isolamento e Purificazione di IBPS. Seguendo l'induzione di IBPS da esposizione a bassa temperatura, estratti sono testati per l'attività IRI utilizzando un 'analisi splat', che consente l'osservazione di crescita dei cristalli di ghiaccio utilizzando un microscopio ottico standard. Questo test richiede una bassa concentrazione di proteine ​​e genera risultati che si ottengono in modo rapido e facile interpretazione, fornendo una schermata iniziale per ghiaccio attività di legame. IBPS può quindi essere isolato da proteine ​​contaminanti utilizzando la proprietà di IBPS di adsorbimento sul ghiaccio, attraverso una tecnica chiamata 'ice-affinità di purificazione'. Utilizzando lisati cellulari raccolti da estratti di piante, un emisfero ghiaccio può essere coltivata lentamente su una sonda di ottone. Questo incorpora IBPS nella struttura cristallina del ghiaccio policristallino. Non richiede una conoscenza a priori biochimica o strutturale della IBP, questo metodo consente il recupero di proteina attiva. frazioni proteiche ghiaccio-purificato può essere utilizzato per applicazioni a valle comprendono l'identificazione di pepsequenze marea mediante spettrometria di massa e analisi biochimica delle proteine ​​native.

Introduzione

Proteine ghiaccio-binding (IBPS) sono una famiglia di proteine diverse protettivi che sono stati scoperti in un numero di organismi comprese le piante ^{1, 2} insetti, pesci ^{3, 4} e microbi. La caratteristica fondamentale di queste proteine ​​è la loro capacità unica di assorbire specificamente ed efficiente per cristalli di ghiaccio, modificando la loro crescita. IBPS hanno diverse proprietà documentati, con i due più ben caratterizzati essere isteresi termica (TH) e l'inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI). attività di TH è più facilmente osservata in IBPS prodotte in animali freeze-intolleranti. Questa attività comporta l'abbassamento del punto di congelamento di fluidi circolatori o interstiziali organismi per evitare il congelamento. Al contrario, negli organismi freeze-tolerant, che inevitabilmente congelare a temperature sotto lo zero, IBPS sembrano avere bassa attività TH. Nonostante la bassa attività TH, una elevata attività IRI per limitare grido di ghiacciocrescita stal viene spesso osservato con queste proteine. Per l'organismo freeze-tolerant, questa attività aiuta IRI presumibilmente proteggere le cellule dalla crescita incontrollata di ghiaccio in compartimenti extracellulari.

Il modello "pulsante materasso" può essere usato per descrivere il meccanismo con cui IBPS prevenire la crescita di cristalli di ghiaccio ^5. Secondo questo modello, IBPS specificamente adsorbe sulla superficie cristalli di ghiaccio ad intervalli, in modo tale che le molecole d'acqua possono incorporare solo con la crescente reticolo cristallino ghiaccio nello spazio tra legata IBPS. Questo crea una curvatura che rende l'incorporazione di molecole d'acqua supplementari sfavorevole, un evento che può essere descritto con l'effetto Gibbs-Thomson ^6. Il ancorato acque clatrati ipotesi fornisce un meccanismo per il legame specifico IBPS alla superficie del cristallo di ghiaccio per cui la presenza di residui carichi, in particolare posizionato nel sito di legame ghiaccio proteine, provoca la REOrganization di molecole d'acqua in modo da corrispondere a uno o più piani del reticolo cristallino ghiaccio ^7.

attività TH può essere quantificata misurando la differenza tra la fusione e temperature di congelamento di un singolo cristallo di ghiaccio in presenza di un IBP. Mentre l'attività TH è un metodo ampiamente accettato di valutare l'attività di IBPS, il divario partire TH prodotta dall'impianto IBPS (in genere solo una frazione di grado) richiede normalmente una concentrazione proteica alta, attrezzature specializzate ed esperienza dell'operatore. Sebbene non IBPS possono limitare la crescita dei cristalli di ghiaccio, è una proprietà condivisa da tutti IBPS e prove quindi per attività IRI è una schermata iniziale effettivo per la presenza di IBPS, soprattutto per quelli con bassa attività TH. La metodologia utilizzata per testare questa attività è noto come un 'analisi splat', in cui un campione di proteina è istantaneo congelato per produrre un monostrato di piccoli cristalli di ghiaccio, che si osservano in un periodo di tempo per determinare secrescita dei cristalli di ghiaccio è limitato. A differenza di altri metodi utilizzati per lo screening di un campione di tessuto di origine per la presenza di IBPS, questa tecnica è applicabile a basse concentrazioni di proteine ​​nell'intervallo 10-100 ng, utilizza attrezzature facilmente fabbricato, e genera dati che vengono rapidamente e facilmente interpretato. Tuttavia, è importante sottolineare che questo saggio fornisce una schermata iniziale per IBPS che devono essere seguite dalla determinazione di TH e sagomatura cristalli di ghiaccio.

L'isolamento di proteine ​​native è impegnativo, spesso richiedendo informazioni riguardanti le proprietà strutturali e biochimiche di una proteina di interesse. L'affinità di IBPS di ghiaccio consente l'isolamento di queste proteine ​​usando ghiaccio come substrato per scopi di purificazione. Poiché la maggior parte delle molecole vengono spinti in avanti del limite ghiaccio-acqua durante la crescita dei cristalli di ghiaccio, la crescita lenta di un emisfero ghiaccio in presenza di un IBP campione comporti un campione altamente purificato, privo di grandi quantitzioni del proteine ​​contaminanti e soluti. Questo metodo è stato utilizzato per identificare IBPS da insetti ^{8, 9, 10, 11,} batteri pesci ¹² e piante ^{13, 14.} Inoltre, le frazioni arricchite IBP-conseguiti mediante questo metodo può essere utilizzato anche per l'analisi biochimica valle. Questo documento descrive l'identificazione di IBPS nelle piante attraverso l'induzione ed estrazione di IBPS, analisi dell'attività IRI per confermare la presenza di proteine, e l'isolamento di proteine ​​usando purificazione di affinità ghiaccio.

Protocollo

Impostazione Apparecchiatura 1. Splat

1. Riempire un bagno di acqua circolante temperatura programmabile con glicole etilenico (50% v / v in acqua).
   NOTA: verde automotive glicole etilenico può essere utilizzato.
2. Per assemblare la camera esterna, utilizzare tubi in plastica completamente isolato per collegare bagnomaria in una ciotola di vetro a doppia parete. Isolare la ciotola di vetro con polistirene espanso e coprire con un coperchio capsula di Petri in plastica. Tagliare un foro 3-4 pollici sul fondo della camera di polistirene in modo che la sorgente luminosa può essere visto attraverso la camera di vetro.
3. Montare la camera esterna su un microscopio dissezione, dotato di porta fotocamera e una lente obiettivo 4X polarizzato con una lente oculare 10x. Posizionare un pezzo aggiuntivo di pellicola polarizzata nel fondo della camera esterna.
4. Bloccare un 1-1,5 m tubo (~ diametro di 5 cm) su un supporto storta e posto all'interno di un grande contenitore di polistirolo, insieme ad un blocco di raffreddamento posizionato sotto il tubo alla base del supporto storta.

2. Preparazione di proteina nativa estratti per l'analisi IRI

1. Per indurre l'espressione di IBPS in erbe freeze-tolerant o altre specie vegetali freeze-tolerant, piante acclimatare freddo per 1 settimana a 4 ° C, in condizioni di luce bassa (6 h debole / 18 h scuro). Ciò non vale per campioni raccolti dal campo che sono già stati esposti a condizioni di bassa temperatura e periodi di acclimatazione.
2. Ottenere circa 0,1 g di tessuto fogliare tagliando alla base dello stelo e quindi collocare in una provetta da 1,5 ml. Subito lampeggiare congelare il campione in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Per lisare le cellule, macinare campione di tessuto in una polvere fine con un mortaio e pestello sotto azoto liquido. Assicurarsi che l'azoto liquido non evapori durante il processo di omogeneizzazione.
4. Immediatamente posto campioni macinati su ghiaccio e permettere all'azoto liquido di evaporare completamente. Aggiungere 1 ml di una proteina nativa extractiil tampone contenente 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), con due inibitori della proteasi compresse privo di EDTA aggiunti immediatamente prima dell'uso. Pipetta per mescolare; Non fare vortice.
   NOTA: può essere necessario utilizzare additivi addizionali se il lisato contiene metaboliti secondari (vedi la discussione).
5. agitare delicatamente campioni durante la notte (18-24 ore) a 4 ° C. Effettuare i passaggi rimanenti a 4 ° C.
6. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione campioni a ~ 16.000 xg per 5 min. Conservare la frazione solubile e centrifugare per altri 5 minuti se persiste detriti cellulari. campioni purificati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso.

3. Splat Assay pre-esperimento Impostare

1. Versare 100 ml di esano nella camera esterna impostato con la pellicola polarizzata e aggiungere 5-6 perline essiccazione per evitare la formazione di umidità sulle slitte. Aggiungere una piccola quantità di grasso vuoto alla piastra copre il bagno e ruotare per assicurare una buona tenuta e impedire l'evaporazione dell'esano.
2. Raffreddare il bagno di esano tra -4 ° C e -6 ° C si usa il bagnomaria programmabile circa 2-3 ore prima di iniziare l'esperimento. Assicurati di controllare la temperatura del esano con un termometro prima di iniziare l'esperimento.
3. Posizionare il blocco di raffreddamento in una scatola di polistirolo direttamente sotto il tubo di plastica e coprire completamente con ghiaccio secco, 40 minuti prima di iniziare l'esperimento.
4. Prima di iniziare il test, assicurarsi che il tubo sia a livello. Per determinare se il blocco di raffreddamento del campione cadrà, prima prova la procedura con acqua e indicare dove il campione gocce con un marcatore (come descritto sotto).
5. Rimuovere ghiaccio secco dalla parte superiore del blocco di raffreddamento e posizionare un vetrino per microscopio copertura sul marchio goccia che è stata determinata con acqua.
6. Immediatamente prima del test, accendere la sorgente luminosa e raschiare il ghiaccio che si è formato sul fondo della camera di vetro. Evitare di tenere la sorgente di luce a meno che non cristalli di ghiacciovengono visualizzati per evitare il riscaldamento della esano.

4. L'esecuzione del saggio Splat

1. Immergere la punta monouso apposto su un pipetta automatica (1-20 mL) in olio di immersione, con un tovagliolo di carta rimuovere l'olio in eccesso. Questo passaggio consentirà il campione di cadere, piuttosto che aderire all'esterno della pipetta.
   NOTA: La rimozione olio in eccesso dalla pipetta è fondamentale per garantire che le goccioline di olio non si formano sui cristalli di ghiaccio, rendendo la visualizzazione difficile.
2. Pipettare 10 ml di campione e pipetta direttamente sulla tubazione di plastica prima di rilasciare il campione. Un suono distinto 'splat' dovrebbe essere ascoltato quando il campione colpisce il vetrino copertura in vetro, creando un monostrato di cristalli di ghiaccio.
3. Rapidamente e con attenzione rimuovere il vetrino dal blocco freddo usando pinzette e posto nel bagno esano sopra della pellicola polarizzante.
4. Guardando al microscopio, mettere il vetrino da microscopio nel campo visivo e adsolo la lente obiettivo in modo che la polarizzazione incrociata permette la visualizzazione dei cristalli di ghiaccio ad alto contrasto. Regolare ingrandimento 40x.
5. Fissare la fotocamera al microscopio e regolare le impostazioni di "macro" per consentire chiara visualizzazione dei cristalli di ghiaccio e catturare l'immagine.
   NOTA: In attesa fino a 1 h per consentire cristalli di ghiaccio di crescere può dare un quadro più chiaro.
6. Ripetere i passaggi 4,1-4,5 per tutti i campioni. Tipicamente, inserire fino a 6 vetrini con un altro campione nella camera di esano.
7. Spegnere la sorgente luminosa e collocare un piatto di plastica sopra la vasca esano, assicurando una tenuta ermetica. Permettono cristalli di ghiaccio per temprare notte (12-24 h, mantenendo un periodo ricottura coerente all'interno di un particolare dosaggio). Dopo l'incubazione, catturare le immagini dei film di ghiaccio come descritto sopra.
   NOTA: Alcuni campioni possono ricristallizzare più rapidamente di altri. Se nessun ricristallizzazione è evidente dopo 12 ore, consentire cristalli temprare fino a 24 ore per garantire che non recrystallizione si verificherà.

Analisi 5. Splat dati dosaggio

1. Carica le foto su un computer e confrontare direttamente le dimensioni dei cristalli di ghiaccio prima e dopo la ricottura. Campioni con attività ricristallizzazione ghiaccio non crescerà, mentre i campioni senza alcuna attività IRI ricristallizzare formare cristalli di ghiaccio notevolmente più grandi. interferenza della luce farà grandi cristalli di ghiaccio appaiono leggermente diverse tonalità e quindi sono facili da vedere.

6. Ice affinità Setup purificazione dell'aria

1. Riempire un bagno di acqua circolante temperatura programmabile con glicole etilenico. Verde automobilistico glicole etilenico può essere utilizzato.
2. Collegare il bagno ad una sonda cava, ottone con isolamento tubi di plastica ^15.
3. Costruire un contenitore di polistirolo in cui un beaker da 150 può inserirsi agevolmente. Creare un coperchio per il contenitore con un foro al centro per il dito freddo in ottone.

7.Preparazione dei campioni per Ice-affinità Purificazione

1. tessuto vegetale acclimatare freddo come descritto nella sezione 2.1.
2. Raccogliere ~ 100-150 g della biomassa a terra (punto 2.3) in 20 mL tubi e subito lampeggiare congelare. I campioni possono essere conservati a -80 ° C prima dell'uso.
3. Preparare campione come descritto nelle sezioni 2.3-2.5. Utilizzare un rapporto 1: 1 (mg di tessuto: mL di tampone di estrazione proteina nativa) per risospensione di tessuto fogliare. Utilizzare ulteriori compresse inibitore della proteasi per evitare la degradazione di IBPS dalle proteasi endogene.
   NOTA: Se il campione di tessuto è troppo concentrato, regolare il rapporto di 1: 2 o 1: 3 (mg di tessuto: mL di tampone di estrazione proteina nativa).
4. Per rimuovere i detriti cellulari, setaccio lisato attraverso 2 strati di garza, 3 volte. Pellet i detriti per centrifugazione a 30.000 xg per 40 min a 4 ° C.
5. Aumentare il volume del campione a 120 ml con tampone di estrazione proteina nativa. Utilizzare il lisato immediatamente per la purificazione ice-affinitàevitare qualsiasi perdita di attività ghiaccio vincolante.

8. Conducting Ice-affinità Purificazione

1. Prima della purificazione, impostare il bagno d'acqua per raffreddare programmabile da -0.5 ° C a -3 ° C ad una velocità di -0.04 ° C / h.
   NOTA: La velocità di raffreddamento può essere regolata a seconda del volume iniziale del campione.
2. Raffreddare il dito ghiaccio a -0,5 ° C e successivamente immergere in una provetta da 50 ml contenente acqua distillata fredda. Aggiungere un paio di cubetti di ghiaccio per facilitare la nucleazione del ghiaccio e permettere un sottile strato di ghiaccio per formare sul dito. Questo processo richiede in genere tra 20 e 30 min.
   NOTA: Le eventuali grumi sul dito ghiaccio rivestite dovrebbero essere smussati con una mano guantata prima di mettere in mostra. Se uno strato di ghiaccio non forma a -0.5 ° C, abbassare la temperatura a -0.75 ° C.
3. Collocare il campione in un beaker di vetro 150 contenente una piccola ancoretta magnetica in un contenitore di polistirolo sopra l'agitatore magnetico. Assicurarsi che il dito è il ghiacciocentrato e abbassato almeno metà strada nel campione liquido. Sigillare il contenitore.
4. Lasciare che il programma da eseguire per circa due giorni, controllando ogni 24 h. Una volta che il 50% del campione è congelato, arrestare il programma. L'incorporazione di IBPS nell'emisfero ghiaccio si tradurrà in "ice-etching".
   NOTA: gli esperimenti di depurazione può essere fatto utilizzando grandi volumi di campione con il periodo di tempo in cui il programma viene eseguito adeguati di conseguenza.
5. Al fine di rimuovere l'emisfero ghiaccio, riscaldare la sonda a 4 ° C, lavare l'emisfero con acqua distillata per rimuovere proteine ​​non legato, e poi scongelare a 4 ° C.
   NOTA: Più IBPS non sono stabili in acqua e un tampone appropriato (cioè 50 mM Tris-HCl, pH 8 o 50 mM di bicarbonato di ammonio, pH 8) dovranno essere aggiunti periodicamente durante il processo di scongelamento (circa 1 mL / 2 h) . emisferi ghiaccio possono essere avvolti in carta stagnola e conservati a -20 ° C prima di scongelamento.
6. Se il ghiaccio-emisfero ancora contieneO per aumentare la purificazione del campione, ripetere i passaggi 8.1-8.5 2-3 volte.
   NOTA: Anche se la concentrazione di IBP può essere inferiore dopo più cicli di purificazione, la purezza è più preziosa della resa se i campioni purificati saranno analizzati utilizzando MS. Se è disponibile materiale sufficiente, si raccomanda tre cicli di purificazione di affinità di ghiaccio.

9. Identificazione degli IBP

1. Poiché IBP sono contenuti in un grande volume dopo lo scongelamento dell'emisfero del ghiaccio, concentrare i campioni. Concentrati i campioni contenenti ~ 100 g di tessuto a ~ 1-3 ml utilizzando tubi centrifughi di concentrazione con un taglio molecolare di 3000 Da per evitare la perdita di piccole proteine.
2. Prima di inviare campioni per MS, determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di quantificazione della proteina come un test BCA o Bradford. Stima la purezza dei campioni mediante elettroforesi gel come SDS-PAGE. Prova le proteine ​​purificate per l'attività IRI prima di sending per MS garantire che proteina attiva è stata mantenuta attraverso le fasi di purificazione e concentrazione.
3. Utilizzare campioni concentrati direttamente per l'analisi di spettrometria di massa ^10.

Risultati

Per facilità di set-up, figura 1 e Figura 2 sono inclusi come rappresentazioni visive di apparecchiature utilizzate per l'analisi IRI e purificazione ghiaccio affinità, rispettivamente. Risultati di analisi IRI con estratti raccolti da infestanti senape con e senza IBPS sono rappresentati in figura 3. Questi risultati dimostrano che gli estratti raccolti da infestanti senape...

Discussione

Per l'analisi di successo e purificazione di IBPS, è importante comprendere la natura sensibile alla temperatura di alcune di queste proteine. Determinate macchine IBPS diventa instabile a temperature superiori a 0 ° C, con conseguente dispiegamento, precipitazione e inattività. Per ottenere IBPS attive, è spesso importante che le piante vengono elaborati in una stanza fredda (~ 4 ° C) e campioni sono mantenuti in ghiaccio durante la sperimentazione. Un altro fattore da considerare quando si utilizzano cellule ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic