סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיה להכין 3D, מתכלים, פיגומי תא דמוי קצף המבוססים על אלסטומרים גביש נוזלי ביולוגיים בצד שרשרת (LCEs). ניסויי מיקרוסקופיה Confocal מראים כי LCEs דמוי קצף לאפשר התקשרות תא, התפשטות, ואת היישור הספונטני של myoblasts C2C12s.

Abstract

כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד בהכנת פיגום תא 3D, מתכלה, כמו קצף. פיגומים אלה הוכנו על ידי גוש כוכב cross-linking שיתוף פולימרים שמציעות יחידות כולסטרול כמו קבוצה צדדית צד-שרשרת, וכתוצאה מכך-A smectic (SMA) אלסטומרים גביש נוזלי (LCEs). קצף דמוי פיגומים, שהוכנו באמצעות תבניות מתכת, וכוללים microchannels ביניהם, מה שהופך אותם למתאימים כמו פיגומי תרבית תאי 3D. המאפיינים המשותפים של המבנה הרגיל של קצף המתכת של תוצאת אלסטומר ב פיגום תא 3D מקדם לא רק התפשטות תאים גבוהה בהשוואה לסרטי templated הקונבנציונליים נקבוביים, אלא גם לניהול טוב יותר של תחבורה המונית (כלומר, מזינים, גזים, פסולת , וכו '). האופי של תבנית המתכת מאפשר מניפולציה הקלה של צורות קצף (כלומר, לחמניות או סרטים) ועל הכנת הפיגומים בגדלים נקבוביים שונים ללימודי תאים שונים תוך שמירה על interconnecטבע נקבובי טד מהתבנית. תהליך התחריט אינו משפיע על הכימיה של אלסטומרים, שימור הטבע הביולוגי מתכלה שלהם. אנו מראים כי LCEs smectic אלה, כאשר גדלו במשך תקופות זמן נרחבות, לאפשר לימוד בונת רקמות רלוונטית ומורכבת קליניים תוך קידום הצמיחה וההתפשטות של תאי.

Introduction

ישנן מספר דוגמאות של חומרים סינטטיים ביולוגיים ביולוגיים מיועדים ליישום במחקרי תא לשחזור רקמות המכוונים מצורף תא התפשטות ^{1, 2, 3, 4, 5.} היו כמה דוגמאות של חומרים ביולוגיים, המכונים אלסטומרים גביש נוזליים (LCEs), שיכול להגיב לגירויים חיצוניים עם אנאיזוטרופיות מולקולרי מזמין ^{6, 7.} LCEs הם חומרי גירויים-היענות המשלבים את התכונות המכאניות אלסטי של אלסטומרים עם פונקציונליות האופטית והזמנה מולקולרית של גבישים נוזליים ^{8, 9.} LCEs יכול לחוות שינויים בכושר, עיוות מכאנית, התנהגות אלסטית, ואת תכונות אופטיות בתגובת Stim החיצוניUli (כלומר., חום, מתח, אור, וכו ') ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} מחקרים קודמים הראו כי גבישים נוזליים (LCS) יכולים לחוש את הצמיחה ואת הנטייה של תאים ^{4, 17.} יתכן ואז להניח LCEs עשוי להיות מתאים ליישומים ביולוגיים רפואיים רלוונטיים, כוללים תא פיגומים ויישור. דיווחנו בעבר בהכנת הסרטים ביולוגי, מתכלה, יצוק יצוק, ורזה LCEs smectic שמציעה "סוג שוויצרי-גבינה" מורפולוגיה נקבובית ^{6, 18.} גם הכנו LCEs הביולוגית Nematic עם מורפולוגיה כדורית כמו פיגומי צמיחת תאים ^{19 , 20. העבודה שלנו נועדה כוונון התכונות המכאניות של חומרים כדי להתאים לאל של הרקמה של עניין 21. כמו כן, מחקרים אלה מתמקדים בהבנת אינטראקציות תא אלסטומר, כמו גם תגובה תאית כאשר אלסטומרים כפופים גירויים חיצוניים.}

האתגרים העיקריים היו בחלקם להתאים את נקבוביות של LCEs כדי לאפשר התקשרות תא חלחול דרך המטריצה ​​אלסטומר ועבור להסעת המונים יותר. הנקבובי של שכבות דקות אלה ⁶ מותר חלחול תא דרך הארי של מטריקס, אבל לא כל הנקבוביות היו מחוברות באופן מלא או היה גודל הנקבוביות קבוע יותר (הומוגנית). אז דיווחנו לאלסטומרים LCE Nematic הביולוגיים עם מורפולוגיות כדוריות. אלסטומרים Nematic אלה שאפשרו את הקובץ המצורף ושגשוגם של תאים, אך הגודל הנקבובי נע רק 10-30 מיקרומטר, אשר מנע או הגבילו את השימוש הללואלסטומרים עם מגוון רחב יותר של שורות תאים ^{19, 20.}

עבודות קודמות של ואח קונג. בנוגע להיווצרות קצף גרפן באמצעות תבנית מתכת "הקרבה" הראה כי קצף גרפן שהיה מתקבל אילו מורפולוגיה נקבובית סדירה מאוד מוכתבת על ידי תבנית המתכת נבחרה ^22. מתודולוגיה זו מציעה שליטה מלאה על גודל הנקבובי הנקבובי. במקביל, הסגילות וגמישות של תבנית מתכת לאפשר היווצרות של תבנית שונה המעצב לפני הכנת קצף. טכניקות אחרות, כגון שטיפת חומר ^23, בניית תבנית גז ^24, או סיבים סובבים אלקטרו ^{25, 26} מציעות גם הפוטנציאל להכנת חומרים נקבוביים, אבל הם יותר זמן רב, במקרים מסוימים, את הגודל הנקבובי מוגבל רק כמה מיקרומטרים. קֶצֶף-כמו LCEs 3D מוכן באמצעות תבניות מתכת לאפשר עומס תא גבוה; שיעור התפשטות משופר; שיתוף culturing; ו, ואחרון אחרון חביב, ניהול תחבורה המונית טוב יותר (כלומר, מזינים, גזים, ופסולת) כדי להבטיח התפתחות מלאה רקמות ^27. קצף דמוי LCEs 3D להופיע גם לשפר יישור התא; זהו ככל הנראה ביחס תליוני LC חישת צמיחת תאים וכיוון תא. הנוכחות של moieties LC בתוך LCE מופיע כדי לשפר יישור התא ביחס למיקום התא בתוך הפיגום LCE. תאים ליישר בתוך תמוכות של LCE, בעוד שום אוריינטציה ברורה שנצפה בהם תמוכות להצטרף יחד (צמתים) ^27.

בסך הכל, פלטפורמת פיגום תא LCE שלנו כמדיום תמיכת תא מציעה הזדמנויות לכוון את מורפולוגיה אלסטומר ואת תכונות אלסטיות כדי במיוחד לכוון את היישור (בודדים) סוגי תאים ליצור הורה, סידורים מרחביים oF תא דומה למערכות חיים. מלבד מתן פיגום מסוגל לתמוך ולכוון לצמיחת תרבות תאים לטווח ארוך, LCEs גם לבצע ניסיונות דינמיים, שבו נטייה ואינטראקציות תא ניתן לשנות על לטוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: השלבים הבאים להכנת קצף דמוי LCE 3D באמצעות קופולימר לחסום כוכב 3-זרוע מוצגות באיור 1. עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) אפיון, ספקטרה נרשמות כלורופורם deuterated (CDCl ₃₎ בטמפרטורת החדר על מכשיר ברוקר DMX 400-MHz ו פנימי הפניה פסגות שיורי ב 7.26. התמר ספקטרום אינפרא אדום (FT-IR) נרשמים באמצעות ספקטרומטר Bruker וקטור 33 FT-IR באמצעות מצב החזרה הכולל מוחלש. לכל שלב של הפרוטוקול הבא, חשוב ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).

1. סינתזה של α-כלורו-ε-caprolactone (מונומר) (על פי נוהל באל ז'רום et. ²⁸⁾

1. לפני תחילת הסינתזה, לטהר 27 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic כדלקמן:
   1. בשנת 800 מ"ל של מים מזוקקים, להוסיף 1.28 גרם של נתרןמונוהידראט monobasic פוספט ו 8.24 גרם של heptahydrate dibasic פוספט נתרן. התאם את ה- pH 7.4 (באמצעות נתרן הידרוקסידי או חומצה הידרוכלורית) ושמור 30 מיליליטר של פתרון זה; זהו פתרון החיץ.
   2. באמצעות משפך separatory, לפזר חומצה 3-chloroperbenzoic ב 35 מ"ל של אתר diethyl. לשטוף את הפתרון אורגני עם 10 מ"ל של תמיסת חיץ (מוכן בשלב 1.1.1.). חזור על לשטוף שלוש פעמים.
   3. להוסיף 3 גרם של נתרן גופרתי ישירות הפתרון האורגני; סוכן ייבוש זה סופג מים מן הפתרון האורגני.
   4. סנן הפתרון להסיר את סוכן ייבוש. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
2. Solubilize 18.5 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic מטוהרים ב 150 מ"ל של dichloromethane יבש ידי ערבוב באמבטיה קולי; תהליך זה בדרך כלל לוקח 20 דקות. מניח את הפתרון בתוך משפך separatory.
3. בתוך בקבוק שני-צוואר, מסביב לתחתית,להתמוסס 13.1 גרם של 2-chlorocyclohexanone ב 15 מ"ל של dichloromethane יבש באמצעות בוחש מגנטי תחת גז חנקן. שמור בחישה.
4. התאימו את המשפך separatory המכיל פתרון חומצה 3-chloroperbenzoic (משלב 1.2) על הבקבוק שני-צוואר בשלב 1.3. לרוקן את המערכת עם גז חנקן. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך שפתרון חומצת chloroperbenzoic נופל dropwise לתוך פתרון 2-chlorocyclohexanone (1 טיפה בכל שנייה אחרת) וממשיך לבחוש את התערובת תחת גז חנקן עבור 96 h.
5. מצננים את תערובת התגובה ל- C ° -20 עבור 1 h כדי לזרז את חומצת מ -chlorobenzoic תוצר לוואי (מ -CBA).
6. סנן את החומצה מ -chlorobenzoic (-CBA מ ') ולשטוף את הפתרון נותר עם פתרונות רוויים של נתרן תיוסולפט, סודיום ביקרבונט, ומלח.
7. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. לטהר את לסבון נוזלי צהוב, צמיג חיוורid ידי זיקוק בלחץ מופחת ב 2.3 Torr ו 96 מעלות צלזיוס.
8. מעקב אחר הצליחו הסינתזה באמצעות פסגות ¹ H NMR הבא. ¹ H NMR (400 MHz, ₃ CDCl, [ppm] δ): 4.75-4.68 (מ ', 1H, C H ClCO), 4.37-4.26 (מ', 1H, C H ₂ O), 4.18-4.05 (מ ', 1H , O C H _2), ו 2.06-1.58 (מ ', 6 שעות, -C H ₂ -) ^{6, 27.}

2. סינתזה של α-שלושה זרוע קופולימר בלוק סטאר (SBC-αCl) על ידי copolymerization פתיחה רינג (שארמה et al. ⁶ ו Amsden et al. ²⁹⁾

1. לפני הסינתזה, silanize כמוסת 20 מ"ל במילויו פתרון 2% (v / v) של 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane ב טולואן ערבוב במשך כ 24 שעות. לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל ולייבש אותו על ידי הצבתו בתנור על 140 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
2. להוסיף 30.64 גרם של ε-caprolactone מזוקקים, 0.5 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 0.25 מ"ל של גליצרול כדי אמפולה. מערבבים בעזרת מערבולת עבור 1 דקות.
3. מוסיפים 4.90 גרם של D, L -lactide אל אמפולה ולטהר אותו עם חנקן. מניחים את אמפולה בתנור על 120 מעלות צלזיוס כדי להמיס את -lactide D, L; תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך 2 h. מערבבים שוב בעזרת מערבולת לוודא שכל התוכן הם גם מעורבים ולהוסיף 66 μL של פח (II) 2-ethylhexanoate (SN (אוקטובר) ₂₎ אל אמפולה.
   הערה: D, L -lactide יהיה להתקרר במהלך תהליך זה יהיה צורך מחדש מחומם בתנור להינמס.
4. בתוקף לערבב בפעם האחרונה באמצעות מערבולת ולשטוף עם חנקן.
5. סגור את אמפולה עם פקק גומי. מניח מחט המחוברת צינור ואקום (ריק הבית הוא בדרך כלל מספיק) באמצעות פקק הגומי. הפעילו את הוואקום, באמצעות להבה, להמיס את הצוואר הארוך של הזכוכית, מסובב לאט עד gנַעֲרָה מתמוטטת על עצמו. היזהר שלא להמיס את פקק גומי. לאחר אמפולה היא להבה-אטום, ולמקם אותו באמבט חול, תנור, או גוף חימום מתאים ב 140 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
6. קח את אמפולה ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר.
7. לשבור את האמפולה על הסימן האטום ו לפזר את הנוזל צמיג מאוד על ידי הוספת 10 מיליליטר של dichloromethane. עבר פתרון משפך separatory.
8. הכן בקבוק המכיל 100 מ"ל של מתנול קר (מקורר באמצעות אמבטיית קרח יבש / אצטון בטמפרטורה סביב -78 ° C). תקן את המשפך separatory (שלב 2.7) על גבי הבקבוק. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך כשתי טיפות נופלות כל (dropwise) השני אחר.
9. אסוף את המשקע הלבן על ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ומייבשים אותו בתנור ואקום בין C 50 ו 60 מעלות.
10. מעקב אחר הצלחת סינתזה באמצעות פסגות ¹ H NMR ו- FT-IR הבאים. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃, [Ppm] δ): 5.29-5.03 (מ ', COC H C H _3), 4.43-4.25 (מ', ג H Cl), 4.24-4.12 (m, O C H _2), 4.11-4.03 (t, J = 4.6 הרץ, C H ₂ O), 3.80-3.68 (מ ', ג H C H _2), 3.09-2.64 (רחבה, s, O H), 2.39 (t, J = 4.5 הרץ, H α-), 2.33 (t, J = 5.1 הרץ, H α-), ו 1.77-1.25 (מ ', ג H _2, C H _3); FT-IR (1 / λ [ס"מ ^-1]): 2932 (ים), 2869 (מ '), 1741 (ים), 961 (ים), 866, ו 735 (מ') ^{6, 27.}
    הערה: כדי להכין LCE 3D הידרופילי יותר, להכין קופולימר גוש ליניארי (LBC) במקום SBC, בעקבות copolymerization פתיחת הטבעת (ROP) ההליך המתואר לעיל.
    1. להוסיף 0.3 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG), 3.15 גרם ε-caprolactone, 1.0 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 5.0 גרם של D, L-lactide לתערובת בקבוקון silanized.

3. שינוי סינטטי של α-Cl-שלוש זרועות SBC כדי αN ₃ -Three זרוע SBC (SBC-αN ₃₎ (על פי שתרמה et al. ⁶⁾

1. בבקבוק מסביב לתחתית ותחת חנקן, לפזר 5 גרם של SBC-αCl ב 30 מ"ל של יבש N, -dimethylformamide "N.
2. מוסיפים 0.22 גרם של אזיד הנתרן ולאפשר להגיב הלילה בטמפרטורת החדר.
   זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל; ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
3. הסר את N, -dimethylformamide "N בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 11 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את תערובת ב 30 מ"ל של טולואן. צנטריפוגה הפתרון שלוש פעמים ב 2800 XG במשך 15 דקות כדי להסיר את המלח יצר. לאדות את טולואן בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 77 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
4. לעקוב אחר הצלחת ההחלפה תזיד באמצעות ¹ H NMR ופסגות FT-IR.
   הערה: ^{1 ספקטרום NMR H היה דומה להורה SBC-αCl, למעט ההופעה לשיא ב 3.90 ppm הקשורים לקבוצה תזיד; FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2928, 2108 (ים, אזיד), 1754 (ים), 1450 (ים), 960 (מ '), 865 (ים), 733 (s), ו 696 (M).}

4. סינתזה של cholesteryl 5-Hexynoate (LC מחצית) (על פי שארמה et al. ⁶ ו דונלדסון et al. ³⁰⁾

1. בבקבוק מסביב לתחתית, לערבב 3 גרם של חומצה 5-hexynoic ו 130 מ"ל של dichloromethane. מצננים 0 ° C באמצעות אמבט קרח.
2. בעוד בקבוק מסביב לתחתית, לערבב 8.28 גרם של N, -dicyclohexylcarbodiimide "N, 10.3 גרם של כולסטרול, ו 0.2 גרם של 4-dimethylaminopyridine.
3. העברת dropwise פתרון חומצה 5-hexynoic הבקבוק המכיל את תערובת הכולסטרול ולשמור את התערובת הסופית על 0 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
4. אפשר לתערובת להתחמם לטמפרטורת החדר למשך הלילה.
5. הסר את משקע dicyclohexylurea וכתוצאה ידי סינון באמצעות מסנן נייר כיתת 415 וזורק אותו.
6. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את שאריות שנאספו 150 מ"ל של הקסאן.
7. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 335 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 350 מ"ל של אתנול שאריות שמן כדי לאסוף את המוצר הסופי. שטוף את יצר מחוץ לבן מוצק עם אתנול ולייבש המוצר המוצק תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס.
8. צג את הסינתזה באמצעות פסגות ¹ H NMR ו- FT-IR הבאים. ¹ H NMR (400 MHz, ₃ CDCl, [ppm] δ): 5.39 (ד, י = הרץ 4.7, 1H, C H = C), 4.70-4.58 (מ ', 1H, C H OCO), 2.44 (t, J = 2.5 הרץ, 2H, C H ₂ CO), 2.34 (מ ', 2H, C H ₂ -C H =), 2.31 (מ', 2H, C H ₂ C H ₂ -COO), 2.28 (ים, 1H, HC≡C), 2.27 (ד, י = 2.3 הרץ, 2H, ≡CC H _2), 2.07-1.06 (מ ', 2H, ₂ C H, C H), 0.94 (ים, 3H, C H _3), 0.89 (ד, י = 1.8 הרץ, 3H, C H ₃ C H), ו 0.88 (ד, י = 1.8 הרץ, 6H, C H ₃ -C H), 0.67 (ים, 3H, C H _3). FT-IR (1 / λ [ס"מ ^-1]): 2,830-2,990 (רחבה השיא חזק), 2104 (מ '), 1695 (ים), 1428 (מ'), 1135 (מ '), 999 (ים), 798 (ים), ו 667 (ים).

5. שינוי סינטטי של α-N ₃ SBC זרוע -Three כדי אלפא-cholesteryl-שלוש זרועות SBC (SBC-αCLC) באמצעות תגובה תזיד-אלקין Huisgen סקל-כן ( "לחץ" תגובה) כדי להשיג SBC-צ'ול (פי שארמה et al. ⁶⁾

1. בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר 1 שווה טוחנת של ₃ SBC-αN (1.5 גרם) ב 100 מ"ל של tetrahydrofuran מזוקקים טרי (THF). להוסיף 1.2 equivalen טוחנתt של cholesteryl 5-hexynoate (1.94 גר '), 0.1 שווה ערך טוחן של הנחושת (I) יודיד (0.06 גרם), ו 0.1 מקבילה טוחנת של triethylamine (0.03 גר'). מערבבים את התערובת לילה בשעה 35 ° C תחת חנקן.
2. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 357 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
3. ממיסים את תערובת שיורית 80 מ"ל של dichloromethane צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 2800 XG בטמפרטורת החדר כדי להסיר חומרים unreacted ומוצרי לוואי.
4. צג את הסינתזה באמצעות פסגות ¹ H NMR ו- FT-IR הבאים. ¹ H NMR (400 MHz, ₃ CDCl, [ppm] δ): 7.54 (ים, CH = C-triazole), 5.43-5.34 (מ ', כולסטרול C = CH), 5.10-5.06 (מ', COCHCH _3), 4.68 -4.55 (m, O-CH כולסטרול), 4.24-4.19 (מ ', CH ₂ O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 הרץ, CH ₂ O), 4.11-4.05 (t, J = 4.4 הרץ, CH ₂ O), 2.47-2.41 (t, J = 4.9 הרץ, COCH _2), 2.31-2.25 (מ ', COCH _2), 2.07-1.02 (מ', CH ₂ , CH _3), 1.05-1.03 (ים, ₂ CH, CH _3), 0.96-0.92 (ד, י = 3.3 הרץ, ₂ CH, CH _3), 0.91-0.87 (dd, J = 1.9 הרץ, J = 1.8 הרץ, CH _3), ו 0.71-0.68 (ים, CH _3). FT-IR (1 / λ [ס"מ ^-1]): 3260 (ים), 2920 (ים), 1710 (ים), 1460 (ים), 1370 (ים), 1240 (מ '), 1190 (ים), 733 (ים), ו 668 (ים).

6. סינתזה של 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (crosslinker, BCP) (על פי גאו et al. ²⁷ ו Albertsson et al. ³¹⁾

1. בבקבוק מסביב לתחתית, להכין תמיסה המכילה 10.8 גרם של 2-BIS (4-הידרוקסי-cyclohexyl) פרופן 52 מ"ל של חומצה אצטית.
2. הכן תמיסה המכילה 11 גרם של trioxide כרום ב 50 מ"ל של חומצה אצטית ו 8 מ"ל של מים מזוקקים. הוספת dropwise פתרון זה הפתרון מוכן בשלב 6.1, תוך שמירה על טמפרטורת התערובת בין 17 לבין 20 ° C (למשל, בתוךאמבטיית מים); תהליך dropwise זה לוקח 2 h. לאחר השלמת התהליך, ולאפשר הפתרון ומערבבים במשך כ 30 דקות.
3. להוסיף 50 מ"ל של 2-פרופנול. מערבבים את הפתרון הלילה בטמפרטורת החדר.
4. תתרכז הפתרון הסגול הכהה בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 137 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 300 מ"ל מים מזוקקים כדי לזרז; המשקע צריך להיות אור סגול.
5. תסנין המוצר הגולמי באמצעות מסנן נייר כיתת 415. לשטוף את החומר המוצק עם ~ 250 מ"ל של מים מזוקקים או עד מוצק הופך לבן.
6. ממיסים את החומר המוצק ב 15 מ"ל של בנזן על 40 ° C ולתת לו recrystallize ב 25 מעלות צלזיוס.
7. מוסיפים 8.34 גרם של יבש diketone מומס dichloromethane יבש בתמיסה המכילה 6.0 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic ב 75 מ"ל של dichloromethane אל הבקבוק.
8. ריפלוקס הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
9. מצננים את התערובת התגובה -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לזרז את מ ' תוצר לוואי חומצת -chlorobenzoic.
10. הסר חומצה מ -chlorobenzoic ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ולרכז הפתרון בלחץ מופחת.
11. לשטוף את המוצר הגולמי ויסקוזה עם 200 מ"ל של 2-heptanone ולייבש המשקע תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
12. צג את הסינתזה באמצעות פסגות ¹ H NMR ו- FT-IR הבאים. ¹ H NMR (400 MHz, ₃ CDCl, [ppm] δ): 4.42-4.37 (dd, J = 14.2, 7.4 הרץ, 2H, C H ₂ OC = O), 4.21-4.15 (t, 2H, J = 11.3 הרץ, C H ₂ OC = O), 2.80-2.75 (DDT, J = 14.3, 6.5, 1.6 הרץ, 2H, COO C H _2), 2.63-2.57 (TT, J = 13.3, 2.1 הרץ, 2H, C H COO _2), 2.04-1.93 (M, 4H, -C H ₂ CH ₂ OC = O), 1.70-1.56 (מ ', 4H, -C H ₂ C H ₂ COO), 1.48-1.38 (מ', 2H, - C H C (CH _{3) 2),} ו 0.84 (ים, 6H, C H ₃ C-).

7. יצירת הפיגום אלסטומר 3D נקבובי שימוש או Hexamethylene diisocyanate (HDI) או 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (BCP) ²⁷ כפי crosslinkers (על פי גאו et al. ²⁷⁾

1. הכן תערובת אלסטומר תלת הזרוע באמצעות 0.75 גרם של SBC-αCLC ידי הוספת 0.25 מ"ל של HDI (או 0.45 מ"ל של BCP) ו 0.24 מ"ל של מונומר ε-caprolactone מזוקקים. להוסיף 60 μL של Sn (אוקטובר) _2. אם באמצעות BCP במקום HDI, לערבב SBC-αCLC ו BCP בעזרת מערבולת למקם אותם בתנור על 140 מעלות צלזיוס עד BCP מלא נמס ומתפוגג (שלב זה יכול להימשך עד 2 h). לאחר BCP כבר מומס, לקחת אותה מהתנור ו, את המספר הסידורי (אוקטובר) _2, ו מערבולת.
2. הכין תבנית קצף ניקל "הקרבה" על ידי חיתוך פיסת מתכת סנטימטר 1 x 4. מרדד אותו מאחד הקצוות הקצרים כך הרול הסופי היא כ פיסת מתכת 1 x 1 סנטימטר (ראה איור 4).
3. שים את קצף ניקל בתוך אריזת אלומיניום בקבוקון או אלומיניום זכוכית ויוצק את התערובת המוכנה בשלב 7.1 כדי לכסות את הקצף מלא עבור 2 דקות. הסר את התערובת העודפת עם pipet פסטר. עזוב את זה לכל הלילה בתנור על 80 מעלות צלזיוס.
4. לקלף את רדיד האלומיניום או לשבור את הכוס. באמצעות סכין גילוח, לגלח אלסטומר ברחבי קצף מתכת לחשוף את המתכת ניקל.
5. כן 1 ברזל M (III) כלוריד (FeCl ₃₎ פתרון 100 מ"ל מים. מניחים את הקצף בבקבוק ולהוסיף 70 מ"ל של תמיסת ₃ FeCl. מערבבים במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר ולשנות הפתרון FeCl ₃ כל יום. לפני כל שינוי, לעורר את הקצף עם מים מיוננים, 0.5 h.
   הערה: תהליך האיכול מושלם בדרך כלל לאחר שלושה ימים. כדי להבטיח כי תהליך האיכול יושלם, לבצע בדיקות דחיסת מישוש עד הקצף מרגיש רך. התנגדות קצף כדי בדיקות דחיסת מישוש מעידה על קיומו של תבנית מתכת שיורית.
6. יש לשטוף את Elastעומר קצף עם אתנול ומקום בחלל ריק בתנור הלילה בשעה 40 ° C.
7. לאפיין את החומרים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC), בדיקות דחיסת מכני, ו גרווימטריה תרמית (TGA) ^27.
   הערה: להכנת LCE 3D הידרופילי יותר, להחליף את SBC עם LBC (מוודא כי LBC מכיל גם מחצית LC) ביצוע השלבים המתוארים בשלב 7.5.

8. זריעה של הפיגום אלסטומר עם SH-SY5Y נוירובלסטומה תאים והתרבות שימוש בטכניקות סטריליות

1. לעקר את אלסטומר ידי שטיפה פעמיים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. בצעו קרינה UV במשך 10 דקות ולשטוף עם 1 מ"ל של אתנול 70%. יש לשטוף אותו פעמיים עם 1 מ"ל של מים סטריליים ו 1 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). מניחים את אלסטומרים צלחות תרבות 24-היטב.
2. הכן בינוני צמיחת תאים עבור-SY5Y SH המכיל 90% Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) supplemented עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין (עט-סטרפטוקוקוס).
3. לאחר ספירת תאים באמצעות hematocytometer, להכין 1.5 x 10 ⁵ תאים SH-SY5Y מושעה ב 100 μL של מדיום הגידול (פתרון זרע). מוסיפים את הפתרון על גבי אלסטומרים, והקפד ליצור ירידה.
4. דגירה אלסטומרים זורעים C 37 ° ו 5% CO ₂ עבור 2 h כדי לקדם את הידבקות התא. להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הגידול. דגירה שוב ב- C ° 37 עם 5% CO _2.
5. שינוי המדיום פעם ביומיים לאחר שטיפה עם 1 מ"ל של PBS.

9. הדמיה מיקרוסקופית של Construct אלסטומר

1. תקן את התאים גדלו לאלסטומרים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS עבור 15 דקות. לשטוף עם 3 מיליליטר של שלוש פעמים PBS עבור 5 דקות כל אחד והמקום אלסטומר עם התאים הקבועים בצלוחית-תרבית עם coverslip מצורפת.
   זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
2. Staבדגימות קבוע עם 0.1% של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 500 μL של PBS עבור 10 דקות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS עבור 5 דקות.
3. מייד תמונה אלסטומרים באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם קרינת DAPI, רכישת ערימות תמונה שמשתרעות המדגם.
   הערה: כאן, ערימות תמונה נרכשו באמצעות אובייקטיבי 20X ו 60X מטרה.
4. נתח את ערימות תמונת confocal האופטית באמצעות ImageJ ^32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דוח זה מציג את שיטת ההכנה של LCE 3D נקבובי כמו פיגום עבור תרבית תאים באמצעות תבנית מתכת ניקל. LCE 3D המתקבל מדגים רשת ערוץ ביניהם מורכבת המאפשרת חדירה לתא קל, כמו גם ²⁷ להסעת המונים מתאים יותר. נמצא כי תאים מסוגלים לחדור לרשת הערוץ המחוברת ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אלסטומרים גבישי נוזלים נחקרו לאחרונה כמו פיגומי תא ביולוגיים עקב היענות הגירויים שלהם. הם הוכחו להיות פלטפורמות אידיאליות כמו פיגומי תא. עם זאת, גורם חשוב לזכור בעת הכנה ועיצוב פיגום LCE חדש הוא נקבובי. השילוב של מוצקי leachable ²³ או גזים לא תמיד לגרום נקבוביו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000