3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

요약

본 연구는 3D, 생체 측쇄 액정 엘라스토머 (LCEs)에 기초한 생분해 성 발포 셀 형상 지지체를 제조하는 방법을 제공한다. 공 초점 현미경 실험은 거품 같은 LCEs가 세포 부착, 증식 및 C2C12s의 근육 모세포의 자연 정렬 할 수 있음을 보여준다.

초록

여기서는 3 차원, 생분해 성, 발포 셀 형상 지지체의 단계별 제조를 제시한다. 이러한 골격은 멕틱-A (SMA) 액정 엘라스토머 (LCEs) 결과, 측쇄 부속기로서 콜레스테롤을 갖춘 단위 성 블록 코 폴리머를 가교 결합하여 제조 하였다. 폼과 같은 골격은, 3 차원 세포 배양 지지체로 적합, 금속 템플릿을 이용하여 제조 상호 연결된 마이크로 채널이 있습니다. 금속 발포체의 종래 다공성 템플릿 필름이지만 질량 수송보다 잘 관리 (즉, 영양소, 가스 폐기물 비교뿐만 아니라 높은 세포 증식을 촉진하는 3 차원 세포 지지체의 엘라스토머 결과의 일반적인 구조의 결합 특성 등). 금속 템플릿의 특성상 거품 형상 (즉, 롤 또는 필름)의 간편한 조작을 가능하게하고 다른 세포 연구 다양한 기공 크기의 골격의 제조를위한 interconnec을 유지하면서템플릿의 테드 다공성 성격. 에칭 공정은 생체 적합성 및 생분해 성 특성을 보존, 엘라스토머의 화학적 성질에 영향을주지 않습니다. 우리는 세포의 성장과 증식을 촉진하면서 이러한 멕틱 LCEs는 광범위한 기간에 재배 할 때, 임상 적으로 복잡한 조직 구조의 연구를 수 있음을 보여준다.

서문

세포 연구 및 세포 부착 및 증식 ^{1, 2, 3, 4, 5,} 목표 조직 재생을위한 응용 프로그램을 위해 설계된 생물학적 생체 합성 재료의 몇 가지 예들이있다. ^{6,7 주문} 이방성 분자와 외부 자극에 응답 할 수있는 액정 엘라스토머 (LCEs)라고도 생체 적합성 재료의 몇 가지 예,가 있었다. LCEs 광학 기능과 액정 분자 ^{(8)의 순서, 9} 엘라스토머의 기계적 성질과 탄성 결합 자극에 반응하는 물질이다. LCEs 외부 STIM에 응답하여 형상 변화, 기계적 변형, 탄성 거동 및 광학 특성을 이용할 수울리 (예., 열 스트레스, 빛 등) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} 이전 연구는 액정 LCS (가) 세포 ^{(4), (17)의} 성장 방향을 감지 할 수 있음을 보여 주었다. LCEs 셀 목재 및 정렬을 포함한 생물학적으로 중요한 의학적 응용에 적합 할 수 있다고 가정하는 것이 가능하다. 우리는 이전에 "스위스 치즈 유형"다공성 형태 ^{6, 18을} 갖춘 스 멕틱 생체 적합성, 생분해 성, 주조 성형, 얇은 LCEs 필름의 준비를보고했다. 우리는 또한 세포 성장 ⁽¹⁹⁾ <위한 발판으로 구상 형태와 네마 틱 생체 적합성 LCEs 준비SUP> ^20. 우리의 작업은 관심 ^(21)의 조직과 일치하는 재료의 기계적 특성을 조정하기위한되었다. 또한,이 연구는 탄성 중합체 세포의 상호 작용뿐만 아니라 탄성 중합체가 외부 자극을받습니다 세포 반응을 이해에 초점을 맞 춥니 다.

주요 문제는 탄성 중합체 매트릭스를 통해 세포 부착 및 침투를 허용하는 LCEs의 공극률을 조정하는 부분에 더 잘 질량 운송 하였다. 이러한 박막 ^(6)의 다공성 매트릭스의 대부분을 통해 세포 투과 허용하지만, 모든 세공이 완전히 상호 연결된 기공했다 또는 (균질)보다 일정한 크기를 가졌다. 우리는 구상 형태학와 생체 적합성 네마 틱 LCE 탄성 중합체 보도했다. 이러한 네마 엘라스토머 부착 세포의 증식을 허용하지만, 기공 크기는 10-30 ㎛의 방지, 또는 원거리 단에서 이들의 사용을 제한세포주 ^{(19), (20)의} 폭 넓은 다양한 엘라스토머.

쿵푸 등의 알에 의해 이전 작업. 은 "희생"금속 템플릿을 이용하여 그래 핀 발포체의 형성에 관한 얻어진 그라 발포체 선택된 금속 주형 ^(22)에 의해 지시 매우 일정한 다공성 형태를 한 것으로 나타났다. 이 방법론은 기공과 기공 크기의 전체 제어를 제공합니다. 다른 템플릿의 형성 발포 조제 전에 모양을 동시에, 금속 템플릿의 가단성 및 유연성을 허용한다. 이러한 재료 침출 ²³ 가스 템플릿 ⁽²⁴⁾ 또는 전기 방사 섬유 ⁽²⁵⁾ 등의 다른 ^{기술은, (26)는} 다공질 재료의 제조 가능성을 제공하지만, 더 많은 시간이 어떤 경우에는 구멍 크기는 한정되어 걸리고이다 몇 마이크로 미터. 거품-like 3D LCEs 금속 템플릿 높은 셀 부하를 허용하여 제조; 개선 된 증식 속도; 공동 배양; 와, 적어도 마지막하지만, 더 나은 대중 교통 관리 (즉, 영양소, 가스, 폐기물)은 전체 조직 개발 ^(27)을 보장합니다. 폼 같은 3D LCEs 또한 셀 정렬을 개선하기 위해 표시; 이것은 세포 증식 및 세포 방향을 감지 LC 펜던트 관련된 대부분이다. LCE 내의 LC 잔기의 존재는 LCE 골격 내의 셀 위치에 대하여 셀의 정렬을 향상 보인다. 스트러트 함께 (접합부) ^(27)에 가입 여기서 명확한 방향은 관찰되지 동안 세포는 LCE의 스트러트 내에서 정렬.

전반적으로, 세포 지지체로서의 LCE 세포 골격 플랫폼 튜닝 엘라스토머 형태와 탄성 구체적 O 순서, 공간적인 배치를 만들 수 (개별) 세포 유형의 정렬을 지시하는이 기회를 제공한다생명체와 유사한 F 세포. 별개로 유지 장기 세포 성장 및 증식을 유도 할 수있는 발판을 제공하는 것을, 또한 셀 LCEs 방향 및 상호 작용을 실시간으로 수정 될 수 동적 실험을 허용한다.

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프로토콜

주 : 3 아암 스타 블록 공중 합체를 이용하여 3 차원 LCE 발포 형 제조를위한 다음 단계는도 1에 도시된다. 핵 자기 공명 (NMR) 특성의 경우, 스펙트럼은 브루 커 400 메가 헤르츠 DMX 악기에 실온에서 클로로포름 _(CDCl3 중)에 기록되고, 내부에 잔류 7.26 피크를 참조. 푸리에 약화 총 반사 모드를 이용하여 브루 커 벡터 33 FT-IR 분광기를 사용하여 기록 된 적외선 (FT-IR) 스펙트럼을 변환. 다음과 같은 프로토콜의 각 단계의 경우, 적절한 개인 보호 복 (PPE)를 착용하는 것이 중요하다.

α 클로로 ε 카프로 락톤의 합성 1. (모노머) (제롬 동부 등의 절차에 따라. ²⁸⁾

1. 다음과 같이 합성을 시작하기 전에, 3- 클로로과 산 27g을 정제 :
   1. 증류수 800 ml의 나트륨 1.28 g을 추가염기성 인산 수화물 및 인산 나트륨 이염의 수화물 8.24 g. 예약 및 용액 30 ㎖ (수산화 나트륨 또는 염산 사용) 7.4 pH를 조정한다; 이 완충 용액이다.
   2. 분리 깔때기를 사용하여, 디 에틸 에테르 35 ml에 3- 클로 로퍼 벤조산을 용해. 완충액 10 mL로 씻어 유기 용액 (단계 1.1.1에서 제조한다.). 세척을 세 번 반복합니다.
   3. 유기 용액을 직접 황산나트륨 3g을 추가; 이 건조제는 유기 용액에서 물을 흡수한다.
   4. 건조제를 제거 할 수있는 솔루션을 필터링합니다. 850 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 여액을 감압하에 농축시켰다.
2. 초음파 조에서 교반하여 건조 디클로로 메탄 150 mL의 정제 된 3- 클로 로퍼 아세트산 18.5 g을 용해; 이 프로세스는 일반적으로 20 분 걸린다. 분별 깔때기 안에서 용액을 놓는다.
3. 두 목 안쪽에, 둥근 ​​바닥 플라스크,질소하에 자기 교반기를 사용하여 건조 디클로로 메탄 15 mL에 2 chlorocyclohexanone 13.1 g을 용해. 교반하십시오.
4. 단계 130에서 두 목 플라스크에 (단계 1.2)에서 3- 클로 로퍼 산 용액을 포함하는 분별 깔때기를 장착한다. 질소 가스로 플러싱 시스템. 로퍼 벤조산 용액 2 chlorocyclohexanone 용액 (다른 모든 제 1 방울)로 적하 들도록 분액 깔때기의 개방을 조정하고 96 시간 동안 질소 하에서 교반을 계속한다.
5. M 개의 -chlorobenzoic 산 (분 -CBA) 부산물 침전을 1 시간 동안 -20 ℃로 반응 혼합물을 냉각.
6. M 개의 -chlorobenzoic 산 (분 -CBA)을 여과하고, 티오 황산나트륨, 중탄산 나트륨, 염화나트륨 포화 용액으로 남아있는 용액을 세척한다.
7. 850 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 감압하에 용매를 제거 하였다. 창백한 노란색 점성 액체 비누를 정화감소 2.3 토르의 압력과 96 ° C의 증류에 의해 ID.
8. 다음 ^{1 개} H NMR 피크를 이용하여 합성의 성공 여부를 감시한다. 의 ^1H NMR (400MHz, _CDCl3 중, δ [PPM]) : 4.75-4.68 (m, 1H, H ClCO C)는, 4.37-4.26 (m, 1H, C H ₂ O), 4.18-4.05 (m, 1H , C H ₂ O), 및 2.06-1.58 (m, 6H, H-C ₍₂₎ -) ^{(6), (27).}

2. 합성 α-세 아암 스타 블록 공중 합체 개환 공중합 (SBC-αCl) (샤르마 외. ^(6)과 외 Amsden. ²⁹⁾

1. 합성하기 전에, 톨루엔 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane 2 % (v / v)의 용액을 충전하고 24 시간 동안 교반하여 20 mL의 앰플을 silanization합니다. 이소 프로필 알콜로 헹구고 30 분 동안 140 ℃에서 오븐에 배치하여 건조.
2. 3 추가증류의 ε 카프로 락톤 0.64 g, α 클로로 ε 카프로 락톤 0.5 g 및 앰플 글리세롤 용액 0.25. 1 분 동안 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
3. 앰플에 4.90 g의 D, L의 -lactide 추가 및 질소로 퍼지. 는 D, L의 -lactide 용융, 120 ℃의 오븐에서 앰플 장소; 이 과정은 일반적으로 약 2 시간 소요됩니다. 모든 내용이 잘 혼합되어 있는지 확인하고 주석의 66 μL를 추가하는 소용돌이를 사용하여 다시 믹스 (II) 2- 에틸 헥사 노 에이트 (주석 OCT () ₂₎ 앰플합니다.
   참고 : D는 L의 -lactide이 과정에서 냉각되고 녹아 오븐에 다시 가열해야합니다.
4. 적극적으로 소용돌이를 사용하여 마지막으로 한 번 혼합하고 질소로 세척하십시오.
5. 고무 마개를 닫고 앰플. 진공 튜브에 연결된 바늘을 배치 고무 마개 (집 진공은 일반적으로 충분하다). g 때까지 천천히 비틀, 진공 켜고, 불꽃을 사용하여 유리의 긴 목을 녹여아가씨는 자체에 축소합니다. 고무 마개 용융하지 않도록주의하십시오. 앰플 불꽃 밀폐되면, 48 시간 동안 140 ° C에서 모래 욕, 오븐, 또는 적절한 가열 요소에 배치.
6. 앰플을 가지고는 실온에서 냉각 수 있습니다.
7. 밀폐 시점 앰플 브레이크 디클로로 메탄 10 ㎖를 첨가하여 점성이 높은 액체를 용해. 용액을 분리 깔때기에 옮긴다.
8. 냉 메탄올 100 mL를 함유하는 플라스크를 준비한다 (온도에서 드라이 아이스 / 아세톤 조를 사용하여 냉각을 약 -78 ° C). 플라스크의 상부에 분리 깔때기 (단계 270)를 고정한다. 약 2 방울마다 다른 제 (적하) 떨어지도록 분액 깔때기의 개구를 조정한다.
9. 여과에 의해 백색 침전물 (종이 필터를 사용하여)을 모아 50 ~ 60 ° C 사이의 진공 오븐에서 건조시킨다.
10. 다음 ¹ H NMR 및 FT-IR 피크를 이용하여 합성의 성공 여부를 감시한다. 의 ^1H NMR (400MHz, _CDCl3 중, δ [PPM]) : 5.29-5.03 (m, H COC C ₃ H), 4.43-4.25 (m, C H CL), 4.24-4.12 (m, J C H ₂ O), 4.11-4.03 (t, = 4.6 Hz로는, C H ₂ O), 3.80-3.68 (m, H C C H _2), 3.09-2.64는 (확장, 2.33) J = 4.5 ㎐, α- H, O H), 2.39 (t, s의 (t, J = 5.1 ㎐, α- H) 및 1.77-1.25 (m, C H _2, C ₍₃₎ H); FT-IR (1 / λ [cm ^-1]) : 2932 (S), 2869 (m), 1741 (S), 961 (S), 866, 735 (m) ^{(6), (27).}
    주의 : 전술 한 개환 공중합 (ROP) 절차에 따라,보다 친수성 차원 LCE 준비 대신 SBC의 선형 블록 공중 합체 (LBC)을 제조 하였다.
    1. 실란 바이알 혼합 L- 락 티드 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 3.15 g의 ε 카프로 락톤 0.3 g, α 클로로 ε 카프로 락톤 1.0 g 및 5.0 g의 D를 추가한다.

₃ - 셋 암 SBC (SBC-αN ₃₎ αN하는 α-CL-세 암 SBC 3. 합성 변형 (샤르마 외 방법. ⁶⁾

1. 둥근 바닥 플라스크에서, 질소 하에서 건조 N, N '디메틸 포름 아미드 30 mL에 SBC-αCl 5g을 용해.
2. 아 지드 화 나트륨 0.22 g을 첨가하고, 실온에서 밤새도록 반응 할 수있다.
   주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성; 적절한 개인 보호 복 (PPE)를 착용.
3. N 개의, 11 밀리바, 40 ℃에서 회전 증발기로 감압 N '디메틸 포름 아미드를 제거한다. 톨루엔 30 mL에 녹인 혼합물. 형성되는 염을 제거하기 위해 15 분 동안 2,800 회 XG에 용액을 원심 분리기. 77 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 감압하에 톨루엔을 증발시켰다.
4. ¹ H NMR 및 FT-IR 피크를 사용하여 아 지드 치환의 성공 여부를 감시한다.
   노트: ^{1 H NMR 스펙트럼은, 아 지드 그룹과 관련 3.90 ppm에서 피크의 출현을 제외한 상위 SBC-αCl 유사하다; FT-IR (1 / λ [cm -1]) : 2928, 2108 (S, 아 지드), 1754 (S), 1450 (S), 960 (m), 865 (S), 733 (S), 및 696 (엠).}

(4) 콜레 스테 릴의 합성 5- Hexynoate (LC 부분) (샤르마 외. ⁶ 도날드슨 외 방법. ³⁰⁾

1. 둥근 바닥 플라스크에 3,5- hexynoic 산 3 g을 디클로로 메탄 130 mL를 섞는다. 0 ° C에 차가운 얼음 목욕을 사용.
2. 다른 둥근 바닥 플라스크에, N, N '-dicyclohexylcarbodiimide의 8.28 g, 콜레스테롤 10.3 g, 4- 디메틸 아미노 피리딘 0.2 g을 혼합한다.
3. 1 시간 동안 0 ° C에서 최종 혼합물을 콜레스테롤 혼합물을 함유하는 플라스크에 5 hexynoic 아세트산 용액 적하 전송하고 유지한다.
4. 혼합물이 하룻밤 실온으로 예열합니다.
5. 등급 415 종이 필터를 사용하여 여과하여 결과 디시 클로 헥실 우레아의 침전물을 제거하고 폐기합니다.
6. 850 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 여액을 감압하에 농축시켰다. 헥산 150 ㎖에서 수집 된 잔여 물을 용해.
7. 335 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 최종 생성물을 수집하는 유상 잔사에 에탄올 350 mL를 넣고. 씻고 회백색 에탄올로 형성하고, 50 ℃에서 진공하에 건조하여 고체 생성물 고체.
8. 다음 ¹ H NMR 및 FT-IR 피크를 사용하여 합성을 모니터링한다. 의 ^1H NMR (400MHz, _CDCl3 중, δ [PPM]) : 5.39 (d, J = 4.7 ㎐, 1H, H C = C), 4.70-4.58 (m, 1H, C H OCO), 2.44 (t, J = 2.5 ㎐, 2H, C H ₂ CO), 2.34 (m, 2H, C ₂ -C H = H), 2.31 (m, 2H, C H ₂ C의 H ₂ -COO), 2.28 (S, 1H, HC≡C), 2.27 (d, J = 2.3 ㎐, 2H, H ≡CC _2), 2.07-1.06 (m, 2H, C H ₂ C H), 0.94 (S, 3H, C ₃ H), 0.89 (d, J = 1.8 ㎐, 3H, C C H ₃ H), 0.88 (d, J = 1.8 ㎐, 6H, C ₃ H -C H), 0.67 (S, 3H, C ₃ H). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]) : 2,830-2,990 (넓고 강한 피크), 2104 (m), 1695 (S), 1428 (m), 1135 (m), 999 (S), 798 (S), 667 (S).

5. 합성 변형 α-N ₃ - 셋 암 SBC는 알파 - 콜레 스테 쓰리 팔 SBC 아 지드 - 알킨 Huisgen 시클로 부가 반응을 통해 (SBC-αCLC) ( "클릭"반응)이 상기 (SBC-Chol을 구하는 할 샤마 등. ⁶⁾

1. 둥근 바닥 플라스크에서, 갓 증류 된 테트라 히드로 푸란 100 ㎖ (THF)에서 SBC-αN ₍₃₎ (1.5 g)의 1 몰 당량을 용해. 1.2 몰 equivalen 추가콜레 스테 hexynoate 5 (1.94 g), 구리 (I) 0.1 몰 당량의 요오다 이드 (0.06 g)을 t, 및 트리 에틸 아민 0.1 몰 당량 (0.03 g). 밤새 질소하에 35 ℃에서 혼합물을 교반한다.
2. 357 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 용매를 감압 하에서 증발시켰다.
3. 미 반응 물질 및 부산물을 제거하여 실온에서 2,800 XG에서 5 분 동안 디클로로 메탄 및 80 mL의 원심 잔류 혼합물을 용해.
4. 다음 ¹ H NMR 및 FT-IR 피크를 사용하여 합성을 모니터링한다. 의 ^1H NMR (400MHz, _CDCl3 중, δ [PPM]) : 7.54 (S, CH = C 트리아 졸), 5.43-5.34 (m, CH = C 콜레스테롤), 5.10-5.06 (m, COCHCH _3), 4.68 -4.55 (m, O-CH 콜레스테롤), 4.24-4.19 (m, CH ₂ O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 ㎐, CH ₂ O), 4.11-4.05 (t, J = 4.4 ㎐, CH ₂ O), 2.47-2.41 (t, J = 4.9 ㎐, COCH _2), 2.31-2.25 (m, ₂ COCH), 2.07-1.02 (m, CH ₂ , CH _3), 1.05-1.03 (S, CH ₂ CH _3), 0.96-0.92 (d, J = 3.3 ㎐, CH ₂ CH _3), 0.91-0.87 (DD, J = 1.9 ㎐, J = 1.8 ㎐, CH _3), 및 0.71-0.68 (S, CH _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]) : 3260 (S), 2920 (S), 1710 (S), 1460 (S), 1370 (S), 1240 (m), 1190 (S), (733) (S), 및 668 (S).

2,2- 비스 (1- 카프로 락톤 -4- 일) 프로판 (가교제 BCP)의 합성 (6) (가오 등. ²⁷ Albertsson 외 방법. ³¹⁾

1. 둥근 바닥 플라스크에, 2- 비스 (4- 히드 록시 시클로 헥실) 프로판 및 아세트산 52 mL를 10.8 g을 함유하는 용액을 제조 하였다.
2. 아세트산 50 ㎖의 증류수 8 ml에 삼산화 크롬 11g을 함유하는 용액을 제조 하였다. (A)에, 예 17 및 20 °의 C (의 혼합물을 온도를 유지하면서, 단계 6.1에서 제조 한 용액을 상기 용액에 적가욕조); 이 적하 공정은 2 시간 걸린다. 프로세스가 완료되면,이 솔루션은 약 30 분 동안 저어 수 있습니다.
3. 2- 프로판올의 50 ML을 추가합니다. 실온에서 밤새 교반 용액.
4. 137 mbar에서, 40 ℃에서 회전 증발기를 이용하여 감압하에 어두운 자주색 용액을 농축시킨다. 침전을 증류수 300 mL를 넣고; 침전물은 보라색 빛이어야한다.
5. 등급 415 종이 필터를 사용하여 조 생성물을 여과. 증류수 ~ 250 mL로 또는 고체가 백색이 될 때까지 고체 물질을 세척한다.
6. 40 ° C에서 15 ㎖의 벤젠에 고체 물질을 용해시키고,이를 25 ℃에서 재결정하자.
7. 건조 디클로로 메탄 플라스크에 디클로로 메탄 75 ml에 3- 클로 로퍼 산 6.0 g을 함유하는 용액에 용해시킨 건조 디케의 8.34 g을 추가한다.
8. 24 시간 동안 40 ° C에서 상기 용액을 환류시켰다.
9. M 개를 침전을 10 분 동안 -20 ℃ 반응 혼합물을 냉각시키고 -chlorobenzoic 산 부산물.
10. (종이 필터를 사용하여)을 여과 m -chlorobenzoic 산을 제거하고, 감압하에 용액을 농축시켰다.
11. 2- 헵탄 200 mL로 비스코스 조질 생성물을 세척하고 밤새 50 ℃에서 진공 건조 침전.
12. 다음 ¹ H NMR 및 FT-IR 피크를 사용하여 합성을 모니터링한다. 의 ^1H NMR (400MHz, _CDCl3 중, δ [PPM]) : 4.42-4.37 (DD, J = 14.2, 7.4 ㎐, 2H, C H ₂ OC = O), 4.21-4.15 (t, 2H, J = 11.3 ㎐, C H ₂ OC = O), 2.80-2.75 (DDT, J = 14.3, 6.5, 1.6 ㎐, 2H, C H ₂ COO), 2.63-2.57 (TT, J = 13.3, 2.1 ㎐, 2H, C H ₂ COO), 2.04-1.93 (M, 4H, CH ₂ -C H ₂ OC = O), 1.70-1.56 (m, 4H, H-C ₂ H ₂ C의 COO), 1.48-1.38 (m, 2H, - C H C (CH _{3) 2),} 0.84 (S, 6H, C H ₃ C-).

헥사 메틸렌 디 이소시아네이트 (HDI), 또는 2,2- 비스 (1- 카프로 락톤 -4- 일) 프로판 (BCP) ^(27)를 사용하여 3 차원 다공성 엘라스토머 발판의 제 작성 가교제 (가오에 따르면, 외. ²⁷⁾ 등

1. 세 아암 엘라스토머 HDI 0.25 ㎖ (또는 BCP 0.45 ml)에 첨가하여 SBC-αCLC 0.75 g을 사용하여 혼합물을 증류 ε 카프로 락톤 단량체의 0.24 mL의 준비. 주석 OCT () ₍₂₎ 60 μL를 추가합니다. (이 단계는 2 시간까지 걸릴 수 있습니다) 대신 HDI의 BCP를 사용하는 경우, 소용돌이를 사용하여 SBC-αCLC와 BCP를 혼합하고, BCP가 완전히 녹아 녹을 때까지 140 ℃의 오븐에 배치합니다. BCP에 용해 된 후, Sn의 OCT () _2, 소용돌이를 오븐에서 꺼내와.
2. 1 X 4cm 금속편 절단하여 "희생"니켈 폼 템플릿을 준비한다. 최종 롤은 1 × 1cm 금속편 약되도록 짧은 단부 중 하나에서의 롤 (도 4 참조).
<리> 충분히 2 분 동안 거품을 덮는 단계 7.1에서 제조 한 혼합물을 유리 바이알을 알루미늄 호일 팩에서 니켈 폼을 넣고 붓는다. 파스퇴르 피펫과 초과 혼합물을 제거합니다. 80 ° C의 오븐 하룻밤에 둡니다.
3. 알루미늄 호일을 벗겨 또는 유리를 깰. 면도날을 사용하여, 니켈 금속을 노출시키는 금속 발포체 엘라스토머 주위 면도.
4. 1 M 철 (III) 클로라이드 (50ml을 ₃₎ 물 100 ㎖의 용액을 제조 하였다. 플라스크 내에서 발포체를 놓고 _50ml을 용액 70 mL를 넣고. 실온에서 사흘 동안 저어 매일 _50ml을 솔루션을 변경합니다. 각 변경하기 전에 0.5 시간 동안 이온수 발포체 교반한다.
   참고 : 식각 공정은 일반적으로 3 일 후에 완료됩니다. 발포체가 부드러운 느낌까지 에칭 처리가 완료되도록, 촉각 압축 시험을 수행한다. 촉각 압축 시험에 반발 저항이 잔류 금속 템플릿의 존재를 나타낸다.
5. ELAST를 씻어오븐에서 밤새 40 ℃에서 진공에서 에탄올과 장소 오메르 발포체.
6. 주사 전자 현미경 (SEM), 시차 주사 열량계 (DSC), 기계 압축비 시험 및 열 중량 측정 분석 (TGA) ^(27)를 사용하여 물질을 특성화.
   참고 : 더 친수성 차원 LCE 제조, LBC 단계 7.5에 설명 된 단계를 수행합니다 (LBC는 또한 LC 부분이 포함되어 있는지 확인하는)으로 SBC를 교체합니다.

무균 기술을 사용하여 8 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포와 엘라스토머 비계의 시드와 문화

1. 70 % 에탄올 1 ml로 두번 세척하여 엘라스토머 멸균. 10 분간 UV 조사를 수행하여, 70 % 에탄올 1 ml로 세척 하였다. 멸균 수 1 ㎖ 및 인산 완충 생리 식염수 1 ㎖ (PBS)로 두 번 씻어. 24 웰 배양 플레이트에 엘라스토머를 놓습니다.
2. 90 % 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 함유 supplem SH-SY5Y 세포를위한 성장 배지를 준비10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - (펜 연쇄상 구균)와 ented.
3. hematocytometer를 이용하여 세포를 수를 계산 한 결과, 성장 배지 100 μL (시드 용액)에 현탁하고 1.5 × ¹⁰⁵ SH-SY5Y 세포를 준비한다. 한 방울을 형성해야하고, 엘라스토머의 상단에 솔루션을 추가합니다.
4. 세포 부착을 촉진하기 위해 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO _2에서 인큐베이션 시드 엘라스토머. 성장 매체의 0.5 ML을 추가합니다. 5 % CO _2와 37 ℃에서 다시 인큐베이션.
5. PBS 1 ml로 세척 한 후, 배지를 격일로 변경.

엘라스토머 구조의 9 현미경 이미징

1. 15 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 엘라스토머에 성장 된 세포를 고정한다. 5 분마다 3 회 PBS 3 mL로 세척하여 부착 된 커버 슬립으로 배양 접시에 고정 세포와 엘라스토머를 배치했다.
   주의 : PFA는 독성이다. 적절한 개인 보호 복 (PPE)를 착용 할 것.
2. 역10 분 동안 PBS 중 500 μL의 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 0.1 %로 고정 된 샘플에서 5 분 동안 두번 PBS 1 ㎖로 세정.
3. 샘플에 걸쳐 화상 스택을 획득 DAPI와 형광 공 촛점 현미경을 사용하여 즉시 이미지 엘라스토머.
   참고 : 여기 이미지 스택은 20 배 목표와 60X 목표를 사용하여 인수했다.
4. ImageJ에 ^32을 사용하여 광학 공 촛점 이미지 분석 스택.

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결과

이 보고서는 니켈 템플릿을 사용하는 세포 배양 용 지지체로서 다공성 3 차원 LCE의 제조 방법을 도시한다. 얻어진 3D LCE는 쉽게 세포의 침윤을 허용 복잡한 상호 채널 네트워크뿐만 아니라 더 적합 질량 수송 ^(27)를 보여줍니다. 그것은 세포가 완전히 상호 연결된 채널 네트워크에 침투 할 수 있고 또한 LCE 내에서 정렬 할 수있는 것을 알 수 있었다. 여기서,...

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토론

액정 탄성체는 최근 인해 자극에 응답에 생체 세포 골격으로 연구되어왔다. 그들은 세포 골격으로 이상적인 플랫폼으로 입증되었다. 그러나 준비하고 새로운 LCE 발판을 설계 할 때 염두에 두어야 할 중요한 요소는 다공성이다. 침출 고체 ⁽²³⁾ 또는 가스의 도입은 항상 균일 한 다공성 또는 완전히 상호 모공 발생하지 않습니다. 식각 할 수있는 금속 템플릿의 사용뿐만 아니라보다...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000