3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Özet

Bu çalışma, 3D, biyo-uyumlu yan zincir sıvı kristal elastomerler (LCEs) göre biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskeleleri hazırlanması için bir yöntem sunar. Konfokal mikroskopi deneyleri köpüğümsü LCEs hücre eki, proliferasyon ve C2C12s miyoblastların kendiliğinden uyum sağlamak olduğunu göstermektedir.

Özet

Burada, bir 3D, biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskelesi bir adım adım hazırlanmasını sunmaktadır. Bu iskeleleri Smektik-A (SmA), sıvı kristal elastomerler (LCEs) 'de elde edilen, yan zincire asılı gruplar halinde kolesterol birimleri içeren yıldız blok ko-polimerler çapraz bağlama ile hazırlanmıştır. Köpük gibi iskeleleri, 3D hücre kültür yapı iskeleti olarak kullanılmasını uygun hale metal şablonları kullanılarak hazırlandı birbirine mikrokanallar bulunmaktadır. Metal köpük ve geleneksel gözenekli şablonu filmler, ancak kitlesel taşıma aynı zamanda daha iyi yönetimi (örneğin, besin maddeleri, gaz, atık ile karşılaştırıldığında yalnızca yüksek hücre çoğalmasını teşvik eden bir 3D cep iskele elastomer sonuç normal yapının birleşik özellikleri vb.) Metal şablon doğası köpük şekillerde (örneğin, rulo veya film) kolayca müdahale edilebilmesini sağlar ve farklı hücre çalışmaları için farklı gözenek boyutlarının ıskelesının interconnec koruyarakşablonun ted gözenekli doğası. Dağlama işlemi, bunların biyolojik olarak uyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilir doğa koruma, elastomerlerin kimyası etkilemez. Biz hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını teşvik ederken bu smektik LCEs, geniş süreler boyunca büyüyünce klinik açıdan ve karmaşık doku yapıları çalışma sağlar göstermektedir.

Giriş

Hücre çalışmalarında ve hücre bağlanması ve ^{yayılması, 1, 2, 3, 4, 5} amaçlayan doku rejenerasyonu için bir uygulama için tasarlanmış biyolojik ve biyolojik olarak uyumlu sentetik malzemelerin çeşitli örnekler vardır. ^{6, 7} sipariş moleküler anizotropik harici uyaranlara yanıt olabilir sıvı kristal elastomerler (LCEs) olarak bilinen biyolojik olarak uyumlu malzemelerden birkaç örnek, olmuştur. LCEs optik özelliklerin ve sıvı kristal ⁸ moleküler ^{sipariş, 9} elastomerlerin mekanik ve elastik özellikler kombine uyaranlara yanıt veren malzemelerdir. LCEs dış stimülasyonu yanıt olarak şekil değişiklikleri, mekanik deformasyon, elastik davranış ve optik özellikleri karşılaşabiliruli (yani., ısı, gerilim, ışık, vs.), ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Daha önce yapılan çalışmalar, sıvı kristaller (LCS) hücre ^{4, 17} büyümesini ve yönünü duyu göstermiştir. LCEs hücre iskele ve hizalama gibi biyolojik ve tıbbi açıdan alakalı uygulamalar için uygun olabileceğini varsaymak mümkündür. Daha önce, bir "Swiss-peynir türü" gözenekli morfolojiyi ^{6, 18} sahip smektik biyolojik olarak uyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen, döküm kalıplı ve ince LCEs filmlerin hazırlanmasını bildirmektedir. Ayrıca, hücre büyümesi ¹⁹ , ^20. Çalışmalarımız ilgi ^21'in dokusunun içine alacak şekilde malzemelerin mekanik özelliklerinin ayar hedeflendi. Ayrıca, bu çalışmalar elastomer hücre etkileşimleri yanı sıra elastomerler dış uyaranlara maruz hücresel yanıtı anlamak odaklanır.

temel zorluklar elastomer matrisi yoluyla hücre bağlanması ve nüfuz imkan vermek için LCEs gözenekliliğini uygun hale kısmen ve daha iyi kütle transportuna yönelik idi. Bu ince filmler ⁶ gözenekliliği matrisin kütlesi boyunca hücre geçirgenliği için izin verilir, ancak tüm gözenekler tamamen birbirine bağlandığı veya gözenek (homojen) daha düzenli boyutu vardı. Sonra küresel morfolojileri ile biyouyumlu nematik LCE elastomerler bildirildi. Bu nematik elastomerler bağlanma ve hücre proliferasyonu için izin verilir, ancak gözenek boyutu önlenir 10-30 um, sadece değişmektedir veya bunların kullanımı sınırlıdırhücre çizgileri ^{19, 20} daha geniş bir çeşitliliği ile elastomerler.

Kung ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir "gözden çıkarılabilir" Metal şablonu kullanılarak grafin köpüklerin oluşumuna ilişkin elde edilen grafin köpük seçilen metal şablon ²² tarafından dikte çok düzenli bir gözenekli morfolojiyi sahip olduğunu göstermiştir. Bu metodoloji gözeneklilik ve gözenek boyutu tam kontrol sunuyor. Farklı şablon oluşumu, köpük hazırlama öncesinde şekiller aynı zamanda, bir metal şablon yumuşaklık ve esneklik sağlar. Bu malzeme süzme ^23, gaz çiftleşmiş ²⁴ veya elektro-eğrilmiş elyaflar ²⁵ gibi diğer ^{teknikler, 26} aynı zamanda gözenekli malzemelerin hazırlanması için bir potansiyel sunmaktadır, ancak daha fazla zaman, bazı durumlarda, gözenek boyutu ile sınırlıdır, alıcı ve vardır sadece birkaç mikrometre. Köpük-benzeri 3D LCEs metal şablonları daha yüksek bir hücre yükü için izin kullanılarak hazırlandı; geliştirilmiş bir proliferasyon hızı; eş-kültürleme; ve, son olarak değil, daha iyi toplu taşıma yönetimi (yani besin, gazlar ve atık) tam doku gelişimini ²⁷ sağlamak için. Köpük gibi 3B LCEs hücre uyumu geliştirmek için görünür; Bu hücre büyümesi ve hücre yönünü algılayacak LC kolye göre çok muhtemeldir. LCE içinde LC kısımların varlığı LCE iskele içinde hücre konumu ile ilgili olarak, hücre hizalama artırmaktadır. Dikmeler, birlikte (birleşme) ²⁷ birleştiği yerde açık bir yönlendirme gözlenirken hücreler, LCE direklerinden içinde hizalamak.

Genel olarak, bir hücre destek ortamı olarak LCE hücre iskeleti platformu ayarlamak için bir elastomer morfolojisi ve elastik özellikleri ve özellikle de o sıralı, uzamsal düzenlemeleri oluşturmak için (bireysel) hücre tipleri hizalanmasını yönlendirmek için fırsatlar sunaryaşayan sistemlere benzer f hücreleri. Yanı sıra sürdürülmesi ve uzun süreli hücre büyümesini ve üremesini yönlendirebilen bir iskele sağlamasının, LCEs hücre yönlendirme ve etkileşimler anında değiştirilebilir dinamik deneyler, izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: 3-kollu yıldız blok kopolimeri kullanılarak 3D LCE köpük benzeri hazırlanması için, aşağıdaki aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) karakterizasyonu için, spektrumları bir Bruker DMX 400 MHz aleti üzerinde oda sıcaklığında dötoryumlanmış kloroform _(CDCI3) kaydedilir ve içten 7.26 kalıntı tepeleri referans. Fourier zayıflatılmış toplam yansıma modu kullanılarak bir Bruker Vektör 33 FT-IR spektrometresi kullanılarak kaydedilmiştir enfraruj (FT-IR) spektrumları dönüşümü. Aşağıdaki protokolün her adım için, uygun kişisel koruyucu giysiler (PPE) giymek önemlidir.

Α-kloro-ε-kaprolakton 1. N- (monomer) (Jerome et al prosedüre göre. ²⁸⁾

1. aşağıdaki gibi sentez başlamadan önce, 3-kloroperbenzoik asit 27 g saflaştırmak:
   1. damıtılmış su, 800 mL'lik, sodyum 1.28 g eklemefosfat monobazik monohidrat ve sodyum fosfat dibazik heptahidrat 8.24 g. ve rezerv Bu çözeltiye 30 mL (sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak) pH'ı 7.4'e ayarlayın; Bu tampon çözümdür.
   2. bir ayırma hunisi kullanılarak, dietil eter ve 35 ml 3-kloroperbenzoik asit çözülür. tampon çözeltisi 10 mL organik çözelti yıkayın (aşama 1.1.1 hazırlanmıştır.). yıkayınız üç kez tekrarlayın.
   3. Organik çözelti, doğrudan, sodyum sülfat, 3 g ekleyin; Bu kurutma maddesi, organik çözelti su emer.
   4. Kurutma maddesinin çıkarılması için solüsyon filtre. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir.
2. bir ultrasonik banyo içinde karıştırıldı, kuru 150 mL diklorometan içinde saflaştırılmış 3-kloroperbenzoik asit 18.5 g çözündürülmesi; Bu işlem tipik olarak 20 dakika sürer. bir ayırma hunisine içinde çözelti yerleştirin.
3. İki boyunlu içinde, yuvarlak dipli bir reaksiyon kabı,azot gazı altında, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, kuru diklorometan, 15 mL 2-klorosikloheksanon 13.1 g çözülür. karıştırmaya devam edin.
4. Adım 1.3'te iki boyunlu bir şişeye (adım 1.2 den), 3-kloroperbenzoik asit çözeltisi ihtiva eden ayırıcı bir huni monte edin. Azot gazı ile sistem yıkayın. kloroperbenzoik asit çözeltisi 2-klorosikloheksanon çözeltisi (saniyede bir 1 damla) içine damla damla düşecek şekilde bir ayırma hunisine açılmasını ayarlamak ve 96 saat boyunca azot gazı altında karıştırmaya devam edin.
5. M-klorobenzoik asit (m -CBA) yan ürünü çökeltmek için 1 saat boyunca -20 ° C'ye kadar, reaksiyon karışımı soğutulur.
6. M-klorobenzoik asit (m -CBA) süzülür ve sodyum tiyosülfat, sodyum bikarbonat ve doymuş sodyum klorür çözeltileri ile kalan çözelti yıkayın.
7. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. Soluk sarı renkli, kıvamlı LIQU saflaştınlırindirgenmiş 2.3 Torr'da basınç ve 96 ° C altında damıtılarak kimliği.
8. Aşağıdaki ^1H NMR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4.75-4.68 (m, 1 H, CH CICO), 4,37-4,26 (m, 1 H, _Cı-H2O), 4,18-4,05 (m, 1 H C _H2O) ve 2,06-1,58 (m, 6H, C _H2 -) ^{6, 27.}

2. Sentez α-üç kollu yıldız Blok Kopolimer Halka Açma Kopolimerizasyonu ile (SBC-αCl) (Sharma ve diğ. ⁶ ve Amsden ve ark. ²⁹⁾

1. sentezi önce, toluen 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane bir% 2 (v / v) solüsyonu ile doldurulması ve yaklaşık 24 saat boyunca karıştırma ile 20 ml ampul Silanize. izopropil alkol ile durulanır ve 30 dakika boyunca 140 ° C'de bir fırında yerleştirerek kurutun.
2. 3 ekledamıtılmış ε-kaprolakton .64 gr, α-kloro-ε-kaprolakton 0.5 g, ve ampul gliserolün 0.25 mL. 1 dakika süre ile bir vorteks ile karıştırın.
3. Ampule D 4.90 g L -lactide ekleyin ve nitrojen ile temizleyin. D, L -lactide eritmek için 120 ° C de bir fırında ampul yerleştirin; Bu işlem tipik olarak yaklaşık 2 saat sürer. Bütün içerikler iyice karışmış olduğundan emin olun ve kalay 66 mcL eklemek için bir girdap kullanarak tekrar karıştırın (II) 2-etilheksanoat (Sn (Ekim) ₂₎ ampule.
   Not: D, L -lactide bu işlem sırasında soğuyacak ve erimeye fırında yeniden ısıtılması gerekmektedir.
4. Şiddetle vorteks ile son bir kez karıştırın ve nitrojen ile yıkayın.
5. Bir lastik tıpa ile ampulü kapatın. bir vakum borusuna bağlı bir iğne yerleştirin kauçuk tıpa ile (ev vakumu genellikle yeterlidir). g kadar yavaşça bükerek, vakum açın ve bir alev kullanılarak, uzun cam boyun erimelass kendi üzerine çöker. lastik tıpa eritmek için dikkatli olun. ampul alev sızdırmaz sonra, 48 saat boyunca 140 ° C'de, bir kum banyosu, bir fırın ya da uygun bir ısıtıcı eleman yerleştirin.
6. ampul çıkarıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
7. sızdırmaz gösterirken ampulü kırmak ve 10 mL diklorometan ilave edilerek son derece yapışkan bir likit çözülür. bir ayırma hunisi çözüm aktarın.
8. Soğuk 100 mL metanol ihtiva eden bir şişe, hazırlama (bir sıcaklıkta, bir kuru buz / aseton banyosu ile soğutulmuş, yaklaşık -78 ° C). Şişenin üzerine ayırıcı bir huni (aşama 2,7) sabitleyin. iki damla saniyede bir (damla damla) kalacak şekilde ayrı bir huniye açılmasını ayarlayın.
9. süzme ile beyaz bir çökelti (kağıt filtre kullanılarak) toplayın ve 50 ve 60 ° C arasında bir vakumlu fırın içinde kurutun.
10. Aşağıdaki ^1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC, H _CH3), 4.43-4.25 (m, Cı-HCl), 4,24-4,12 (m, J, C _H2O), 4,11-4,03 (t, = 4.6 Hz, CH ₂ O), 3.80-3.68 (m, CH CH _2), 3,09-2,64 (geniş, 2.33), J = 4.5 Hz, α-, H, OH), 2.39 (t, s, (t, J = 5.1 Hz, α- H) ve 1,77-1,25 (m, _{Cı-H2, CH3);} FT-IR (1 / λ ^[cm-1]): 2932 (s), 2.869 (m), 1.741 (s), 961 (s), 866, ve 735 (m), ^{6, 27.}
    Not: Yukarıda tarif edilen halka açma kopolimerizasyon (ROP) prosedür takip edilerek, daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak yerine SBC bir lineer blok kopolimer (LBC) hazırlanması.
    1. Silanize edilmiş şişe karışımına L-laktid, polietilen glikol (PEG), 3.15 gr ε-kaprolakton 0.3 g, α-kloro-ε-kaprolakton, 1.0 g, ve D'den 5.0 g, ekleyin.

₃ -Üç Kol SBC (SBC-aN ₃₎ aN için α-Cı-üç kol SBC 3. Sentetik modifikasyonu (Sharma ve diğ göre. ⁶⁾

1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, azot altında, kuru N, N' -dimetilformamid 30 mL SBC-αCl 5 g çözülür.
2. sodyum azid 0.22 g ilave edilir ve oda sıcaklığında gece boyunca reaksiyona girmesine izin verir.
   Dikkat: sodyum azid zehirlidir; uygun kişisel koruyucu giysiler giymelidir (PPE).
3. N, 11 mbar ve 40 ° C'de döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında N'-dimetilformamid çıkarın. 30 mL toluen içinde bir karışım içinde çözündürülür. oluşan tuzun ayrılması için 15 dakika boyunca 2,800 x g'de üç kere çözelti santrifüjleyin. 77 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında toluen buharlaşır.
4. ^1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak azid ikame başarısını izleyin.
   NOT: ^{1H NMR spektrumu, azid grubuna ilişkin 3.90 ppm'de bir zirvenin görünüşü dışında, ana SBC-αCl benzerdir; FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2.928, 2.108 (s, azid), 1.754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s) ve 696 (m).}

4. Kolesteril sentezi 5-Hexynoate (LC Yarımı) (Sharma ve diğ. ⁶ ve Donaldson ve arkadaşlarına göre. ³⁰⁾

1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 5-heksinoik asit, 3 g ve 130 ml diklorometan karıştırılır. 0 ° C'ye soğutun, bir buz banyosu kullanılarak.
2. Başka bir yuvarlak dipli bir şişeye, N, N'-disikloheksilkarbodiimid ve 8,28 g, kolesterol 10.3 g, ve 4-dimetilaminopiridin, 0.2 g karıştırın.
3. 1 saat boyunca 0 ° C 'de nihai karışımın kolesterol karışımı içeren bir şişeye 5-heksinoik asit çözeltisi damla damla aktarın ve bakımı.
4. Karışım, gece boyunca oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verin.
5. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak filtreleme ile elde edilen disikloheksilüre çökelti çıkarın ve atın.
6. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir. 150 mL heksan içinde toplanan tortu çözülür.
7. 335 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. Nihai ürün toplamak için yağlı tortuya, 350 ml etanol ekleyin. Yıkayın, tam beyaz olmayan etanol ile oluşturulur ve 50 ° C'de vakum altında bir katı ürün kuru katı madde.
8. Aşağıdaki ^1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 5.39 (d, J = 4.7 Hz, 1 H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1 H, CH CHOCO), 2.44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH _2CO), 2.34 (m, 2H, CH _2-C H =), 2.31 (m, 2H, CH ₂ CH _2-COO), 2.28 (s, 1 H, 'HC = C), 2.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡CC _H2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH _2, CH), 0.94 (s, 3H, _CH3), 0.89 (d, J = 1.8 Hz, 3H, _CH3 CH) ve 0.88 (d, J = 1.8 Hz, 6H, _CH3-C, H), 0.67 (s, 3H, _CH3). FT-IR (1 / λ ^[cm-1]): 2,830-2,990 (geniş ve güçlü bir zirve), 2.104 (m), 1.695 (s), 1.428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s) ve 667 (ler).

5. Sentetik modifikasyonu _a-N3 -Üç Kol SBC a-Kolesteril-üç kol SBC bir Azid-Alkin Huisgen Siklo-eklenmesi Reaksiyonu ile (SBC-αCLC) ( "Klik" Reaksiyon) göre (SBC-Chol elde etmek Sharma ve diğ. ⁶⁾

1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, henüz distile edilmiş tetrahidrofuran, 100 mL (THF) içerisinde SBC-aN ₃ (1.5 g), 1 molar eşdeğer çözülür. 1.2 mol equivalen eklemekolesteril 5-hexynoate (1.94 g), bakır (I) 'in 0.1 mol eşdeğer iyodür (0.06 g) t, ve 0.1 trietilamin molar eşdeğer (0.03 g) verdi. gece boyunca azot altında 35 ° C'de karıştırın.
2. 357 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır.
3. gibi tepkimeye girmemiş malzemenin ve yan ürünleri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 2,800 x g'de 5 dakika için bir diklorometan ve santrifüj 80 mL kalıntı karışımı içinde çözülür.
4. Aşağıdaki ^1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 7.54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH kolesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH _3), 4.68 -4.55 (m, O-CH, kolesterol), 4,24-4,19 (m, _CH2 O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 Hz, _CH2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4.4 Hz, CH ₂ O), 2,47-2,41 (t, J = 4.9 Hz, _COCH2), 2,31-2,25 (m, _COCH2), 2,07-1,02 (m, _CH2 , _CH3), 1,05-1,03 (s, _{CH2, CH3),} 0.96-0.92 (d, J = 3.3 Hz, _{CH2, CH3),} 0,91-0,87 (dd, J = 1.9 Hz, = 1.8 Hz, _CH3), ve 0,71-0,68 (s, _CH3). FT-IR (1 / λ ^[cm-1]): 3.260 (s), 2.920 (s), 1.710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1.240 (m), 1.190 (s), 733 (s) ve 668 (ler).

2,2-Bis (1-kaprolakton-4-il) propan (Çapraz Bağlayıcı BCP) 6. sentezi (Gao ve ark., ²⁷ ve Albertsson ve arkadaşlarına göre. ³¹⁾

1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 2-bis (4-hidroksi-sikloheksil) propan ve asetik asit 52 mL, 10.8 g ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır.
2. asetik asit ve 50 mL damıtılmış su 8 mL krom trioksit 11 g ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. A, örneğin 17 ve 20 ° C arasında (karışım sıcaklığı muhafaza ederken, aşama 6.1'de hazırlanan çözeltiye Bu çözeltiye damla damla ilave edilirsu banyosu); Bu damla damla işlemi 2 saat sürer. İşlem tamamlandıktan sonra, çözelti, yaklaşık 30 dakika boyunca karışmaya bırakın.
3. 2-propanol, 50 mL ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır.
4. 137 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında koyu mor bir çözelti konsantre edilir. çökeltilmesi için damıtılmış su 300 mL; çökelti mor ışık olmalıdır.
5. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak ham ürün filtre. damıtılmış su ~ 250 mL 'si ile veya beyaz katı hale gelene kadar katı madde yıkanır.
6. 40 ° C'de 15 mL benzen, katı maddeyi çözündürülür ve 25 ° C'de yeniden kristalize sağlar.
7. kuru diklorometan ve şişeye 75 mL diklorometan içinde 3-kloroperbenzoik asit 6.0 g ihtiva eden bir çözelti içerisinde çözündürüldü, kuru diketon 8.34 g ekleyin.
8. 24 saat boyunca 40 ° C'de çözelti, geri akış.
9. M çökeltmek için 10 dakika boyunca -20 ° C'ye Reaksiyon karışımını soğutun -klorobenzoik asit yan ürünü.
10. (Bir kağıt filtre kullanılarak) süzme ile m-klorobenzoik asidin çıkarılması ve indirgenmiş basınç altında çözelti konsantre edilir.
11. 2-heptanon, 200 mL 'si ile viskoz ham ürün yıkanır ve gece boyunca 50 ° C'de vakum altında bir çökelti kurutulur.
12. Aşağıdaki ^1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14.2, 7.4 Hz, 2H, CH ₂ OC = O), 4,21-4,15 (t, 2 H, J = 11.3 Hz, CH ₂ OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14.3, 6.5, 1.6 Hz, 2H, CH _CH2COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13.3, 2.1 Hz, 2H, CH _CH2COO), 2,04-1,93 (m, 4H, C _{H2 CH2OC} = O), 1,70-1,56 (m, 4H, C _H2 CH _CH2COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - Cı, H, C _{(CH3) 2),} ve 0.84 (s, 6H, _CH3 = C-).

Heksametilen diizosiyanat (HDI), ya da 2,2-bis (1-kaprolakton-4-il) propan (BCP) ²⁷ birini kullanarak gözenekli 3D Elastomer yapı iskelesinin 7. oluşturulması çapraz bağlayıcılar (Gao göre ve ark. ²⁷⁾ olarak

1. üç kollu bir elastomer HDI 0.25 mL (veya BCP 0.45 mL) ilave edilerek SBC-αCLC 0.75 g kullanılarak karışımını ve damıtılmış ε-kaprolakton monomer 0.24 mL hazırlayın. Sn (Ekim) ₂ 60 mcL ekleyin. (Bu adım 2 saat kadar sürebilir) kullanılarak HDI BCP kullanılıyorsa, bir vorteks ile SBC-αCLC ve BCP karıştırmak ve BCP tamamen erir ve çözülene kadar 140 ° C'de bir fırında yerleştirin. BCP çözülmüş edildikten sonra, Sn (Ekim) ₂ ve girdap fırının dışına çıkarmak ve.
2. 1 x 4 cm bir metal parça kesilerek bir "gözden çıkarılabilir" nikel köpüğü şablonu hazırla. Son rulo 1 x 1 sm metal parça civarında olduğu kadar kısa bir ucundan rulo (bakınız Şekil 4).
3. tamamen 2 dakika için köpük kapsayacak şekilde aşama 7.1 'da hazırlanan karışımın, bir cam şişe ya da alüminyum folyo paketi nikel köpüğü koyun ve dökün. Pasteur pipetiyle fazla karışım çıkarın. 80 ° C de bir gece boyunca fırında bırakın.
4. alüminyum folyo soyun ya da cam kırmak. Bir traş makinesi bıçak kullanarak, nikel metali ortaya çıkarmak için, metal köpük çevresinde elastomer tıraş.
5. 1 M, demir (III) klorit _(FeCl3) 100 mL su içinde bir çözelti hazırlayın. Bir şişe içinde bir köpük yerleştirin ve _FeCl3 çözeltisi 70 ml. Oda sıcaklığında üç gün karıştırınız ve her gün _FeCl3 çözeltisi değiştirin. Her bir değişiklikten önce, 0.5 saat boyunca iyonize su ile köpük karıştırın.
   NOT: Aşındırma işlemi üç gün sonra tamamlanır. köpükler yumuşak hissedene kadar dağlama işlemi tamamlandıktan emin olmak için, dokunsal sıkıştırma testleri. dokunsal sıkıştırma testlerine Köpük direnci artık metal şablon varlığını gösterir.
6. ELAST durulayınfırını içinde gece boyunca 40 ° C'da bir vakum içinde etanol ve yer ile omer köpük.
7. Tarama elektron mikroskobu (SEM), diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), mekanik sıkıştırma testi ve termal gravimetrik analiz (TGA) ²⁷ kullanılarak malzeme karakterize eder.
   Not: daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak için, YİM aşama 7.5'de tarif edilen adımları aşağıdaki gibidir (LBC de LC parçasını ihtiva eden emin) ile SBC değiştirin.

Steril Teknikleri Kullanarak 8. SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri ile Elastomer Scaffold tohumlama ve Kültür

1. % 70, 1 mL etanol ile iki kere yıkayarak elastomer sterilize edin. 10 dakika boyunca UV-ışını gerçekleştirin ve% 70 etanolün 1 mL'si ile yıkayın. steril su, 1 mL ve fosfat tamponlu tuzlu su, 1 mL (PBS) ile iki kere yıkayın. 24 oyuklu kültür plakaları içinde elastomerleri yerleştirin.
2. % 90 Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) bağlı ek içeren SH-SY5Y hücre büyüme ortamı hazırlamak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (LTR yükseltici) durumunda ile şubenin kiralama işlemi.
3. Bir hematositometre kullanılarak hücrelerin sayılmasından sonra büyüme ortamı 100 uL (tohum çözelti) içinde süspansiyon haline getirilmiş, 1.5 x 10 ⁵ SH-SY5Y hücreleri hazırlamak. Bir damla oluşturmak için emin olun, elastomerler üstünde çözümünü ekleyin.
4. Hücre yapışmasını desteklemek için 2 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 _CO2 tohumlanmış elastomerleri inkübe edin. Büyüme ortamı, 0.5 mL ekleyin. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de daha inkübe edin.
5. 1 mL PBS ile yıkandıktan sonra ortam her iki günde bir değiştirin.

Elastomer Construct 9. Mikroskopik Görüntüleme

1. 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile elastomerler üzerinde büyütülmüş hücreler sabitleyin. Her biri 5 dakika boyunca PBS üç kez 3 mL ile yıkayın ve ekli bir lamel ile bir kültür kabı içinde sabit hücreleri ile elastomer yerleştirin.
   Dikkat: PFA toksiktir. uygun kişisel koruyucu giysiler (KKE) giyin.
2. Stave 10 dakika boyunca 500 ul PBS içinde 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI),% 0.1 ile sabit örnekleri 5 dakika boyunca iki kez 1 mL PBS ile yıkayın.
3. örnek kapsayan görüntü yığınları elde DAPI floresan ile konfokal mikroskopi kullanılarak hemen görüntü elastomerler.
   NOT: Burada görüntü yığınları bir 20X objektif ve 60X objektif kullanılarak elde edildi.
4. ImageJ ³² kullanan optik konfokal görüntü yığınları analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu rapor, bir nikel şablonu kullanılarak hücre kültürü için bir iskele olarak gözenekli bir 3D LCE hazırlanması yöntemini göstermektedir. Elde edilen 3D LCE kolay bir hücre infiltrasyonu sağlar kompleks birbirine kanal ağı, hem de daha uygun bir kütle transferini ²⁷ göstermektedir. Bu hücreler, tam olarak birbirine bağlanmış kanal ağ nüfuz edebilmek ve aynı zamanda LCE içinde hizalamak için mümkün olduğu bulunmuştur. Burada, bir meta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sıvı kristal elastomerler son zamanlarda nedeniyle uyaranlar tepki için biyouyumlu hücre yapı iskeleti olarak incelenmiştir. Bunlar hücre yapı iskeleti olarak ideal bir platform olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hazırlama ve yeni bir LCE iskele tasarlarken akılda tutulması gereken önemli bir faktördür gözeneklilik olduğunu. Sızabilir katı ²³ ya da gazların dahil, her zaman homojen gözenekli ya da tamamen birbirine gözenekler ile sonuçlanmaz. kazınmış edilebilir bir metal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000