הקלטה EEG בחופשיות העברת חולדות neonatal בשיטת רומן

Summary

כאן, אנו מציגים טכניקה חדשנית שנועדה להקליט electroencephalography (EEG) בחופשיות נעורים אפילפטיים נעורים באופן חופשי ולתאר את הנהלים שלה, תכונות, ויישומים. שיטה זו מאפשרת אחד להקליט EEG במשך יותר מ 1 בשבוע.

Abstract

EEG היא שיטה שימושית לזיהוי פעילות חשמלית במוח. יתר על כן, זהו כלי אבחון בשימוש נרחב עבור תנאים נוירולוגיים שונים, כגון אפילפסיה והפרעות נוירודגנרטיבית. עם זאת, זה קשה מבחינה טכנית להשיג הקלטות EEG ב יילודים כפי שהוא דורש טיפול מיוחד טיפול רב. כאן, אנו מציגים שיטה חדש לרשום EEG ב גורים עכברוש ילודים (P8-P15). עיצבנו אלקטרודה פשוטה ואמינה באמצעות לוקוסים של המחשב; זה יכול להיות מושתל בקלות לתוך הגולגולת של גור עכברוש להקליט אותות EEG באיכות גבוהה במוח נורמלי אפילפטי. Pups קיבלו הזרקת intraperitoneal (IP) של חומצה kainic neurotoxin (KA) כדי לגרום התקפים אפילפטיים. השתלה כירורגית שבוצעה בהליך זה הוא זול יותר מאשר נהלים אחרים EEG עבור יילודים. שיטה זו מאפשרת להקליט אותות EEG באיכות גבוהה ויציבה במשך יותר משבוע אחד. יתר על כן, הליך זה יכול להיות מיושם גם על ra הבוגרתTs ועכברים כדי ללמוד אפילפסיה או הפרעות נוירולוגיות אחרות.

Introduction

ידוע היטב כי תקשורת מתמשכת בין נוירונים נדרשת כדי להשיג תפקוד תקין של המוח. תקשורת interneuronal מתרחשת בעיקר בסינפסות, שבו מידע נוירון אחד מועבר נוירון השני. שידור סינפטי זה מתווכת על ידי שני סוגים של הסדרים מבניים ייעודיים: סינפסות חשמליות או כימיות ¹ . Electrophysiology הוא השדה אשר לוכד את הפוטנציאל החשמלי המיוצר במהלך תקשורת interneuronal כי השליטה על פונקציות הגוף הכולל והתנהגות ² . EEG היא השיטה הנפוצה ביותר בין טכניקות אלקטרו רבות.

EEG היא טכניקה המשמשת לזהות שינויים אותות חשמליים המיוצרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים. יתר על כן, זהו מבחן חיוני לאבחון קליני ולניבוי תוצאות של תנאים נוירולוגיים שונים כגון אפילפסיה, מחלת פרקינסון ואלצהיימרE, כמו גם ההשפעות של סוכני פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים ³ . בדרך כלל, חולה אפילפטי מראה היפראקסיסטיות וליקוי קישוריות תפקודית בתוך המוח; אלה מסוכמים כמו הפרשות epileptiform interictal (IEDs) והוא יכול להיות מוקלט על ידי EEG בצורה של קוצים חדים, חולף; גלים חדים; מתחמי גל ספייק; או polyspikes ⁴ . המאפיין העיקרי של המוח האפילפטי הוא ההתרחשות הספונטנית של התקפים אפילפטיים, אשר ניתן להקליט או מהקרקפת או מתוך פרנכימה במוח על מנת לאתר את אזור המוח האחראי על ההתקפים ⁵ . יתר על כן, EEG יש גם השלכות חשובות מאוד הפרעות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר (AD). מחקרים מראים כי שינויי EEG השתנו ורשתות נכות נפגעות בחולי AD הם נפוצים. עם זאת, הידע שלנו על פתופיזיולוגיה של תנודות הרשת במחלות neurodegenerative iS מפתיע חלקית ואת צריכה להיות נוספת לחקור ⁶ .

בפרוטוקול זה, עיצבנו אלקטרודה פשוטה שבה ניתן להקליט EEG כדי להבין את התקשורת החשמלית הן במוח הנורמלי הפתולוגי. השתלה כירורגית בשיטה זו הוא זול יותר מאשר נהלים אחרים זמינים ⁷ . יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי להקליט באיכות גבוהה ויציבה אותות EEG עבור timeframes יותר ( כלומר, 2-4 שעות בכל יום במשך שבוע 1). בנוסף, השתמשנו אלקטרודות מצית (במשקל של כ 26 מ"ג) המאפשרים לבעלי החיים להתנהג באופן טבעי יותר ⁸ . שיטה זו מיושמת באופן נרחב על המחקר של EEG ב גורים עכברוש ילודים הדורש את המגבר ואת digitizer, נפוץ במעבדה electrophysiology ואינו דורש שום התקנים נוספים.

Protocol

טיפול בבעלי חיים, הליך כירורגי, ונהלי הקלטה היו בהתאם להנחיות עבור דרום סין רגיל אוניברסיטת בעלי חיים טיפול ועדת שימוש.

1. הכנת אלקטרודה (איור 1A-C)

הערה: מחשב סיכת loci הוא פשוט קשר בעל שיניים כחלק ממשק האות בהתקני תקשורת. הוא מורכב ממחבר זכר המתחבר למחבר הנשי.

1. בזהירות להפריד את סיכות זכר ונקבה מהסיכה המחשב לוקוסים ( איור 1 א ) בעזרת המלקחיים. חבר את הפינים זכר ונקבה יחד כדי ליצור אלקטרודה וליישם cyanoacrylate ליצור קשר דבק חזק ( איור 1 ג ).
2. שים את האלקטרודות לתוך כוס מלאה מים מזוקקים עבור ומניחים אותו לניקוי קולי במשך 10 דקות. להעביר אותם לתנור ייבוש על 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לעקר את האלקטרודות באמצעות אור UV למשך 30 דקות.

2. הליך כירורגי (איור 1D-F)

1. הכן את כלי ניתוח מעוקרים ומנגנון stereotaxic. להרדים את הגורדה עכברוש ילוד באמצעות הרדמה isoflurane (2.5%) עם האוויר. כאשר הגור הוא הרדים עמוקים, להתאים את המינון של isoflurane ל 1.0%. בצע זנב או קמצוץ הבוהן לפני הניתוח כדי להבטיח את העומק הנכון של הרדמה.
2. לתקן את הראש של הגור במנגנון stereotaxic על ידי הנחת פסי האוזן לתוך תעלות האוזן מעט הידוק אותם.
   הערה: אין להדק יתר על המידה את פסי האוזן, שכן הגולגולת הניאונטלית רכה מאוד.
3. לשמור על שדה כירורגית סטרילית על ידי ריסוס כל הציוד עם אתנול 70%. לעשות חתך 15 מ"מ על הראש באמצעות אזמל. בעזרת מלקחיים, בעדינות למשוך את הקרקפת הרחק קו האמצע בארבע הפינות. שים קצת מלוחים ספוג מים מתחת לעור כדי לשמור את החתך פתוח לרווחה ( איור 1D ).
4. מצא את נקודות ברגמה ולבדה על הגולגולתולסמן אותם בעיפרון. השתמש מחט מזרק (26 G) לעשות שני חורים בר לתוך קליפת המוח הקדמי (PFC) והיפוקמפוס.
   הערה: PFC ממוקם ב 1 מ"מ מ"מ האחורי כדי bregma ו -0.5 מ"מ לרוחב לקו האמצע, בעוד ההיפוקמפוס ממוקם ב -2.0 מ"מ הקדמי כדי ברגמה ± 0.5 מ"מ לרוחב לקו האמצע ( איור 1D ו- E ). עומק האלקטרודה לא צריך להיות יותר מ 2 מ"מ מתחת משטח קליפת המוח כדי למזער נזק מוחי.
5. השתמש במלקחיים להחזיק את האלקטרודות ולהכניס את הפניה אלקטרודות ההקלטה לתוך PFC ו היפוקמפוס, בהתאמה. החל משחה erythromycin סביב האלקטרודה, כדי למנוע זיהום אפשרי. תקן את האלקטרודה באמצעות cyanoacrylate.
6. הכן מלט אקרילי שיניים כך יש עקביות דביק צמיג. החל את מלט שיניים לכסות את האלקטרודות ואת שאר הגולגולת.
   הערה: יש לייבש את הגולגולת ביסודיות לפני החלת מלט השיניים.
7. החל 5% חומצה picric על האלקטרודות כדי להגן עליהם.
   הערה: ההליך כולו צריך להיעשות מכסה המנוע biosafety לשמור על תנאים סטריליים.
8. הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic להזריק 300 μL של 10% גלוקוז תת עורית. מניחים אותו על שמיכה מחומם להתאוששות. ודא כי החיה היא חמה (37 מעלות צלזיוס) ו אמבולטורי ( כלומר, התאושש לחלוטין). ניהול buprenorphine intraperitoneally (0.05 מ"ג / ק"ג) עבור כאבים שלאחר ניתוח.
   הערה: אל תעזוב בעל חיים ללא השגחה עד שהוא יחזור להכרה מספקת (כלומר, התנהגות רגילה ותנועה).
9. להחזיר את הגור לכלוב הביתה עם הסכר שלהם לאחר שהוא חוזר להכרה. המתן יומיים עד שהחיה תושלם במלואה.

3. הקלטה EEG

1. לאחר החלמה מלאה, לחבר את האלקטרודות מושתל על הגולגולת של הגור אל המגבר בכלוב שלה. חבר את המגבר לכדי אנלוגי לדיגיטליעל ממיר ולהצמיד את הממיר למחשב; את הקווים המחוברים צריך לטפל בזהירות, כך שהם לא מקבלים מסובך.
2. בחר לפחות 10,000 דגימה קצב הדגימה על יחידת רכישת נתונים להקלטת (רוחב הפס של המשדר הוא 1-100 הרץ). ודא שהנתונים נדגמו כראוי.
3. לאחר קבלת הקלטה בסיסית, להזריק את הגור intraperitoneally עם חומצה kainic (KA) (2 מ"ג / ק"ג) כדי לגרום התקפים אפילפטיים. 15 דקות לאחר הזרקת KA לצפות ולתעד את הפרשות אפילפטי. התפיסה לייצר דרך KA הם בדרך כלל פיזית.
   הערה: משך ה- iictal-tonic הוא בערך 15.2 ± 0.9 s, משך ההתקפים הוא בערך 62 ± 5 שניות. ניתן למנוע התקפים בחולדה הניאונטלית על ידי מתן הזרקה IP של הידרל כלורל (400 מ"ג / ק"ג).
4. שמור את הנתונים דיגיטליים ולנתח אותו באמצעות חבילות עיבוד אותות, כגון spike2. לחשוף את רמת הכוח של רכיבי תדר שונים האות neagatal EEG ידי perfאו ניתוח של ספקטרום הספק. לחשב את הכוח של מסגרת זמן 1 דקות על ידי מציאת משרעת ממוצע מרובע שורש מ 1 עד 100 הרץ (הלהקה EEG) ⁹ .

תוצאות

אם ההליכים כירורגית לעיל מתבצע כראוי, ערוץ אחד העכברוש ילוד הגור EEG ההקלטה תבוצע בהצלחה. 10 דקות לאחר הזרקת KA, דפוס קבוע של סימנים התנהגותיים הופיעו בצורה של תנועות לא סדירות גירוד, רעידות, אובדן של איזון. איור 2 מציג את עקבות נציג EEG עקבות ו interictal, icta...

Discussion

כאן, אנו מדווחים על ניתוח והליכי ההקלטה לרכישת EEG בחופשיות העברת גורים עכברוש ילודים על ידי שיטת חוטית ( איור 3 ). זה כבר הציע כי גורד עכברוש P7-P12 הוא בגיל ההתפתחות המתאים לטווח קצר של היילוד האנושי ^{10 , 11} . זה קשה מבחינה טכנית להשיג ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer pin
Pincer	DELI Group Co., Ltd.
502 super glue	DELI Group Co., Ltd.	7144
Drying oven	Boxun	GZX-9140MBE
Isofluorane	RWD Life Science	902-0000-522
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	900-0068-507
Anesthesia apparatus	RWD Life Science	902-0000-510
Homeothermic Heating Device	Harvard Apparatus	K 024509
Amplifier Model 3000	A-M Systems	61558
Micro1401 Analog Digital converter	Cambridge Electronic Design Ltd.	4383	Data acquisition unit
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.