Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

Resumo

Aqui, nós introduzimos uma técnica nova projetada registrar o electroencephalography (EEG) em filhotes epileptic neonatal movendo-se livremente e descrever seus procedimentos, caraterísticas, e aplicações. Este método permite gravar EEG por mais de uma semana.

Resumo

O EEG é um método útil para detectar a atividade elétrica no cérebro. Além disso, é uma ferramenta de diagnóstico amplamente utilizada para várias condições neurológicas, tais como epilepsia e distúrbios neurodegenerativos. No entanto, é tecnicamente difícil obter gravações EEG em recém-nascidos, uma vez que requer manuseio especializado e grande cuidado. Aqui, apresentamos um novo método para gravar EEG em filhotes de ratos neonatais (P8-P15). Nós projetamos um eletrodo simples e confiável usando loci de pinos de computador; Ele pode ser facilmente implantado no crânio de um filhote de rato para gravar sinais de EEG de alta qualidade no cérebro normal e epiléptico. Os filhotes receberam uma injecção intraperitoneal (ip) da neurotoxina ácido cainico (KA) para induzir convulsões epilépticas. A implantação cirúrgica realizada neste procedimento é menos dispendiosa do que outros procedimentos EEG para neonatos. Este método permite gravar sinais EEG de alta qualidade e estáveis ​​por mais de uma semana. Além disso, este procedimento também pode ser aplicado a adultos raSt e ratinhos para estudar a epilepsia ou outros distúrbios neurológicos.

Introdução

Está bem estabelecido que a comunicação contínua entre os neurónios é necessária para obter a função normal do cérebro. A comunicação interneuronal ocorre principalmente nas sinapses, onde a informação de um neurônio é transportada para um segundo neurônio. Esta transmissão sináptica é mediada por dois tipos de arranjos estruturais dedicados: sinapses elétricas ou químicas ¹ . A eletrofisiologia é o campo que capta o potencial elétrico produzido durante a comunicação interneuronal que controla as funções e comportamento do corpo ² . O EEG é o método mais comumente usado entre muitas técnicas eletrofisiológicas.

O EEG é uma técnica utilizada para detectar alterações nos sinais elétricos produzidos por estímulos internos ou externos. Além disso, é um teste essencial para o diagnóstico clínico e previsão de resultados de várias condições neurológicas, tais como epilepsia, Parkinson e doença de AlzheimerE, bem como os efeitos de agentes farmacológicos e toxicológicos ³ . Geralmente, um paciente epiléptico apresenta hiperexcitabilidade e comprometimento da conectividade funcional dentro do cérebro; Estes são resumidos como descargas epilépticas interictais (IEDs) e podem ser registados pelo EEG sob a forma de picos agudos e transitórios; Ondas afiadas; Complexos pico-onda; Ou polyspikes ⁴ . A principal característica do cérebro epilético é a ocorrência espontânea de convulsões epilépticas, que podem ser registradas tanto no couro cabeludo como no parênquima cerebral, a fim de localizar a área cerebral responsável pelas convulsões ⁵ . Além disso, EEG também tem implicações muito importantes em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DA). Pesquisas sugerem que os registros alterados de EEG e redes oscilatórias comprometidas em pacientes com DA são comuns. No entanto, nosso conhecimento sobre a fisiopatologia das oscilações de rede em doenças neurodegenerativas iÉ surpreendentemente incompleta e precisa ser mais explorada ⁶ .

Neste protocolo, nós projetamos um eletrodo simples com o qual se pode gravar o EEG para entender a comunicação elétrica tanto no cérebro normal quanto no patológico. A implantação cirúrgica neste método é mais barata do que outros procedimentos disponíveis ⁷ . Além disso, este método pode ser usado para gravar sinais de EEG de alta qualidade e estáveis ​​para prazos mais longos ( isto é, 2-4 h todos os dias durante 1 semana). Além disso, usamos eletrodos mais leves (pesando aproximadamente 26 mg) que permitem aos animais se comportar mais naturalmente ⁸ . Este método é amplamente aplicável ao estudo de EEG em filhotes de ratos neonatais que requer o amplificador e digitalizador, comumente usado em laboratório de eletrofisiologia e não requer nenhum dispositivo adicional.

Protocolo

Cuidados com animais, procedimento cirúrgico e procedimentos de registro estavam de acordo com as diretrizes para o Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade Normal da China do Sul.

1. Preparação do Eléctrodo (Figura 1A-C)

NOTA: O loci do pino do computador é simplesmente um contato em forma de pino como parte da interface de sinal em dispositivos de comunicação. Consiste em um conector macho que se conecta ao conector fêmea.

1. Cuidadosamente separar os pinos macho e fêmea do computador loci pino ( Figura 1A ) com a ajuda de uma pinça. Conecte os pinos macho e fêmea juntos para formar um eletrodo e aplicar cianoacrilato para criar uma ligação adesiva forte ( Figura 1C ).
2. Coloque os eletrodos em um copo cheio de água destilada para e coloque-o para o limpador ultra-sônico por 10 min. Mude-os para um forno de secagem a 45 ° C durante 30 min. Esterilizar os eletrodos usando luz UV por 30 min.

2. Procedimento cirúrgico (Figura 1D-F)

1. Preparar os instrumentos cirúrgicos esterilizados e aparelhos estereotáxicos. Anestesiar o filhote de rato neonatal usando anestesia com isoflurano (2,5%) com ar. Quando o filhote é profundamente anestesiado, ajustar a dose de isoflurano para 1,0%. Executar uma pinça de cauda ou dedo do pé antes da cirurgia para garantir a profundidade adequada de anestesia.
2. Fixar a cabeça do filhote no aparelho estereotáxico, colocando as orelhas nos canais auditivos e ligeiramente apertando-os.
   NOTA: Não aperte excessivamente as orelhas, pois o crânio neonatal é muito macio.
3. Manter o campo cirúrgico estéril por pulverização de todos os equipamentos com etanol a 70%. Faça uma incisão de 15 mm na cabeça usando um bisturi. Usando fórceps, puxe suavemente o couro cabeludo longe da linha média nos quatro cantos. Coloque um pouco de algodão embebido em solução salina abaixo da pele para manter a incisão bem aberta ( Figura 1D ).
4. Encontre os pontos bregma e lambda no crânioE marcá-los com um lápis. Use uma agulha de seringa (26 G) para fazer dois buracos no córtex pré-frontal (PFC) e no hipocampo.
   OBSERVAÇÃO: O PFC está localizado a +1,8 mm posterior ao bregma e -0,5 mm lateral à linha média, enquanto o hipocampo está localizado a -2,0 mm anterior ao bregma e ± 0,5 mm lateral à linha média ( Figura 1D e E ). A profundidade do eletrodo não deve ser mais de 2 mm abaixo da superfície cortical para minimizar os danos cerebrais.
5. Use pinças para segurar os eletrodos e insira os eletrodos de referência e gravação no PFC e no hipocampo, respectivamente. Aplique pomada de eritromicina ao redor do eletrodo para evitar qualquer possível infecção. Fixar o eletrodo utilizando cianoacrilato.
6. Prepare o cimento acrílico dental de modo que tenha uma consistência gluey e viscous. Aplique o cimento dental para cobrir os eletrodos eo resto do crânio.
   NOTA: Secar completamente o crânio antes de aplicar o cimento dental.
7. Aplique 5% de ácido pícrico nos eletrodos para protegê-los.
   NOTA: Todo o procedimento deve ser feito em um cofre de biossegurança para manter condições estéreis.
8. Remover o animal do quadro estereotáxico e injectar 300 μL de glucose a 10% por via subcutânea. Coloque-o sobre um cobertor aquecido para recuperação. Certifique-se que o animal é quente (37 ° C) e ambulatorial ( ou seja, completamente recuperado). Administrar buprenorfina intraperitonealmente (0,05 mg / kg) para dor pós-cirúrgica.
   NOTA: Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado consciência suficiente (ou seja, comportamento normal e movimento).
9. Retornar o filhote para sua gaiola casa com a sua barragem depois que ele recupera a consciência. Aguarde dois dias até que o animal esteja totalmente recuperado.

3. Gravação EEG

1. Após a recuperação completa, conecte os eletrodos implantados no crânio do filhote de cachorro ao amplificador em sua própria gaiola. Ligue o amplificador a um cabo analógico-digitalOnverter e conecte o conversor a um computador; As linhas de ligação devem ser tratadas cuidadosamente de modo a não ficar enredadas.
2. Selecione pelo menos 10.000 Hz taxa de amostragem na unidade de aquisição de dados para gravação (a largura de banda do transmissor é 1-100 Hz). Certifique-se de que os dados são amostrados corretamente.
3. Depois de obter o registo da linha de base, injectar o filhote intraperitonealmente com ácido cainico (KA) (2 mg / kg) para induzir convulsões epilépticas. 15 min após a injecção de KA observar e registar as descargas epilépticas. Os produtos da apreensão através de KA são geralmente físicos.
   NOTA: A duração ictal-tónica é de cerca de 15,2 ± 0,9 s, a duração da crise é de cerca de 62 ± 5 s. As convulsões podem ser prevenidas no rato neonatal, dando uma injecção IP de hidrato de cloral (400 mg / kg).
4. Salve os dados digitalizados e analise-os usando pacotes de software de processamento de sinal, como spike2. Revelar o nível de potência de diferentes componentes de freqüência no sinal EEG neonatalOrming uma análise de espectro de potência. Calcule a potência em um período de tempo de 1 min, encontrando a amplitude de quadrado médio-raiz de 1 a 100 Hz (banda de EEG) ⁹ .

Resultados

Se os procedimentos cirúrgicos acima forem conduzidos adequadamente, será realizada com êxito um registo de EEG de um rato de rato neonatal de rato. 10 min após a injeção de KA, um padrão regular de sinais comportamentais surgiu na forma de movimentos irregulares e arranhões, tremores e perda de equilíbrio. A Figura 2 mostra os vestígios brutos representativos de EEG e traços expandidos interictal, ictal-tónico e ictal-clónico. Os padrões interictais e ictais de desca...

Discussão

Aqui, relatamos procedimentos cirúrgicos e de registro para a aquisição de EEG em filhotes de ratos neonatais movidos livremente por um método com fio ( Figura 3 ). Tem sido sugerido que o filhote de rato P7-P12 está na idade de desenvolvimento que corresponde a um recém-nascido a termo a termo ^{10 , 11} . É tecnicamente difícil obter dados de gravação de EEG de alta qualidade quando se trabalha com filhotes de ratos nesta faixa etária....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer pin
Pincer	DELI Group Co., Ltd.
502 super glue	DELI Group Co., Ltd.	7144
Drying oven	Boxun	GZX-9140MBE
Isofluorane	RWD Life Science	902-0000-522
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	900-0068-507
Anesthesia apparatus	RWD Life Science	902-0000-510
Homeothermic Heating Device	Harvard Apparatus	K 024509
Amplifier Model 3000	A-M Systems	61558
Micro1401 Analog Digital converter	Cambridge Electronic Design Ltd.	4383	Data acquisition unit
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.