Yeni Bir Yöntemi Kullanarak Serbest Dolaşan Yenidoğan Sıçanlarında EEG Kaydı

Özet

Burada, serbestçe hareket eden neonatal epileptik yavrulara elektroensefalografiyi (EEG) kaydetmek ve prosedürlerini, özelliklerini ve uygulamalarını tanımlamak için tasarlanmış yeni bir teknik sunuyoruz. Bu yöntem, EEG'yi 1 haftadan daha uzun süreyle kayıt ettirmenizi sağlar.

Özet

EEG, beyindeki elektriksel aktiviteyi saptamak için yararlı bir yöntemdir. Dahası, epilepsi ve nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli nörolojik durumlar için yaygın olarak kullanılan bir tanı aracıdır. Bununla birlikte, yenidoğanlarda EEG kayıtları elde etmek teknik olarak zor, özel muamele ve büyük bakım gerektirdiğinden. Burada, neonatal sıçan yavrularında EEG kaydetmek için yeni bir yöntem sunuyoruz (P8-P15). Bilgisayarın pin lokusunu kullanarak basit ve güvenilir bir elektrot tasarladık; Normal ve epileptik beyinde yüksek kaliteli EEG sinyallerinin kaydedilmesi için bir sıçan yavrusunun kafatasına kolayca implante edilebilir. Puplara epileptik nöbetleri indüklemek için nörotoksin kainik asitin (KA) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu yapıldı. Bu prosedürde yapılan cerrahi implantasyon yenidoğanlar için diğer EEG prosedürlerinden daha ucuzdur. Bu yöntem, bir kişinin yüksek kaliteli ve istikrarlı EEG sinyallerini 1 haftadan fazla süreyle kaydetmesini sağlar. Dahası, bu prosedür, yetişkin ra'ya da uygulanabilirTs ve farelerden epilepsi veya diğer nörolojik bozuklukları incelemek için kullanılmıştır.

Giriş

Normal beyin fonksiyonunu elde etmek için nöronlar arasındaki sürekli iletişimin gerekli olduğu iyi bilinmektedir. İnterneonal iletişim ilk olarak bir sinir hücresinden gelen bilgilerin ikinci bir sinir hücresine iletildiği sinapslarda gerçekleşir. Bu sinaptik iletim iki tür yapısal düzenlemeyle sağlanır: elektriksel veya kimyasal sinapsler ¹ . Elektrofizyoloji, tüm vücut işlevlerini ve davranışını kontrol eden, internöronal iletişim sırasında üretilen elektrik potansiyelini yakalayan alanlardır. EEG birçok elektrofizyolojik teknik arasında en çok kullanılan yöntemdir.

EEG, iç veya dış uyaranlar tarafından üretilen elektrik sinyallerindeki değişiklikleri saptamak için kullanılan bir tekniktir. Dahası, epilepsi, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi çeşitli nörolojik durumların klinik tanı ve sonuç tahmininde önemli bir testtirE, farmakolojik ve toksikolojik ajanların etkileri ³ . Genellikle epileptik bir hastada beyinde aşırı uyarılma ve işlevsel bağlantının bozulması görülür; Bunlar interiktal epileptiform deşarjlar (IED'ler) olarak özetlenmekte ve keskin, geçici sivri uçlar şeklinde EEG ile kaydedilebilmektedir; Keskin dalgalar; Dikenli dalga kompleksleri; Veya polipropikler ⁴ . Epileptik beynin asıl özelliği epileptik nöbetlerin kendiliğinden ortaya çıkmasıdır; nöbetlerden sorumlu beyin alanını bulmak için kafa derisinden veya beyin parankiminden kaydedilebilir ⁵ . Ayrıca, EEG'nin Alzheimer hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif bozukluklarda da önemli etkileri bulunmaktadır. Araştırmalar AD hastalarında değiştirilmiş EEG kayıtlarının ve bozulmuş salınım ağlarının yaygın olduğunu ileri sürüyor. Bununla birlikte, nörodejeneratif hastalıklarda ağ salınımlarının patofizyolojisi hakkında bilgi iŞaşırtıcı derecede eksik ve daha fazla araştırılması gerekiyor ⁶ .

Bu protokolde hem normal hem de patolojik beyindeki elektriksel iletişimi anlamak için EEG'yi kaydedebilen basit bir elektrot tasarladık. Bu yöntemdeki cerrahi implantasyon diğer kullanılabilir prosedürlerden daha ucuzdur ⁷ . Dahası, bu yöntem, daha uzun zaman aralıkları için yüksek kaliteli ve kararlı EEG sinyallerinin kaydedilmesi için kullanılabilir ( yani, 1 hafta boyunca her gün 2-4 saat). Buna ek olarak, hayvanların daha doğal davranmalarını sağlayan hafif elektrotlar (yaklaşık 26 mg ağırlığında) kullandık. Bu yöntem, elektrofizyoloji laboratuvarında yaygın olarak kullanılan amplifikatör ve sayısallaştırıcıyı gerektiren yenidoğan sıçan yavrularında EEG çalışması için yaygın bir şekilde uygulanabilir ve herhangi bir ek cihaz gerektirmez.

Protokol

Hayvan bakımı, cerrahi prosedür ve kayıt prosedürleri, Güney Çin Normal Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi için yönergelere uygundu.

1. Elektrot Hazırlama (Şekil 1A-C)

NOT: Bilgisayar pin loküsü, iletişim aygıtlarındaki sinyal arabiriminin bir parçası olarak sadece bir uçlu kontakttır. Dişi konektöre takılan bir erkek konektörden oluşur.

1. Bir kıskaç yardımıyla erkek ve dişi pimleri bilgisayarın pin lokusundan dikkatlice ayırın ( Şekil 1A ). Erkek ve dişi pimleri bir elektrot oluşturacak şekilde birleştirin ve güçlü bir yapışkan bağ oluşturmak için siyanoakrilat uygulayın ( Şekil 1C ).
2. Elektrotları, damıtılmış su ile dolu bir behere koyun ve 10 dakika boyunca ultrasonik temizleyiciye yerleştirin. Onları 45 ° C'de 30 dakika kurutma fırına taşıyın. Elektrodları UV ışığı kullanarak 30 dakika sterilize edin.

2. Cerrahi prosedür (Şekil 1D-F)

1. Sterilize cerrahi aletleri ve stereotaksik aparat hazırlayın. Yenidoğan sıçan yavrusuna isofluran anestezi (% 2.5) ile hava ile anestezi uygulayın. Pedi derin anestezi altına alındığında, izofluran dozunu% 1.0'a ayarlayın. Anestezinin doğru derinliğini sağlamak için cerrahiden önce bir kuyruk veya ayak parmakları tutturun.
2. Kulak çubuklarını kulak kanallarına yerleştirerek ve hafif sıkıştırarak yavrunun başını stereotaksik aparatta sabitleyin.
   NOT: Yenidoğan kafatası çok yumuşak olduğu için kulak çubuklarını aşırı derecede sıkmayın.
3. Tüm ekipmana% 70 etanol püskürterek steril cerrahi alanı koruyun. Başınızı bir neşter kullanarak 15 mm'lik bir kesi yapın. Forseps kullanarak, dört köşedeki orta hattan kafa derisini yavaşça çekin. İnsizyonun geniş açık kalmasını sağlamak için salinle ıslanmış bir pamuk cildin altına koyun ( Şekil 1D ).
4. Kafatasındaki bregma ve lambda noktalarını bulunVe kalemle işaretleyin. Prefrontal kortekse (PFC) ve hipokampusa iki çapak deliği açmak için bir şırınga iğnesi (26 G) kullanın.
   NOT: Perküsyon, bregma'nın önüne -2.0 mm, orta çizgiye ± 0.5 mm lateralde ( Şekil 1D ve E ) bulunduğu sırada bregma'nın arkasından +1.8 mm ve orta hattan -0.5 mm lateralde bulunur. Beyin hasarını en aza indirgemek için elektrot derinliği korteks yüzeyinin 2 mm'den daha aşağıda olmamalıdır.
5. Elektrotları tutmak için forseps kullanın ve sırasıyla referans ve kayıt elektrodlarını PFC'ye ve hipokampusa yerleştirin. Olası enfeksiyonlardan kaçınmak için elektrotun çevresine eritromisin merhemi uygulayın. Elektrodu siyanoakrilat kullanarak sabitleyin.
6. Dental akrilik çimentoyu yapışkan ve yapışkan bir kıvamda olacak şekilde hazırlayın. Elektrotları ve kafatasının geri kalanını örtecek diş çimentosunu uygulayın.
   NOT: Diş çimentosunu uygulamadan önce kafatasını iyice kurutun.
7. Onları korumak için elektrotların üzerine% 5 pikrik asit uygulayın.
   NOT: Bütün prosedür, steril koşulları korumak için biyogüvenlikli bir kaput içinde yapılmalıdır.
8. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve subkutan yoldan 300 μL% 10 glikoz enjekte edin. İyileştirmek için onu ısıtmalı bir battaniye koyun. Hayvanın sıcak (37 ° C) ve ayakta ( diğer bir deyişle tamamen iyileşmiş) olduğundan emin olun. Cerrahi sonrası ağrı için buprenorfin intraperitoneal (0.05 mg / kg) uygulanır.
   NOT: Bir hayvanı yeterince bilinç kazanana kadar gözetimsiz bırakmayın (normal davranış ve hareket).
9. Bilinci geri gelip yavruları barajlarıyla evindeki kafese geri getirin. Hayvan tamamen kurtarılana kadar iki gün bekleyin.

3. EEG Kaydı

1. Tam toparlandıktan sonra yavrunun kafatasına implante edilen elektrotları kendi kafesindeki amplifikatöre bağlayın. Amplifikatörü analogdan dijital c'ye bağlayınDönüştürücü ve dönüştürücü bir bilgisayara takın; Bağlantı hatları karışık olmamaları için dikkatle muamele edilmelidir.
2. Kayıt için veri toplama ünitesinde en az 10,000 Hz örnekleme hızı seçin (vericinin bant genişliği 1-100 Hz'dir). Verilerin doğru örneklendiğinden emin olun.
3. Temel kayıt alınmasından sonra, pupayı epileptik nöbetleri indüklemek için intraperitoneal olarak kainik asit (KA) (2 mg / kg) ile enjekte edin. KA enjeksiyonundan 15 dakika sonra epileptik deşarjları gözlemleyin ve kaydedin. KA aracılığıyla üretilen nöbet genellikle fiziksel.
   NOT: İitalt tonik süre yaklaşık 15.2 ± 0.9 s, nöbet süresi yaklaşık 62 ± 5 s'dir. Yenidoğan sıçanında, IP enjeksiyonu kloral hidrat (400 mg / kg) vererek nöbetler önlenebilir.
4. Dijitalleştirilmiş verileri kaydedin ve spike2 gibi sinyal işleme yazılımı paketlerini kullanarak analiz edin. Yenidoğan EEG sinyalindeki farklı frekans bileşenlerinin güç düzeyini perf ile ortaya koyunBir güç spektrumu analizinin orming edilmesi. 1 ila 100 Hz (EEG bandı) ⁹ arasındaki kök-ortalama kare genliğini bulmak için gücü 1 dakikalık bir zaman aralığında hesaplayın.

Sonuçlar

Yukarıdaki cerrahi prosedürler düzgün bir şekilde yürütülürse, bir kanallı sıçan yenidoğan yavrusu EEG kaydı başarıyla gerçekleştirilecektir. KA enjeksiyonundan 10 dakika sonra düzensiz hareketler, kaşınma, titreme ve denge kaybı şeklinde düzenli davranış belirtileri paternleri ortaya çıktı. Şekil 2, temsili ham EEG izlerini ve interiktal, ictal tonik ve ictal-klonik genişletilmiş izleri göstermektedir. KA enjeksiyonundan sonra tekrarlayan interikta...

Tartışmalar

Burada serbestçe hareket eden yenidoğan sıçan yavrularını kablolu yöntemle EEG elde etmek için cerrahi ve kayıt prosedürlerini bildiriyoruz ( Şekil 3 ). P7-P12 sıçan yavrusunun tam dönem insan yenidoğanına karşılık gelen gelişimsel yaşta olduğu öne sürülmüştür 10,11. Bu yaş grubundaki sıçan yavrularıyla çalışırken teknik olarak yüksek kaliteli EEG kayıt verileri elde etmek zordur. Buna ek olarak, özel kullanım ve çok dikkatli olmayı gerektirir ^...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer pin
Pincer	DELI Group Co., Ltd.
502 super glue	DELI Group Co., Ltd.	7144
Drying oven	Boxun	GZX-9140MBE
Isofluorane	RWD Life Science	902-0000-522
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	900-0068-507
Anesthesia apparatus	RWD Life Science	902-0000-510
Homeothermic Heating Device	Harvard Apparatus	K 024509
Amplifier Model 3000	A-M Systems	61558
Micro1401 Analog Digital converter	Cambridge Electronic Design Ltd.	4383	Data acquisition unit
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.