Запись ЭЭГ в свободно перемещающихся крысах новорожденных с использованием нового метода

Резюме

Здесь мы представляем новую технику, предназначенную для записи электроэнцефалографии (ЭЭГ) в свободно движущихся неонатальных эпилептических детенышах, и описываем ее процедуры, особенности и применения. Этот метод позволяет регистрировать ЭЭГ более 1 недели.

Аннотация

ЭЭГ - полезный метод для обнаружения электрической активности в мозге. Кроме того, это широко используемый диагностический инструмент для различных неврологических состояний, таких как эпилепсия и нейродегенеративные расстройства. Однако технически сложно получить записи ЭЭГ у новорожденных, поскольку для этого требуется специализированная обработка и тщательный уход. Здесь мы представляем новый метод регистрации ЭЭГ у новорожденных щенков крыс (P8-P15). Мы спроектировали простой и надежный электрод, используя лотки с компьютерными штифтами; Он может быть легко имплантирован в череп крысиного щенка для регистрации высококачественных сигналов ЭЭГ в нормальном и эпилептическом мозге. Щенкам вводили интраперитонеальную (внутрибрюшинную) инъекцию нейротоксин-каиновой кислоты (КА) для индукции эпилептических припадков. Хирургическая имплантация, выполняемая в этой процедуре, менее дорогостоящая, чем другие процедуры ЭЭГ для новорожденных. Этот метод позволяет регистрировать высококачественные и стабильные сигналы ЭЭГ более 1 недели. Кроме того, эта процедура может быть применена и к взрослому raTs и мышей для изучения эпилепсии или других неврологических расстройств.

Введение

Хорошо известно, что для получения нормальной функции мозга требуется непрерывная связь между нейронами. Межнейронная связь в основном происходит в синапсах, где информация от одного нейрона передается второму нейрону. Эта синаптическая передача опосредуется двумя типами специальных структур: электрическими или химическими синапсами ¹ . Электрофизиология - это область, которая фиксирует электрический потенциал, возникающий во время межнейронной коммуникации, который контролирует общие функции и поведение организма ² . ЭЭГ является наиболее часто используемым методом среди многих электрофизиологических методов.

ЭЭГ - метод, используемый для обнаружения изменений электрических сигналов, создаваемых внутренними или внешними стимулами. Кроме того, это важный тест для клинической диагностики и прогноза исходов различных неврологических состояний, таких как эпилепсия, болезнь Паркинсона и болезнь АльцгеймераЕ, а также эффекты фармакологических и токсикологических агентов ³ . Как правило, эпилептический пациент проявляет гипервозбудимость и нарушение функциональной связности в головном мозге; Они суммируются как интериктальные эпилептиформные разряды (ИЭУ) и могут регистрироваться ЭЭГ в виде резких переходных скачков; Острые волны; Комплексы спайк-волн; Или полиспасты ⁴ . Главной особенностью эпилептического мозга является спонтанное возникновение эпилептических припадков, которые могут быть записаны либо с головы, либо из паренхимы головного мозга, чтобы определить местонахождение области мозга, ответственной за приступы ⁵ . Кроме того, ЭЭГ также имеет очень важные последствия в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера (AD). Исследования показывают, что измененные записи ЭЭГ и нарушения осцилляторных сетей у пациентов с АД являются общими. Однако наши знания о патофизиологии колебаний сети при нейродегенеративных заболеваниях iУдивительно неполной и нуждается в дальнейшем изучении ⁶ .

В этом протоколе мы разработали простой электрод, с помощью которого можно записывать ЭЭГ, чтобы понять электрическую связь как в нормальном, так и в патологическом мозге. Хирургическая имплантация в этом методе дешевле, чем другие доступные процедуры. ⁷ . Более того, этот метод может быть использован для записи высококачественных и стабильных сигналов ЭЭГ на более длительные временные рамки ( т.е. 2-4 часа в день в течение 1 недели). Кроме того, мы использовали более легкие электроды (весом около 26 мг), которые позволяют животным вести себя более естественно ⁸ . Этот метод широко применим для изучения ЭЭГ у новорожденных крысят новорожденных, для которых требуется усилитель и дигитайзер, обычно используемые в электрофизиологической лаборатории и не требующие дополнительных устройств.

протокол

Уход за животными, хирургические процедуры и процедуры регистрации соответствовали руководящим принципам Комитета по уходу и использованию животных Южно-Китайского педагогического университета.

1. Подготовка электродов (фигура 1A-C)

ПРИМЕЧАНИЕ. Локальные контакты на компьютере - это просто контактный контакт в качестве части интерфейса сигнала в устройствах связи. Он состоит из штекерного разъема, который вставляется в гнездовой разъем.

1. Тщательно отделите штырьки мужского и женского пола от лоскутов пальцев компьютера ( рис. 1A ) с помощью клещей. Соедините штыри мужского и женского пола вместе, чтобы сформировать электрод, и нанесите цианоакрилат, чтобы создать прочную адгезионную связь ( рис. 1С ).
2. Поместите электроды в стакан, наполненный дистиллированной водой, и поместите его в ультразвуковой очиститель на 10 мин. Переместите их в сушильную печь при 45 ° C в течение 30 минут. Стерилизовать электроды с помощью УФ-излучения в течение 30 мин.

2. Хирургическая процедура (рис. 1D-F)

1. Подготовьте стерилизованные хирургические инструменты и стереотаксическую аппаратуру. Анестезируйте щенка новорожденных крыс, используя изофлуран анестезию (2,5%) с воздухом. Когда щенок подвергается глубокой анестезии, отрегулируйте дозу изофлурана до 1,0%. Выполняйте хвост или пальцы на ноге перед операцией, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
2. Закрепите головку щенка в стереотаксическом аппарате, поместив ушные штанги в ушные каналы и слегка затянув их.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Не чрезмерно затягивайте ушные штанги, так как череп новорожденного очень мягкий.
3. Поддерживайте стерильное хирургическое поле, распыляя все оборудование с 70% этанолом. Сделайте разрез 15 мм на голове с помощью скальпеля. Используя щипцы, аккуратно вытяните кожу головы от средней линии на четырех углах. Нанесите пропитанный физиологическим раствором хлопок под кожу, чтобы разрез был широко открыт ( рис. 1D ).
4. Найдите точки брегмы и лямбды на черепеИ пометьте их карандашом. Используйте иглу шприца (26 G), чтобы сделать два отверстия заусенцев в префронтальной коре (PFC) и гиппокампе.
   ПРИМЕЧАНИЕ. ПФУ располагается на расстоянии +1,8 мм сзади от брегмы и -0,5 мм в поперечном направлении от средней линии, в то время как гиппокамп расположен на -2,0 мм впереди брегмы и ± 0,5 мм в поперечном направлении от средней линии ( рис. 1D и E ). Глубина электрода должна быть не более чем на 2 мм ниже поверхности коры, чтобы минимизировать повреждение головного мозга.
5. Используйте щипцы для удержания электродов и вставьте контрольные и записывающие электроды в ПФУ и гиппокамп, соответственно. Применить эритромицин мазь вокруг электрода, чтобы избежать любой возможной инфекции. Закрепите электрод с помощью цианакрилата.
6. Подготовьте зубной акриловый цемент так, чтобы он имел клеевую и вязкую консистенцию. Нанесите зубной цемент, чтобы покрыть электроды и остальную часть черепа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно высушите череп перед нанесением зубного цемента.
7. Нанесите 5% -ную пикриновую кислоту на электроды, чтобы защитить их.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Вся процедура должна проводиться в вытяжном шкафу для поддержания стерильности.
8. Удалите животное из стереотаксической рамки и введете 300 мкл 10% глюкозы подкожно. Поместите его на обогреваемое одеяло для восстановления. Убедитесь, что животное теплое (37 ° C) и амбулаторное ( т.е. полностью выздоровевшее). Администрирование бупренорфин внутрибрюшинно (0,05 мг / кг) для послеоперационной боли.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не восстановит достаточное сознание (т.е. нормальное поведение и движение).
9. Верните щенка в его клетку с плотиной после того, как она вернется в сознание. Подождите два дня, пока животное не будет полностью выздоровело.

3. Запись ЭЭГ

1. После полного восстановления подсоедините электроды, имплантированные на черепе щенка, к усилителю в его собственной клетке. Подключите усилитель к аналогово-цифровому вИнвертор и присоедините преобразователь к компьютеру; Соединительные линии должны быть тщательно обработаны, чтобы они не запутались.
2. Выберите частоту дискретизации не менее 10000 Гц на блоке сбора данных для записи (полоса пропускания передатчика составляет 1-100 Гц). Убедитесь, что данные правильно взяты.
3. После получения базовой записи, вводите щенка внутрибрюшинно с помощью каиновой кислоты (KA) (2 мг / кг), чтобы вызвать эпилептические приступы. Через 15 мин после инъекции KA наблюдают и записывают эпилептические разряды. Приступы выработки через КА обычно являются физическими.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Длительность иктально-тонического воздействия составляет около 15,2 ± 0,9 с, продолжительность схватывания составляет примерно 62 ± 5 с. Приступы могут быть предотвращены у новорожденных крыс, давая IP инъекцию хлоралгидрата (400 мг / кг).
4. Сохраните оцифрованные данные и проанализируйте их с помощью пакетов программ обработки сигналов, таких как spike2. Выявить уровень мощности различных частотных компонентов в сигнале ЭЭГ новорожденных путем перфорацииЧто позволяет проводить анализ спектра мощности. Вычислите мощность в 1-минутном таймфрейме, найдя среднеквадратичную амплитуду от 1 до 100 Гц (диапазон ЭЭГ) ⁹ .

Результаты

Если вышеуказанные хирургические процедуры будут проведены должным образом, будет выполнена успешная запись ЭЭГ на один канал крысы новорожденного крысы. Через 10 минут после инъекции KA в виде нерегулярных движений и царапин, тремора и потери равновесия появляетс...

Обсуждение

Здесь мы сообщаем о хирургических и регистрационных процедурах для получения ЭЭГ у свободно перемещающихся щенков новорожденных крыс методом проводных ( рис. 3 ). Было высказано предположение, что щенок крысы P7-P12 находится в возрасте развития, соответствующем полнородному но?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer pin
Pincer	DELI Group Co., Ltd.
502 super glue	DELI Group Co., Ltd.	7144
Drying oven	Boxun	GZX-9140MBE
Isofluorane	RWD Life Science	902-0000-522
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	900-0068-507
Anesthesia apparatus	RWD Life Science	902-0000-510
Homeothermic Heating Device	Harvard Apparatus	K 024509
Amplifier Model 3000	A-M Systems	61558
Micro1401 Analog Digital converter	Cambridge Electronic Design Ltd.	4383	Data acquisition unit
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.