באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

Summary

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

Abstract

פיתוחם של כלים הגנום עריכה לתכנות יש להקל את השימוש של גנטיקה הפוכה כדי להבין את תפקידי רצפים גנומיים ספציפיים לשחק בתפקוד של תאים ואורגניזמים כולו. הגורם הזה כבר סייע מאוד על ידי הקדמה האחרונה של קריספר / מערכת-a Cas9 כלי תכליתי המאפשר לחוקרים כדי לתפעל את הגנום transcriptome כדי, בין שאר, לדפוק, להפיל, או לדפוק בגנים בתוך ממוקד דֶרֶך. לצורך לדפוק גן, קריספר / Cas9 בתיווך הפסקות פעמי גדיל לגייס את מסלול תיקון DNA שאינו הומולוגי שהצטרף-סוף להציג החדרה או מחיקת frameshift-גרימת נוקלאוטידים באתר ההפסקה. עם זאת, RNA מדריך פרט עלול לגרום תופעות מחוץ היעד רצויים, ועל מנת לשלול אלה, שימוש RNAs מדריך המרובה הכרחי. ריבוי זה של מטרות גם אומר הקרנה בנפח גבוה של שיבוטים נדרש, אשר בתורו מעלה את השימוש EFficient טכניקת תפוקה גבוהה כדי גנוטיפ השיבוטים בנוקאאוט. טכניקות גנוטיפ נוכחיות או סובלות מגבלות מובנות או לגרום לעלות גבוהה, ולכן טיווחו אותם מתאימים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, פרט לנו את הפרוטוקול לשימוש פלורסנט PCR, אשר משתמש DNA הגנומי של תא lysate הגולמי כתבנית, ולאחר מכן לפתור את שברי PCR באמצעות ג'ל אלקטרופורזה נימים. טכניקה זו היא מדויקת מספיק כדי לבדל הבדל בסיס-זוג אחד בין שבר ולכן היא מתאימה המעידה על הנוכחות או היעדר frameshift ברצף הקידוד של הגנים הממוקדים. ידיעה מדויקת זה מונע את הצורך ביעילות צעד רצף מאשר ומאפשרת למשתמשים לחסוך זמן ועלויות בתהליך. יתר על כן, טכניקה זו הוכיחה להיות תכליתי genotyping בתאי יונקים שונים של מקורות רקמות שונים הממוקדים ידי RNAs מדריך נגד גנים רבים, כפי שמוצג כאן ובמקומות אחרים.

Introduction

גישות גנטיות הפוכות אפשרו למדענים להבהיר את ההשפעות של שינויים ספציפיים בגנום על התא או אורגניזם שלם. לדוגמא, הביטוי של גן מסוים יכול להיות נחלש ידי גן מציאת ^{1, 2} (הפחתה חלקית) או נוקאאוט גנטי ^{3, 4} (אבלציה שלם) כדי לקבוע את ההשפעה שיש לכך על הפונקציה של התא או על התפתחות האורגניזם.

ג'ין ניסויים בנוקאאוט הפכו קלים יותר מאז כניסתה של nucleases לתכנות ספציפי ברצף, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs). עם זאת, האפיון היחסי האחרון של התקבץ וביניהם חוזר palindromic קצר בקביעות (קריספר) / מערכת Cas9 עשה את זה קל מאוד עבור כל מעבדה ברחבי העולם לבצע genניסויים בנוקאאוט דואר. בעיקרו של דבר, המערכת קריספר / Cas9 מורכב משני רכיבים-A חיוני RNA מדריך יחיד (sgRNA), אשר מכיר נקשר באמצעות השלמה הבסיס רצף מסוים בגנום, וכן endonuclease שנקרא Cas9. מה שבא אחרי מחייב פעולה מסוימת של מורכבות sgRNA-Cas9 על הדנ"א הגנומי הוא מחשוף פעמיים גדיל של דנ"א. זה, בתורו, מפעיל את מנגנון תגובת ניזק DNA בתא, אשר תוקן לאחר מכן באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) או הומולוגי המסלולים (HR). היות ומנגנון תיקון NHEJ (אבל לא את מנגנון HR) לעתים קרובות תוצאות ההחדרה האקראית או המחיקה של נוקלאוטידים באתר של תיקון, וכתוצאה מכך מוטציות החדרה / מחיקה (indel), הוא עלול לגרום מסגרת הקריאה של אקסון להעביר. מצב זה יכול לגרום נוק אאוט של הגן עקב סיום מוקדם של התרגום וריקבון בתיווך שטויות ^{5, 6,7.}

למרות הנוחות המוענקת על ידי כניסתה של מערכת קריספר / Cas9 ב שחסל גן, גנוטיפ של שיבוטים של תאים ממוקדים נותר צוואר בקבוק, במיוחד תפוקה גבוהה הגדרה ^{8, 9.} טכניקות קיימות או סובלות מגבלות מובנות גדולות או הם יקרים כלכליים. לדוגמה, assay שמאי T7E1, המהווה assay האנזימטית שמזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים ^10, הוא לא מסוגל להבחין בין שיבוטים wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים אשר אללים הם מוטציה זהה), שכן יש שיבוטים אלה אללים זהים ובכך לא מציג חוסר התאמה ב- DNA הרצף שלהם ^11. בנוסף, שימוש רצף סנגר, הנחשב את תקן זהב genotyping שיבוטי מוטציה, או בהתקנת תפוקה גבוהה אינו רצוי בשל עלותו הגבוהה. כאן, אנו מציגים Detפרוטוקול שמציק של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג'ל ניאון, אשר יכולה לעקוף את המגבלות של הטכניקות גנוטיפ קיימות האחרות, והוא שימושי במיוחד בביצוע מסך תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. שיטה זו היא טכנית פשוטה לביצוע, חוסך זמן ועלות.

Protocol

1. קבלת קריספר / Cas9 במיקוד המשובטים מתא בודד

1. תאי זרע HEPG2 על צלחת 6-היטב על 500,000 תאים לכל היטב 2 מ"ל של מדיום הנשר ללא אנטיביוטיקה Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). דגירה של 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. תאים Transfect עם הפלסמיד שיתוף להביע Cas9 ו sgRNA ספציפי נגד הגן של עניין באמצעות מגיב transfection המתאים לפי הוראות היצרן.
   הערה: לדוגמה, sgRNA ניתן לשכפל לתוך pSpCas9 (BB) -2A-GFP וקטור, כפי שתואר לעיל ^4.
3. החלף את מדיום 4 תרבות - 16 שעות לאחר transfection עם 2 מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה טרי.
4. אודות 48 שעות לאחר transfection, לאסוף השעית תא בודד על ידי trypsinizing התאים.
   1. Trypsinize התאים 0.2 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להוסיף 1 מ"ל של מדיום מחדש להשעות thoroughly.
5. מיין את התאים עבור שיבוטים GFP חיובי, כפי שתואר לעיל ^12, ולאסוף על 3500 תאים.
6. פלייט תאים ממוינים GFP חיובי על מנות 10 ס"מ על 500, 1000 ו 2000 תאים לכל צלחת ב 8 מ"ל של מדיום תרבות פניצילין /-בתוספת סטרפטומיצין. דגירה התאים ב C 37 ° ו 5% CO _2.
7. לשמור על התאים ב- C ° 37 ו 5% CO _2, החלפת בינוני בכל חמישה ימים, עד שהם גדלים לתוך מושבות תא בודד מספיק גדול כדי להיות גלוי לעין בלתי מזוינת. עבור רוב שורות תאים סרטניים, זה לוקח בערך שבועיים מיום ציפוי.
8. כאשר המושבות הם בגודל המתאים (כלומר, גלוי לעין בלתי מזוינת), להעביר מושבות הפרט בארות צלחת תרבות 96-היטב המכיל 200 μL של DMEM בתוספת 10% FBS.
   1. לשאוב מושבות התא הבודד באמצעות פיפטה 200-μL עם נפח קטן של מדיום. Resuspend התאים ביסודיות בבארות dividual ידי triturating מספר פעמים.
9. לשמור על התאים ב- C ° 37 ו 5% CO _2, החלפה הבינונית בכל חמישה ימים, עד שהם מגיעים 50 - 90% מפגש. עבור רוב שורות תאים סרטניים, זה לוקח בערך 24 - 48 h.

2. הדנ"א הגנומי חילוץ גולמיים בשיטת תמוגה ישירה

1. כאשר התאים מגיעים 50 - 90 מפגש%, להסיר כמה שיותר מדיום התרבות המבארת כמו ואקום יניקה רבה ערוצית באמצעות אפשרית או פיפטה רבה ערוצית.
2. להוסיף 25 μL של 0.05% טריפסין-EDTA (ללא פנול אדום) לתוך כל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
3. Resuspend התאים trypsinized ביסודיות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי הם מנותקים מן השטח פלסטיק.
4. צור לשכפל של שיבוטים הפרט באמצעות העברת כ 5 μL של ההשעיה תא בודד ל plat תרבות 96-היטב ריקe. הוספת 200 μL של מדיום התרבות היטב כל ולתחזק את התאים עד שיבוטים חיוביים מזוהים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי ניאון (ראה להלן). סדרתי להרחיב את תאי מנות 10 סנטימטרים או כל מידה אחרת של בחירה (ראה סעיף 7).
5. להוסיף 5 μL של ההשעיה תא בודד מן בשלב 2.3 כדי 10 μL של חיץ ישיר lyse תוצרת בית (10 מ"מ טריס pH 8.0, 2.5 EDTA מ"מ, 0.2 M NaCl, 0.15% SDS, ו 0.3% Tween-20) ¹² ב 96 גם צלחת PCR ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. בקצרה צנטריפוגה (להביא את הנוזל אל החלק התחתון של בארות).
6. הוספת 200 μL של המדיום תרבות ההשעיה ~ 15 μL של תא הנותרים משלב 2.3 ו דגירה 37 ° C ו 5% CO _2, יחד עם לשכפל משלב 2.4.
7. הנושא את lysates משלב 2.5 לתכנית רכיבת התרמית הבאה כדי להבטיח תמס שלם של התאים ושחרור של הדנ"א הגנומי: 65 מעלות צלזיוס למשך 30 ים, 8 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 65 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דק ', 97 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 8 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה, 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 97 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה, 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, ו 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה בקצרה lysates.
8. לדלל את lysates על ידי הוספת 40 μL מים nuclease חינם ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגות בקצרה. את lysates בדילול ניתן להשתמש מיד או לאחסן -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ללא אובדן משמעותי של איכות.

3. ביצוע פלורסנט PCR כדי להגביר קריספר / אזורים Cas9 יעד

1. פריימרים עיצוב שתי קדימה שכותרתו fluorophore (שניהם מסומנים בסוף 5' ) לכל אזור היעד קריספר / Cas9; חיתוך אתרים רחוקים יותר ממרחק 300 נ"ב זה מזה צריך להיחשב שני אזורי היעד נפרדים (למשל, תחל fluorophore שכותרתו ירוקה לשליטת wildtype ממוקדת ו פריימר שכותרתו fluorophore הכחול עבור קריספר / כפילים במיקוד Cas9; ראה הטבלה של מהאטרייה LS).
   1. לרכוש צבעי יסוד אלה שכותרתו קדימה פריימר הפוכה ללא תווית בהתאם. שים לב פריימרים יכול להיות מתוכנן באמצעות כל כלי הבחירה וכי amplicons צריך להיות 200 - 500 נ"ב ארוך.
2. בצע PCR כפי שתואר לעיל ¹² כדי להגביר אזורי היעד באמצעות פריימרים שכותרתו.
   1. השתמש 3 μL של lysates בדילול משלב 2.8 ב תגובת 20-μL (ראה טבלה 1) ואת תכנית רכיבת התרמית הבאה: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (1 מחזור); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 64 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 61 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); C 94 ° עבור 10 s, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 s, ו 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (35 מחזורים).
3. לפתור 5 μL של amplicons PCR על ג'ל agarose 1% כדי לבדוק הגודל היחסי של ampliconsss = "Xref"> 12.
   הערה: ביצוע שלב זה עבור כל הדגימות מעודדת אך לא הכרחית; פתרון מספר הדוגמות נבחר מספיק כדי להעריך את כמות amplicons נוכח הדגימות בכלל.

4. דוגמאות הכנת ג'ל אלקטרופורזה נימים

1. לדלל amplicons של wildtype (תאים הוריים לא ממוקדים) ו קריספר / DNA Cas9 במיקוד במי nuclease ללא כ 2.5 ng / μL. הקפד לדלל דגימת DNA wildtype מספיק כדי יתווספו לכל דגימת DNA ממוקד (מינימום של 0.5 μL של המדגם wildtype המדולל מדגם ממוקד נדרש).
2. מערבבים את wildtype בדילול ודגימות דנ"א ממוקד יחס שווה (למשל, לערבב 1 μL של מדגם wildtype עם 1 μL של מדגם ממוקד).
3. להוסיף 1 μL של amplicons המעורבת עד 8.7 μL של לפוראמיד deionized ו 0.3 μL של תקן גודל שכותרתו לצבוע צלחת 96-היטב PCR תואמת היווצרותו הגנטיתalyzer.
   הערה: שימוש תערובת הורים של לפוראמיד ואת תקן הגודל (כלומר, הכנה של premix של לפוראמיד ואת תקן הגודל בתוך 29: יחס 1 לפני התוספת של amplicons כדי להבטיח כמויות סטנדרטיות) מומלצת.
4. בחוזקה לאטום את צלחת ומחממים דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות להשתמש thermocycler PCR.
5. מניח את הצלחת על קרח מייד אחרי שלב חימום דגירה במשך דקות 3 לפחות.

5. ביצוע נימי ג'ל אלקטרופורזה על נתח גנטי

1. הגדרת פרמטרי assay, פרוטוקול מכשיר, ואת פרוטוקול קורא בגודל על תוכנת ג'ל אלקטרופורזה נימי מחוברת מנתח גנטי.
   הערה: צעד זה נדרש רק עבור בטווח אלקטרופורזה הראשון; ניתן לשמור את התוכנית לשימוש עתידי. עבור הרץ הבא, ולעבור ישירות אל שלב 5.2.
   1. לחצו על סמל "צור חדש פלייט" על לוח המחוונים תוכנה.
   2. תן rהאו"ם שם דמה ובחר את האפשרויות הבאות: מספר הבארות, 96; סוג פלייט, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; ו פולימר, POP7. לחץ על הכפתור "הקצאת פלייט תוכן".
   3. תחת "מבחנים" לחץ על "צור Assay חדש"; פאנל חדש יופיע.
   4. תן שם assay "Assay FPCR-CGE" ולבדוק כי "סוג יישום" מוגדר כראוי כמו "קטע".
   5. הגדרת פרוטוקול מכשיר על ידי לחיצה על כפתור "צור חדש" תחת "כלי פרוטוקול."
      1. גדר או לבחור באפשרויות והפרמטרים הבאים באיזורים המתאימים: Application סוג, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; פולימר, POP7; סט דיי, G5; Run Module, FragmentAnalysis; שם פרוטוקול, פרוטוקול Instrument FPCR-CGE; טמפרטורת התנור, 60 ° C; הפעל מתח, 19.5 קילו וולט; מתח טרום ריצה, 15 קילו; מתח הזרקה, 1.6 קילו וולט; Run Time, 1330 ים; זמן טרום ריצה, 180 ים; זמן הזרקה, 15 s; נתוני עיכוב, 1 ים.
   6. Clאיכס על הכפתור "החל Assay" ואז "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
   7. הגדרת פרוטוקול קורא בגודל ידי לחיצה על כפתור "צור חדש" תחת "Sizecalling לפרוטוקול."
      1. הגדר או לבחור באפשרויות ופרמטרים הבאים באיזורים המתאימים: פרוטוקול שם, FPCR-CGE Sizecalling לפרוטוקול; גודל סטנדרטי, GS500 (-250) LIZ; גודל-המתקשר, v1.1.0 SizeCaller; הגדרות ניתוח, -; ניתוח טווח, מלא; מדידות טווח, מלא; גודל שיחות שיטה, מקומי דרום; שיא פריימר, הווה; כחול, ירוק, כתום ערוצים, (בדוק); גובה שיא מינימום, 175 עבור כל הערוצים; השתמש החלקה, אין; השתמש Baselining (Baseline חלון (נק ')), (בדוק) 51; מינימום Peak Half רוחב, 2; גודל חלון שיא, 15; פולינום ממעלה, 3; סף מדרון שיא התחל, 0.0; סף מדרון Peak End, 0.0; הגדרות QC, -; איכות גודל, -; להיכשל אם הערך הוא <0.25; Pass אם הערך הוא <0.75; נניח ליניאריות מ 0 נ"ב ל 800 BP; ודגל Pull-Up להניע אם יחס Pull-Up ≤ 0.1 ו- Pull-Up סרוק ≤ 1.
   8. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן על כפתור "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
   9. ודא כי assay נשמר על ידי לחיצה על "שמור לספרייה" כפתור שוב ולצאת הפאנל על ידי לחיצה על כפתור "סגור".
   10. חזרה אל הדף "פלייט תוכן הקצאה", לחץ על "צור חדש שם קובץ אמנה" הקישור תחת "אמנות שם קובץ."
   11. שם התוכנית "FPCR-CGE שם הקובץ."
   12. תחת "תכונות זמינות," לבחור את המאפיינים הרצויים שיופיעו שם הקובץ (כגון "תאריך Run", "זמן של הפעלה," "ובכן עמדה," ו "שם לדוגמא"). בחר את מיקום הקובץ הרצוי שבו התוצאות בטווח תישמרנה.
   13. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן"שמור לספרייה" על הלחצן כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
   14. חזרה על "תוכן הקצאת פלייט" דף, לחץ על הקישור "צור חדש תוצאות הקבוצה" תחת "קבוצות תוצאות."
   15. שם התוכנית "FPCR-CGE תוצאות קבוצות."
   16. תחת "תכונות זמינות," לבחור את המאפיינים הרצויים שיופיעו שם הקובץ (כגון "Assay שם"). בחר את מיקום הקובץ הרצוי שבו התוצאות בטווח תישמרנה.
   17. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן על כפתור "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
2. הגדרת התוכנית והשג אלקטרופורזה המנוהלים על ידי ביצוע השלבים הבאים.
   1. עבור אל מרכז השליטה ולחץ על "פלייט חדש צור" סמל.
   2. שם בטווח כפי רצוי (לעיון קל, לכלול את התאריך, שורת תאים, ואת שם גן). בחר את האפשרויות הבאות: מספר הבארות, 96; סוג פלייט, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; ו פולימר, POP7. לחץ על הכפתור "הקצאת פלייט תוכן".
   3. לייבל כל טוב של המדגם על פי הצורך (למשל, מדגם יכול להיקרא בשם "NC" כדי לציין כי גם היא ביקורת שלילית).
   4. פי אמנות שם קובץ " "מבחנים"," ו "קבוצות תוצאות" התיבות, לחץ על "הוסף מספריית הקישור" ובחר את התוכניות שנוצרו בשלב 5.1.3 5.1.17.
   5. הדגש את כל הבארות להיות מנותחות ובחר את התוכניות הרלוונטיות תחת "מבחנים", "אמנות שם קובץ," ו "קבוצות תוצאות" על ידי סימון התיבות לידם.
3. לפני הטעינה את הצלחת על המגש של המנתח הגנטי, להחיל את הגומייה על הצלחת 96-היטב ולשים את הצלחת האטומה במקרה הפלסטיק שמגיע עם המנתח הגנטי.
4. לחץ על כפתור "המגש" בחזית של המנתח הגנטי, וכאשר מחדש המגשכואב הקדמי של הציוד, לפתוח את הדלת ואת לטעון את הצלחת העטופה על המגש. ודא כי הצלחת נעולה במקום ולאחר מכן לסגור את הדלת.
5. לחץ על "פלייט Link עבור Run" כפתור.
6. ב "טען צלחות עבור Run" הדף, לעשות בדיקה סופית על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים בתנאים נכונים וכדי.
7. לחץ על כפתור "הפעל התחל". כל ריצה של 24 דגימות (בארות 3x8 הראשונות של צלחת 96-היטב) לוקחת פחות מ 55 דקות כדי להשלים.

6. ניתוח של electropherogram לקבוע הבדלים-זוג Base

1. כאשר בטווח ג'ל אלקטרופורזה הנימים יושלם, לפתוח את תוכנת הניתוח לנתח את התוצאות.
2. לחץ על "דוגמאות הוסף לפרויקט" סמל ולחפש את התיקייה המכילה את קבצי הריצה. תזכיר משלב 5.1.12 המיקום שהוקצה של קבצי תוצאות.
3. בחר את כל קבצי התוצאות של כל זריקה בטווח הושלם CLאיכס על הכפתור "הוסף לרשימה"; שמות הקבצים האלה מתחילים עם "inj" ולהכיל את הפרטים של הריצה.
4. לחץ על "הוסף לנתח" כפתור כדי להמשיך עם הניתוח.
5. בחר את כל הדגימות בטווח ידי לחיצה על המדגם הראשון וגרירת הסמן למטה כדי המדגם האחרון ולאחר מכן לחץ על הסמל "מגרש תצוגה".
6. כדי לבדוק את איכות תקן הגודל, לפתוח את הערוץ הכתום של התוצאות על ידי בדיקת הסמל הכתום ביטול סימון שאר הסמלים בצבעים; זה חשוב לוודא כי גנאי הגודל הוא מדויק ואמין.
7. כדי להציג את הפסגות מתאימות שהברים נגזר משליטתה הממוקדת ואת השיבוטים הממוקדים, לבדוק את הסמלים הכחולים וירוקים לפתוח קריאות מערוצים אלה.
8. מניח את הסמן מעל הציר האופקי של עלילת התוצאות הראשונה באמצעות לחצן עכבר ימני כדי לבחור "נוף מלא." גלול למטה כדי להציג את כל התוצאות במבט חטוף כדי לקבועאם יש בעיה רצינית עם הריצה. כדי להתמקד בטווח מסוים של ערכים, לחץ לחיצה ימנית על העכבר על הציר הרלוונטי של העלילה, לבחור "התמקד ...," והזין את טווח ערכים של עניין.
   הערה: בעיה עיקרית פוטנציאל אחת היא שכל הדגימות לתת פסגות בעצימות נמוכות. זוהי בדרך כלל עקב האחסון הממושך של amplicons שכותרתו fluorophore לפני ריצת הנימים אלקטרופורזה או יתר הדילול של amplicons, אשר ניתן לתקן בקלות על ידי חזרה על צעד PCR או על ידי דילול amplicons באמצעות גורם לדילול נמוך, בהתאמה.
9. כדי לשמור את התוצאות, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
   1. ודא כי הערוצים הכחולים וירוקים נבחרים ולחץ על הסמל "לוח מדידות".
   2. שמור טבלת ערכי בפורמט מופרד באמצעות טאבים טקסט (txt) על ידי פתיחת "קובץ" ובחירת "ייצוא טבלה." שם הקובץ בהתאם ובחר את מיקום הקובץ של בחירה.
   3. כדי להציל את העלילהים של ריצה בפורמט PDF, ללכת "קובץ" ולחץ על האפשרות "הדפס". בחר הסופר PDF הרלוונטיים ולחץ על "הדפס". שם הקובץ בהתאם ובחר את מיקום הקובץ של בחירה.
10. כדי לחשב את ההבדל בגודל של שברי נגזר מלאה wildtype ממוקדות ואת קריספר / כפילים Cas9 במיקוד, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
    1. פתח את הטקסט טאבים (.txt) משלב 6.9.2 באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים. הטבלה צריכה לכלול עמודות חשובות ארבע הבאים: "שיא דיי / מדגם" (מה שמעיד על ערוץ כחול או ירוק), "שם קובץ לדוגמא" (התווים הראשונים מצביעים באר או שם מדגם), "גודל" (המציין את הגודל שבר נקרא), ו "גובה" (המציין את עוצמת הקרינה של שיא).
    2. כדי לייחד את פסגה רלוונטית, להוציא אלה שאינם בטווח הגודל הצפוי.
       הערה: בדרך כלל, מוטציות indel לעתים נדירות לגרום יותרמ הבדל 100-BP בגודלם; וכך, פסגות שגודלם שונים על ידי יותר מ 100 נ"ב מהשיא המלא wildtype (השיא דומיננטי בערוץ הירוק) אינן נכללות. ניתן לעשות זאת בקלות על ידי שימוש "בין" אפשרות תחת פונקציית "עיצוב מותנה" בגיליון האלקטרוני.
    3. כדי להסיר פסגות שאינו ספציפי, אשר הם נבדלים ברמת רקע, השתמש באפשרות "פחות מ-" תחת פונקציית "עיצוב מותנה" בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לשלול פסגות אשר לגבהים נמוכים 2000 יחידות. ערך חיתוך זו נקבע באופן אמפירי ולכן יכול להיות מותאם שבו ראה לנכון.
    4. חשב את ההבדל בגודל מקטעים בין כל אחת הפסגות וכתוצאה מכך את הערוץ הכחול (קריספר / Cas9 במיקוד שיבוטים) ואת השיא הבלעדי בערוץ הירוק (שליטת wildtype הממוקדת) על ידי הפחתת האחרון מהראשון.
       הערה: חשוב להשתמש בערכים המיוחסת לכל נימי electrophorמדגם esis, כפי ייתכנו הבדלים-מדגם הבין את גודל שבר של הבקרה wildtype.
    5. לעגל את הערכים למספר השלם הקרוב ביותר כדי לקבוע את מספר זוגות בסיסים כי הוחדרו או נמחקו מן, אם בכלל, את הרצף הגנומי של השאלה. כאשר לאחר שחיסל הגן הוא עניין, שיבוטים בחר אשר מוטציות indel אינם של בכפולות של 3 נ"ב כדי להבטיח שיש frameshift ברצף קידוד.

אימות 7. מעמד נוק המשובטים

1. להרחיב שיבוטים בנוקאאוט בודדים מתוך צלחת 96-היטב (מ צעדים 2.4 ו 2.6) לצלחת 24 היטב על ידי trypsinizing התאים באמצעות 25 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. הוספת 125 μL של המדיום (DMEM בתוספת 10% FBS) התאים trypsinized מחדש להשעות באופן יסודי.
3. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר כמה שיותר הבינוני כמו יניקה אפשרית באמצעות ואקום או טפטפו, להשעות את התא גלול 500 μL של מדיום, ולהעביר את ההשעיה לתא גם צלחת 24-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO ₂ עד התאים מגיעים למפגש 80-90%.
5. הרחב את שיבוטי הפרט סדר מהצלחת 24-היטב צלחת 6-היטב מהצלחת 6-היטב צלחת 10 סנטימטרים כאשר הם מגיעים 80 - מפגש 90% על ידי צעדים חוזרים 7.1 ל 7.4, באמצעות הכרכים הבאים: 50 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו 150 μL של המדיום (להרחבת מהצלחת 24-היטב צלחת 6-היטב) ו 200 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו 1 מ"ל של מדיום (להרחבת מן 6- גם צלחת על צלחת 10 ס"מ).
6. קציר שיבוטים כשהם מגיעים 80 - 90% המפגש ידי trypsinizing התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום (DMEM בתוספת 10% FBS) התאים trypsinized ו resuspeND ביסודיות.
8. מעבירים את ההשעיה תא באותה מידה לשתי צינורות 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את המדיום ככל האפשר. חלק אחד של התאים הוא להפקת DNA גנומי והשני הוא עבור חילוץ חלבון כולל.
9. לצורך אימות באמצעות רצף סנגר, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
   1. חלץ הדנ"א הגנומי של שיבוטים כפי שתואר לעיל ^12.
   2. בצעו הגברה PCR של האזור פורש באתר היעד קריספר / Cas9, כמתואר בסעיף 3.2, אבל להשתמש פריימרים ללא תווית. אין להשתמש פריימרים שכותרתו עבור שלב זה, כמו הקרינה מן התג תפריע צעד הרצף סנגר עוקב.
   3. לטהר את amplicons באמצעות ערכת ניקוי PCR, כפי שתואר לעיל ^12.
   4. רצף amplicons מטוהרים באמצעות פריימרים PCR משמש צעד 7.9.2 לקבוע את הגנוטיפ של שיבוטים, כמתואר previously ^12.
10. לצורך האימות באמצעות ניתוח כתם מערבי, לחלץ חלבון הכולל מתאי wildtype ו השיבוטים ממוקדים, כפי שתואר לעיל ^12.
    1. ביצוע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כנגד החלבון של גן המטרה, כפי שתואר לעיל ^12; שיבוט נוקאאוט אמיתי נטול הביטוי של החלבון.

תוצאות

ניאון טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימים המתוארות כאן צפויה לחול בכל אזור ניתן למיקוד בגנום כמעט בכל קו תא ניתן למסירת דנ"א זרה. הוכחנו היישום שלה בעבר על ידי מיקוד שלושה גנים בקו תא סרטן מעי גס ^12. הנה, אנחנו מראים את יעילותו genotyping שורת ת...

Discussion

הדפיקות מתוך גן ספציפי בקו תא מודל של בחירה הפכו לשגרת הבהרת התפקיד כי הגן מתנגן כי בהקשר הסלולר בפרט. למעשה, מספר מסכי הגנום זמינים כרגע המשתמשים במערכת קריספר / Cas9 למקד כמעט כל גנים אנושיים הידועים בגנום ^{14, 15, 16.} עם מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003