Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Zusammenfassung

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von programmierbaren genom Editing-Tool hat die Verwendung von Reverse Genetik erleichtert die Rollen spezifische genomischen Sequenzen spielen in der Funktion von Zellen und ganzen Organismen zu verstehen. Diese Ursache wurde durch die kürzliche Einführung des CRISPR / Cas9 system eines vielseitiges Werkzeug, das Forscher ermöglicht zu manipulieren das Genom und Transkriptom, um unter anderem, knock out, knock down, oder Klopfen in Genen in einem gezielten enorm geholfen Weise. Für die Zwecke der Ausschlagen ein Gens, CRISPR / Cas9 vermittelte Doppelstrangbrüche, die nicht-homologe end-joining DNA-Reparaturwegs rekrutieren, um die Frameshift-verursachende Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Bruchstelle einzuführen. Jedoch kann eine einzelne Führungs RNA unerwünschte Nebeneffekte verursachen, und diese auszuschließen, die Verwendung von mehreren Führungs RNAs notwendig. Diese Vielzahl von Zielen, bedeutet auch, dass ein High-Volume-Screening von Klonen benötigt wird, was wiederum die Verwendung eines ef bittetreichend Hochdurchsatz-Technik, um den Knockout-Klone genotypisieren. Aktuelle Genotypisierung Techniken entweder von inhärenten Einschränkungen leiden oder hohe Kosten entstehen, damit sie nicht geeignet für Hochdurchsatz-Zwecke zu machen. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-PCR, die genomische DNA aus einem rohen Zelllysat als Templat verwendet, und dann die Lösung der PCR-Fragmente über Kapillargelelektrophorese. Diese Technik ist genau genug, um eine Basenpaarunterschied zwischen Fragmenten zu unterscheiden, und somit ist ausreichend, in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Rasterverschiebung in der kodierenden Sequenz des Zielgens anzeigt. Diese genaue Kenntnis schließt effektiv die Notwendigkeit für eine bestätigende Sequenzierung Schritt und ermöglicht es Benutzern, Zeit und Kosten in den Prozess zu speichern. Darüber hinaus hat diese Technik in Genotypisierung verschiedene Säugetierzellen verschiedenen Gewebe Ursprünge durch Führungs RNAs gegen zahlreiche Gene gezielt zu vielseitig erwiesen, wie hier und anderswo gezeigt.

Einleitung

Reverse genetische Ansätze erlaubt haben Wissenschaftler die Auswirkungen von spezifischen Veränderungen im Genom auf der Zelle oder ganzen Organismus aufzuklären. Zum Beispiel kann die Expression eines bestimmten Gens durch Knock-Down ^{1, 2} (teilweise Reduktion) oder Gen - Knockout - ^{3, 4} (vollständige Ablation), um den Effekt zu bestimmen , abgeschwächt wird , dass diese auf der Funktion der Zelle oder auf der Entwicklung des Organismus.

Gen-Knockout-Versuche haben sich einfacher, da die Einführung von sequenzspezifischen programmierbaren Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs) und Transkriptions-Aktivator-like-Effektor Nukleasen (TALENS). die relativ neue Charakterisierung des gruppierte jedoch regelmäßig kurze Palindrom-Wiederholung (CRISPR) / Cas9 System hat es extrem einfach für jedes Labor auf der ganzen Welt durchzuführen gen setztee-Knockout-Experimente. Im Wesentlichen besteht die CRISPR / Cas9 System aus zwei wesentlichen Komponenten eines einzigen Führungs-RNA (sgRNA), die über die Basis Komplementarität zu einer bestimmten Sequenz in dem Genom und binden erkennt, und eine Endonuclease Cas9 genannt. Die Folgen der spezifischen Bindung und Wirkung des sgRNA-Cas9 Komplexes auf genomische DNA ist die Doppelstrang-Spaltung von DNA. Dies wiederum löst den DNA-Schadensantwort-Mechanismus in der Zelle, die anschließend über die nicht-homologen end-joining (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) Wege repariert wird. Da der NHEJ Reparaturmechanismus (aber nicht der HR-Mechanismus) häufig in der zufälligen Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Stelle der Reparatur führt, was zu einer Insertion / Deletion (indel) Mutationen, kann es der Leserahmen eines Exons führen zu verschieben. Dies kann in den Knockout des Gens durch vorzeitige Termination der Translation und Nonsense-vermittelten Zerfalls ^{5, 6} ergeben sich ^dann,7.

Trotz der Bequemlichkeit durch die Einführung des CRISPR / Cas9 Systems liefert in Klopfen ein Gens aus der Genotypisierung von Klonen von Zielzellen bleibt ein Engpass, insbesondere in einem Hochdurchsatz - ⁸ Einstellung ^9. Bestehende Techniken entweder leide große inhärente Einschränkungen oder sind finanziell kostspielig. Zum Beispiel kann der Vermesser oder T7E1 Assay, der ein enzymatischer Assay, das Fehlpaarungen in DNA erkennt Duplexen ¹⁰ ist nicht in der Lage zwischen Wildtyp- Klone und homozygoten Mutanten (Klone , deren Allele mutiert sind identisch), da diese Klone haben identische Allele und damit zu unterscheiden stellt keine Fehlpaarungen in ihrer DNA - Sequenz ^11. Darüber hinaus ist die Verwendung von Sanger-Sequenzierung, die der Goldstandard in der Genotypisierung mutierten Klone betrachtet wird, in einem Hochdurchsatzaufbau ist nicht wünschenswert, aufgrund seiner hohen Kosten. Hier präsentieren wir eine detailed Protokoll der fluoreszierenden PCR-Kapillar-Gelelektrophorese-Technik, die die Grenzen der anderen vorhandenen Genotypisierung Techniken umgehen kann, und ist besonders nützlich, um einen Hochdurchsatz-Bildschirm von Nuklease-vermittelte Knockout-Klone in der Durchführung. Dieses Verfahren ist technisch einfach durchzuführen und spart Zeit und Kosten.

Protokoll

1. Gewinnung CRISPR / Cas9-bezogene Einzelzellklone

1. Seed HepG2-Zellen auf einer 6-Well-Platte bei 500.000 Zellen pro Vertiefung in 2 ml antibiotikafreien Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren für 24 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Transfizieren von Zellen mit Plasmid-co-exprimierenden Cas9 und spezifische sgRNA gegen das Gen von Interesse ein geeignetes Transfektions-Reagenz nach den Angaben des Herstellers.
   HINWEIS: Zum Beispiel kann in den sgRNA pSpCas9 (BB) -2a-GFP - Vektor geklont wird, wie zuvor beschrieben , ^4.
3. Ersetzen des Kulturmedium 4 - 16 h nach der Transfektion mit 2 ml frischem antibiotikafreien Medium.
4. Über 48 Stunden nach der Transfektion sammeln Einzelzellsuspension durch die Zellen trypsinisiert.
   1. Trypsinize die Zellen in 0,2 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. 1 ml Medium und resuspendieren thoroughly.
5. Sortieren der Zellen auf GFP-positive Klone, wie zuvor beschrieben ¹² und etwa 3500 Zellen sammeln.
6. Platte, die die GFP-positive sortierten Zellen auf 10-cm-Schalen bei 500, 1000 und 2000 Zellen pro Schale in 8 ml Penicillin / Streptomycin ergänztem Kulturmedium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2.
7. Pflegen Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ und ersetzt das Medium alle fünf Tage, bis sie Einzelzellkolonien groß genug wachsen in dem bloßen Auge sichtbar zu sein. Für die meisten Krebszelllinien, dauert dies etwa zwei Wochen ab dem Tag der Plattierung.
8. Wenn die Kolonien der entsprechenden Größe (dh, mit bloßem Auge), übertragen einzelne Kolonien in den Vertiefungen einer 96-Well - Kulturplatte , die 200 & mgr; l DMEM mit 10% FBS ergänzt.
   1. Aspirieren Einzelzellkolonien eine 200-ul-Pipette mit einem kleinen Volumen an Medium. Resuspendieren der Zellen gründlich in inDividuum Brunnen durch mehrmaliges Verreiben.
9. Pflegen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2, das Medium zu ersetzen alle fünf Tage, bis sie 50 erreicht - 90% Konfluenz. Für die meisten Krebszelllinien, nimmt dies etwa 24 bis 48 h.

2. Extrahierung Crude Genomic DNA, die eine direkte Lyse-Methode unter Einsatz

1. Wenn die Zellen 50 erreichen - 90% Konfluenz entfernen, so viel von dem Kulturmedium aus den Vertiefungen wie möglich unter Verwendung von Mehrkanal-Vakuumansaugung oder einer Mehrkanalpipette.
2. Zugabe von 25 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA (ohne Phenolrot) in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 7 min.
3. Resuspendieren der Zellen trypsiniert gründlich durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie von der Kunststoffoberfläche abgelöst werden.
4. Erstellen einer Replikat der einzelnen Klone durch etwa 5 & mgr; L der Einzelzellsuspension auf eine leere 96-Well-Kultur plat Transferierene. Zugabe von 200 ul Kulturmedium zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellen halten, bis positive Klone identifiziert werden unter Verwendung von fluoreszierenden PCR-Kapillar-Elektrophorese (siehe unten). In Reihe, die Zellen auf 10-cm-Schalen erweitern oder andere Skala der Wahl (siehe Abschnitt 7).
5. Zugabe von 5 & mgr; L der Einzelzellsuspension aus Schritt 2,3 bis 10 & mgr; l von hausgemachtem Direkt lyse - Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS und 0,3% Tween-20) , ¹² in einem 96-Well-PCR-Platte und durch Auf- und Abpipettieren mehrmals gründlich mischen. Zentrifuge kurz (um die Flüssigkeit zu bringen bis auf den Boden der Vertiefungen).
6. Zugabe von 200 ul Kulturmedium zu dem verbleibenden ~ 15 & mgr; l der Zellsuspension aus Schritt 2.3 und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO ₂ zusammen mit dem Replikat aus Schritt 2.4.
7. Subjekt den Lysaten aus Schritt 2.5 der folgenden Temperaturwechselprogramm, um eine vollständige Lyse der Zellen und die Freisetzung von genomischer DNA: 65 ° C für 30 s, 8 ° C für 30 s, 65 ° C für 1,5 min, 97 ° C für 3 min, 8 ° C für 1 min, 65 ° C für 3 min, 97 ° C für 1 min, 65 ° C für 1 min und 80 ° C für 10 min. Zentrifugieren Sie die Lysate kurz.
8. Verdünne die Lysate durch Zugabe von 40 & mgr; l Nuklease-freies Wasser und gut mischen einem Vortexer. Zentrifuge kurz. Die verdünnten Lysate können sofort oder bei -20 ° C für mehrere Monate ohne nennenswerten Qualitätsverlust gelagert werden.

3. Fluorescent PCR Performing CRISPR / Cas9 Zielregionen Amplify

1. Design zwei Fluorophor-markierten Vorwärtsprimer (sowohl am 5' Ende markiert) für jede CRISPR / Cas9 Zielregion; Schnittstellen , die als 300 bp weiter voneinander als zwei separate Zielregionen (zB grün Fluorophor-markierten Primers für ungezielte Wildtyp- Steuerung und blauen Fluorophor-markierten Primers für die CRISPR / Cas9 gezielte Klone in Betracht gezogen werden sollte, siehe Tabelle of Materia ls).
   1. Beschaffen Sie diesen markierten Forward-Primer und einen unmarkierten Reverse-Primer entsprechend. Beachten Sie, dass Primer kann jedes Werkzeug der Wahl gestaltet werden, verwenden und dass die Amplicons sollten 200 - 500 bp lang.
2. Führen PCR , wie vorstehend beschrieben ¹² Zielregionen zu verstärken , um die markierten Primer verwendet.
   1. Verwenden 3 ul des verdünnten Lysate aus Schritt 2.8 in einer 20-ul - Reaktion (siehe Tabelle 1) und das folgenden Temperaturzyklus Programm: 94 ° C für 10 Minuten (1 Zyklus); 94 ° C für 10 s, 64 ° C für 30 s, 68 ° C für 1 min (4 Zyklen); 94 ° C für 10 s, 61 ° C für 30 s, 68 ° C für 1 min (4 Zyklen); 94 ° C für 10 s, 58 ° C für 30 s, 68 ° C für 1 min (4 Zyklen); 94 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s, und 68 ° C für 1 min (35 Zyklen).
3. Resolve 5 ul der PCR-Amplikons auf einem 1% Agarose-Gel für die Größe und die relative Menge des Amplicons zu überprüfenss = "xref"> 12.
   HINWEIS: Die Durchführung dieser Schritt für alle Proben ist erwünscht, aber nicht erforderlich; eine ausgewählte Anzahl von Proben der Lösung ist ausreichend, um die Menge des Amplikons, die in den Proben in der Regel zu schätzen.

4. Vorbereitung Proben für die Kapillar-Gel-Elektrophorese

1. Verdünnte Amplicons von Wildtyp- (ungezielte parentalen Zellen) und CRISPR / Cas9 gezielte DNA in Nuclease-freiem Wasser auf etwa 2,5 ng / & mgr; L. Stellen Sie sicher genug Wildtyp- DNA-Probe zu verdünnen, um jede gezielte DNA-Probe (ein Minimum von 0,5 & mgr; l der verdünnten Probe pro Wildtyp- gezielte Probe erforderlich ist) hinzugefügt werden.
2. Mischen Sie die verdünnte Wildtyp- und gezielte DNA - Proben in gleichem Verhältnis (beispielsweise mischen 1 ul Wildtyp- Probe mit 1 & mgr; l von gezielter Probe).
3. 1 & mgr; l der gemischten Amplikons auf 8,7 & mgr; l deionisiertem Formamid und 0,3 uL farbstoffmarkierte Größenstandards in einer 96-Well-PCR-Platte, die mit den genetischen einer kompatibelalyzer.
   HINWEIS: Die Verwendung eines Master - Mix des Formamids und die Größe Standard (dh eine Herstellung einer Vormischung des Formamids und die Größe Standard in einem 29: 1 - Verhältnis vor der Zugabe von Amplikons standardisierte Mengen zu gewährleisten) wird empfohlen.
4. Dicht die Platte abzudichten, und die Proben bei 95 ° C für 3 Minuten unter Verwendung eines PCR-Thermocycler beheizen.
5. Die Platte wird auf Eis unmittelbar nach dem Erwärmungsschritt und Inkubation für mindestens 3 min.

5. Durchführen von Kapillar-Gel-Elektrophorese auf einem Genetic Analyzer

1. Richten Sie Assayparameter, Protokoll Instrument und Größe-calling Protokoll auf der Kapillargelelektrophorese Software einen Genetic Analyzer verbunden.
   Hinweis: Dieser Schritt ist nur für die erste Elektrophoreselauf erforderlich ist; das Programm kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Für die nachfolgenden Läufe, geradeaus 5.2 zu treten.
   1. Klicken Sie auf den „Create New Plate“ Symbol auf der Software-Armaturenbrett.
   2. Geben Sie die run ein Dummy-Namen und wählen Sie die folgenden Optionen: Anzahl der Brunnen, 96; Plattentyp, Fragment; Kapillar-Länge, 50 cm; und Polymer, POP7. Klicken Sie auf das „Assign Platte Inhalt“ -Taste.
   3. Unter „Assays“ auf „Neue Assay erstellen“; eine neue Platte erscheint.
   4. Nennen Sie den Test „FPCR-CGE Assay“ und prüfen, ob „Application Type“ korrekt eingestellt ist als „Fragment“.
   5. Richten Sie Instrument Protokoll, indem Sie auf den „Create New“ Schaltfläche unter einem Klick auf „Instrument Protocol.“
      1. Set oder wählen Sie die folgenden Optionen und Parameter in den entsprechenden Bereichen: Anwendungstyp, Fragment; Kapillar-Länge, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Protokollname, FPCR-CGE Instrument Protocol; Ofentemperatur, 60 ° C; Laufspannung, 19,5 kV; Vorlauf- Spannung, 15 kV; Injektionsspannung, 1,6 kV; Laufzeit, 1.330 s; Pre-Laufzeit, 180 s; Injektionszeit, 15 s; und Datenverzögerung, 1 s.
   6. Click auf „Anwenden auf Assay“ klicken und dann „Save to Library“, um das Programm zu speichern. Schließen Sie die Platte, um fortzufahren.
   7. Stellen Sie eine Größe-Aufruf Protokoll bis auf den „Create New“ Schaltfläche unter einem Klick auf „Sizecalling Protokoll.“
      1. Set oder wählen Sie die folgenden Optionen und Parameter in den entsprechenden Bereichen: Protokollname, FPCR-CGE Sizecalling Protokoll; Größe Standard, GS500 (-250) LIZ; Größe-Anrufer, SizeCaller v1.1.0; Analyseeinstellungen, -; Analyse: Bereich, Voll; Leimungsbereich, Voll; Größe Rufmethode, Lokale Süd; Primer Peak, präsentieren; Blau, grün, orange Kanäle, (Check); Minimum-Spitzenhöhe, 175 für alle Kanäle; Verwenden Glättung, keine; Verwenden Baselining (Baseline-Fenster (Pts)), (Check) 51; Minimum-Spitzenhalbbreite, 2; Peak Window Size, 15; Polynomgrad, 3; Slope Threshold Peak-Start, 0,0; Slope Threshold Peak-End, 0,0; QC-Einstellungen, -; Größe Qualität, -; Fehlschlagen, wenn Wert <0,25; Geben, wenn Wert <0,75; Es sei angenommen, Linearität von 0 bis 80 bp0 bp; und Actuate Pull-Up-Flag, wenn Pull-Up-Verhältnis ≤ 0,1 und Pull-Up-Scan ≤ 1.
   8. Klicken Sie auf „Übernehmen, um Assay“ und dann die „Save to Library“, um das Programm zu speichern. Schließen Sie die Platte, um fortzufahren.
   9. Stellen Sie sicher, dass der Test durch Klicken auf den „Save to Library“ -Taste noch einmal und verlassen Sie das Panel durch Klicken auf die Schaltfläche „Schließen“ gespeichert wird.
   10. Zurück im „Assign Platte Inhalt“ -Seite, klicken Sie auf den „Create New File Name Convention“ -Link unter „Dateinamenskonventionen.“
   11. Nennen Sie das Programm „FPCR-CGE Dateiname.“
   12. Unter „Verfügbare Attributen“, wählen Sie die gewünschten Attribute, die in den Dateinamen (wie „Datum des Run“, „Time of Run“, „Gut Position“ und „Sample Name“) angezeigt. Wählen Sie den Speicherort der Datei gewünscht, wo die Ergebnisse des Laufs gespeichert werden.
   13. Klicken Sie auf „Übernehmen, um Assay“ und danndie "Save to Library", um das Programm zu speichern. Schließen Sie die Platte, um fortzufahren.
   14. Zurück auf der Seite „Platte Inhalt zuordnen“, klicken Sie auf den „Create New Ergebnisse Gruppe“ -Link unter „Ergebnisse Gruppen.“
   15. Nennen Sie das Programm „FPCR-CGE Ergebnisse Gruppen.“
   16. Unter „Verfügbare Attribute“, wählen Sie die gewünschten Attribute, die in den Dateinamen (wie „Assay Name“) angezeigt. Wählen Sie den Speicherort der Datei gewünscht, wo die Ergebnisse des Laufs gespeichert werden.
   17. Klicken Sie auf „Übernehmen, um Assay“ und dann die „Save to Library“, um das Programm zu speichern. Schließen Sie die Platte, um fortzufahren.
2. Stellen Sie das Programm für eine Elektrophorese laufen bis unten durch die folgenden Schritte aus.
   1. Gehen Sie auf dem Armaturenbrett und klicken Sie auf den „Create New Plate“ Symbol.
   2. Benennen den Lauf nach Wunsch (für eine einfache Referenz, umfasst das Datum, die Zelllinie, und Gen-Namen). Wählen Sie die folgenden Optionen: Anzahl der Brunnen, 96; Plattentyp, Fragment; Kapillar-Länge, 50 cm; und Polymer, POP7. Klicken Sie auf das „Assign Platte Inhalt“ -Taste.
   3. Beschriften jede Vertiefung der Probe , wie gewünscht (zB kann eine Probe genannt werden „NC“ , um anzuzeigen , dass das Bohrloch eine negative Kontrolle).
   4. Unter den „Assays“, „Dateinamenskonventionen“ und „Ergebnisse Gruppen“ -Boxen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Hinzufügen von Bibliothek Link“ und wählen Sie die in Schritt erstellten Programme 5.1.3 bis 5.1.17.
   5. Markieren Sie alle Vertiefungen analysiert werden, und wählen Sie die entsprechenden Programme unter „Assays“, „Dateinamenskonventionen“ und „Ergebnisse Gruppen“ durch die Boxen überprüft neben ihnen.
3. Vor dem Laden die Platte auf dem Tablett des Genetic Analyzer, gelten die Gummidichtung auf der 96-Well-Platte gelegt und die versiegelte Platte in dem Kunststoffgehäuse, das mit dem Genetic Analyzer kommt.
4. Drücken Sie den „Tray“ -Taste an der Vorderseite des Genetic Analyzer, und, wenn die Schale reSchmerzen die Vorderseite der Ausrüstung, die Tür öffnen und die umhüllten Platte auf dem Tablett geladen werden. Stellen Sie sicher, dass die Platte an Ort und Stelle verriegelt ist, und dann die Tür schließen.
5. Klicken Sie auf „Link-Platte für Run“ klicken.
6. In der „Load Plates für Run“ Seite, führen Sie eine abschließende Prüfung, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und Bedingungen sind richtig und in Ordnung.
7. Klicken Sie auf „Start Ausführen“ klicken. Jeder Lauf von 24 Proben (die ersten 3x8 Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen) in weniger als 55 min abgeschlossen.

6. Analyse der Elektropherogramm zu ermitteln Basenpaar-Unterschiede

1. Wenn der Kapillargelelektrophorese Lauf abgeschlossen ist, öffnet die Analysesoftware, die Ergebnisse zu analysieren.
2. Klicken Sie auf das Symbol „Add Samples Project“ und für den Ordner suchen, um die Lauf Dateien enthält. Man erinnere sich aus dem Schritt 5.1.12 die zugewiesene Position der Ergebnisdateien.
3. Wählen Sie alle Ergebnisse Dateien jeder Injektion im fertigen Lauf und click auf dem „Zur Liste hinzufügen“ klicken; die Namen dieser Dateien beginnen mit „Inj“ und enthalten die Details der Flucht.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Hinzufügen und Analysieren“, um mit der Analyse fortzufahren.
5. Wählen Sie alle Proben in der Flucht, indem Sie auf die erste Probe Klicken und Ziehen Sie den Cursor nach unten auf die letzte Probe und dann auf das „Display Plots“ -Symbol.
6. Um zu überprüfen, um die Qualität der Größe Standard, öffnen Sie den orangefarbenen Kanal der Ergebnisse durch das orangefarbene Symbol überprüft und den Rest der farbigen Symbole unchecking; Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Größe calling genau und zuverlässig ist.
7. entsprechend den von der Steuer ungezielte abgeleitete Fragmente und die gezielte Klone, überprüfen die blauen und grünen Symbole der Peaks Anzeigen Ablesungen von diesen Kanälen zu öffnen.
8. Setzen Sie den Cursor über die horizontale Achse des ersten Ergebnisse Plot und der rechten Maustaste, um „Full View“. Blättern Sie nach unten, um alle Ergebnisse auf einen Blick zu sehen, um zu bestimmenwenn es irgendein großes Problem bei der Flucht. Zum Vergrößern auf einem bestimmten Wertebereich der rechte Maustaste mit der Maus auf der entsprechenden Achse des Plots, wählen Sie „Zoom zu ...“ und Schlüssel im Wertebereich von Interesse.
   HINWEIS: Ein mögliches großes Problem ist, dass alle Proben geben niedrige Intensitätsspitzen. Dies ist in der Regel aufgrund der längeren Lagerung von Fluorophor-markierten Amplicons vor dem Kapillarelektrophorese Lauf oder der Über Verdünnung von Amplicons, die leicht durch Wiederholung der PCR-Schritt oder durch Verdünnen der Amplicons unter Verwendung eines niedrigeren Verdünnungsfaktor korrigiert werden kann, respectively.
9. Um die Ergebnisse zu speichern, folgen Sie den unten beschriebenen Schritten.
   1. Stellen Sie sicher, dass die blauen und grünen Kanäle ausgewählt und klicken Sie auf den „Sizing Table“ -Symbol.
   2. Speichern Sie die Tabelle von Werten in getabulatortrennte Textformat (.txt) durch Öffnen „Datei“ und wählen Sie „Tabelle exportieren.“ Benennen Sie die Datei entsprechend und wählen Sie den Speicherort der Datei der Wahl.
   3. So speichern Sie die Handlungs des Laufes im PDF-Format, gehen Sie auf „Datei“ und klicken Sie auf die Option „Drucken“. Wählen Sie die entsprechende PDF-Writer und klicken Sie auf „Drucken“. Benennen Sie die Datei entsprechend und wählen Sie den Speicherort der Datei der Wahl.
10. Um den Unterschied in der Größe der abgeleiteten Fragmente von ungezielte Wildtyp- Steuerung und die CRISPR / Cas9 gezielte Klone zu berechnen, die Schritte weiter unten beschrieben.
    1. Öffnen Sie die Registerkarte Textdatei (.txt) aus Schritt 6.9.2 mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Die Tabelle sollte diese vier wichtigen Säulen sind: „Dye / Sample Peak“ (was einen blauen oder grünen Kanal), „Sample File Name“ (die ersten Zeichen der gut oder Beispielnamen angeben), „Größe“ (die Größe der Fragment bezeichnet), und „Höhe“ (die Fluoreszenzintensität des Peaks angibt).
    2. Um relevante Spitzen heraus ausschließen diejenigen, die nicht in dem erwarteten Größenbereich sind.
       Hinweis: Das Ergebnis, indel Mutationen selten der Regel in mehrals ein 100-bp Unterschied in der Größe; Somit Spitzen, deren Größe um mehr als 100 bp aus dem Wildtyp-Kontrollpeak (dominanter Spitze in dem grünen Kanal) sind ausgeschlossen. Dies kann leicht mit dem „Between“ Option unter der „Bedingte Formatierung“ -Funktion in der Tabelle durchgeführt werden.
    3. Zum Entfernen von nicht-spezifischen Peaks, die von Hintergrundniveau nicht zu unterscheiden sind, verwenden Sie die „Less Than“ Option unter „Bedingte Formatierung“ -Funktion in dem Tabellenkalkulationsprogramm zu Spitzen, die Höhen auszuschließen sind niedriger als 2.000 Einheiten. Dieser Cut-off-Wert wurde empirisch bestimmt und kann daher angepasst werden, in dem Sitz gehalten.
    4. Berechnen der Differenz in Fragmentgröße zwischen jeder der resultierenden Spitzen in dem blauen Kanal (CRISPR / Cas9 gezielte Klone) und dem einzigen Peak in dem grünen Kanal (ungezielte Wildtyp- Steuerung), indem die letztere von der ersteren subtrahiert wird.
       HINWEIS: Es ist wichtig, Werte zu jedem Kapillare Electrophor zugeschrieben zu verwendenesis Probe, da es sein kann, zwischen den Stichproben Unterschiede in der Fragmentgröße der Wildtyp-Kontrolle.
    5. Rundet die Werte auf die nächste Ganzzahl die Anzahl der Basenpaar zu bestimmen, die in oder gelöscht eingefügt wurden, aus, wenn überhaupt, die genomischen Sequenz in Frage. Wenn Ausschlagen ein interessierendes Gen ist, wählen Klont indel Mutationen, die nicht von Vielfachen von 3 bp, um sicherzustellen, dass es in Rasterverschiebung der codierenden Sequenz ist.

7. Überprüfung des Knockout-Status von Clones

1. Erweitern einzelnen knockout Klone aus der 96-Well-Platte (von den Schritten 2.4 und 2.6) in eine 24-Well-Platte durch die Zellen trypsinisiert 25 ul 0,25% Trypsin-EDTA verwendet und bei 37 ° C für 5 min inkubiert.
2. In 125 & mgr; l Medium (DMEM mit 10% FBS) zu den trypsiniert Zellen und Resuspendieren gründlich.
3. Übertragen der Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 400 g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Entfernen, so viel des Mediums wie möglich unter Verwendung von Vakuumabsaugung oder einer Pipette, Zellpellet in 500 ul Medium, und übertragen die Zellsuspension in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ , bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen.
5. Erweitern, um die einzelnen Klone seriell von der 24-Well-Platte auf eine Platte mit 6 Vertiefungen und von der 6-Well-Platte auf eine 10-cm-Schale, wenn sie 80 erreichen - 90% Konfluenz 7.1 bis 7.4 durch Wiederholen der Schritte unter Verwendung der folgenden Mengen: 50 & mgr; l von 0,25% Trypsin-EDTA und 150 & mgr; l Medium (von der 24-Well-Platte auf die Platte mit 6 Vertiefungen expandieren) und 200 & mgr; l von 0,25% Trypsin-EDTA und 1 ml Medium (für die aus den expandierenden 6- Well-Platte auf die 10-cm-Schale).
6. Ernten die Klone erreichen, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz durch Trypsinisierung der Zellen unter Verwendung von 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 5 min.
7. 5 ml Medium (DMEM mit 10% FBS) zu den Zellen trypsinisiert und resuspend gründlich.
8. Übertragen der Zellsuspension zu gleichen Teilen in zwei 15-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Entfernen des Mediums so weit wie möglich. Ein Teil der Zellen ist für die genomische DNA-Extraktion und der andere ist für die Gesamtproteinextraktion.
9. Zur Verifikation über Sanger-Sequenzierung, folgen Sie den unten beschriebenen Schritten.
   1. Extrahieren genomischer DNA aus dem Klonen , wie zuvor beschrieben ^12.
   2. Führen Sie die PCR-Amplifikation der Region überspannt die CRISPR / Cas9 Zielstelle, wie in Abschnitt 3.2, aber nicht markierte Primer verwendet werden. Verwenden Sie keine markierten Primer für diesen Schritt, da die Fluoreszenz von dem Tag mit dem anschließenden Sanger-Sequenzierung Schritt stören.
   3. Reinige die Amplikons eine PCR Clean-up - Kit, wie zuvor ¹² beschrieben.
   4. Sequenz, die die gereinigten Amplikons unter Verwendung der PCR-Primer in Schritt 7.9.2 verwendet, um den Genotyp der Klone, um zu bestimmen, wie beschrieben previously ^12.
10. Zur Überprüfung via Western - Blot - Analyse, extrahiert Gesamtprotein aus den Wildtypzellen und gezielter Klone, wie zuvor beschrieben ^12.
    1. Führen Western Blot - Analyse unter Verwendung von geeigneten Antikörpern gegen das Protein des Zielgen, wie zuvor beschrieben , ^12; ein echter Knockout-Klon ist die Expression des Proteins frei.

Ergebnisse

Die fluoreszierende PCR-Kapillargelelektrophorese hier beschriebene Technik wird erwartet, zu jedem Ziel ausrichtbare Region in dem Genom in praktisch jede Zelllinie anwendbar zu sein, der fremden DNA-Lieferung zugänglich ist. Wir haben zuvor gezeigt , durch seine Anwendung ¹² drei Gene in einer kolorektalen Krebszelllinie Targeting. Hier zeigen wir seine Wirksamkeit eine hepatozelluläres Karzinom-Zelllinie in Genotypisierung, HEPG2, mit einem CRISPR gezielten /...

Diskussion

Das Ausschlagen eines spezifischen Gens in einem Modell-Zelllinie der Wahl ist zur Routine geworden, die Rolle für die Aufklärung, dass das Gen in diesem bestimmten zellulären Kontext spielt. In der Tat sind einige genomweite Bildschirme zur Zeit zur Verfügung , die die CRISPR / Cas9 System verwenden nahezu alle bekannten menschlichen Genen in das Genom ^{14 zielen, 15, 16.} Mit diesen großflächigen Bildschirmen (oder sogar ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003