Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

Резюме

Метод генотипирования, описанный здесь, который соединяет флуоресцентные полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием капиллярного электрофореза гель, позволяет с высокой пропускной способностью генотипирования нуклеазы-опосредованной нокаутом клонов. Он преодолевает ограничения, с которыми сталкиваются другие методы генотипирования и является экономически более эффективным, чем методы секвенирования.

Аннотация

Развитие программируемых инструментов генома редактирования способствовало использованию обратной генетики для понимания роли конкретных геномные последовательности играют в функционировании клеток и целых организмов. Эта причина была чрезвычайно способствовали недавнему введению CRISPR / система-а cas9 универсального инструмента, который позволяет исследователям манипулировать геном и транскрипт, с тем чтобы, среди прочего, выбивать, сбить или постучать в генах в целевом манера. С целью выбивания гена, CRISPR / cas9-опосредованный двунитевые разрывы рекрутировать негомологичный концевой соединительную ДНК ремонт пути, чтобы ввести вызывающий сдвиг рамки вставки или удаление нуклеотидов в месте разрыва. Однако, индивидуальный гид РНК может вызвать нежелательные эффекты вне цели, и исключить их из, использование нескольких направляющих РНК необходимо. Эта множественность целей также означает, что в больших объемах скрининг клонов требуется, что в свою очередь напрашивается использование эфficient высокой пропускной метод к генотипу Нокаут клонов. Современные методы генотипирования либо страдают от ограничений, присущих или нести высокую стоимость, следовательно, делает их непригодными для целей с высокой пропускной способностью. Здесь мы подробно протокол для использования флуоресцентного ПЦРА, который использует геномную ДНК из клеточного лизата сыр в качестве матрицы, а затем разрешения фрагментов ПЦРА через капиллярный электрофорез в геле. Этот метод является достаточно точным, чтобы дифференцировать разницу один пар оснований между фрагментами и, следовательно, является адекватным что указывает на наличие или отсутствие в рамки считывания кодирующей последовательности гена-мишени. Это точное знание эффективно устраняет необходимость в подтверждающем этапе секвенирования и позволяет сэкономить время и затраты в процессе. Кроме того, эта методика оказалась универсальными в генотипирования различных клеток млекопитающих различного происхождения ткани целевого направляющего РНК против многочисленных генов, как показано здесь и в других местах.

Введение

Обратные генетические подходы позволили ученым выяснить влияние специфических изменений в геноме на клетки или всего организма в целом. Например, экспрессия специфического гена может быть ослаблена гена бросовой ^{1, 2} (частичное восстановление) или гена нокаут ^{3, 4} (полная абляции) для того , чтобы определить влияние , что это оказывает на функции клетки , или на развитие организма.

Эксперименты нокаута гена стали легче после введения последовательности специфической программируемых нуклеаз, таких как цинк-нуклеазы пальцев (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс). Однако сравнительно недавно характеризация кластеризованную регулярно перемежается короткое палиндромное повторение (CRISPR) / система cas9 сделала его очень легко для любой лаборатории по всему миру, чтобы выполнить гене выколотки эксперименты. По существу, система CRISPR / cas9 состоит из двух важных компонентов-одной направляющей РНК (sgRNA), который распознает и связывает через базовую комплементарности к определенной последовательности в геноме, и эндонуклеазы под названием cas9. Последствия специфического связывания и действий комплекса sgRNA-cas9 на геномной ДНК представляет собой двухцепочечное расщепление ДНК. Это, в свою очередь, приводит в действии механизма реагирования повреждения ДНК в клетке, который впоследствии отремонтированная с помощью негомологичного концевого присоединения (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR) путей. Поскольку механизм NHEJ ремонта (но не механизм HR) часто приводит к случайной вставки или делеции нуклеотидов в месте ремонта, в результате вставки / удаления (INDEL) мутации, это может привести к рамки считывания экзона сдвиг. Затем это может привести к нокаута гена из - за преждевременной терминации трансляции и нонсенс-опосредованного распада ^{5, 6,7.}

Несмотря на удобство , обеспечиваемой введением системы CRISPR / cas9 в выбивания ген, генотипирование клонов клеток - мишеней остается узким местом, особенно в настройке ^{8, 9} с высокой пропускной способностью . Существующие методы либо страдают основные недостатки, присущие или являются финансово дорогостоящими. Например, СЮРВЕЙЕРСКИЙ или T7E1 анализ, который представляет собой анализ ферментативного , который обнаруживает несоответствия в ДНК дуплексами ^10, не способен различать дикий тип клоны и гомозиготными мутант (клоны , у которых аллели мутируют тождественно), так как эти клоны имеют идентичные аллели и , таким образом , не представляют несовпадения в их последовательности ДНК ^11. Кроме того, использование Sanger секвенирования, который считается золотым стандартом в генотипирования мутантных клонов, в установке с высокой пропускной способностью нежелательно из-за его высокой стоимости. Здесь мы представляем йеПротокол болело флуоресцентного ПЦР-капиллярного метода гель-электрофореза, который может обойти ограничения других существующих методов генотипирования и является особенно полезным при выполнении экран высокого пропускной способности нуклеазы-опосредованной нокаутом клонов. Этот метод технически прост в исполнении и экономит время и затраты.

протокол

1. Получение CRISPR / cas9 ориентированных Клоны одноклеточных

1. Семенной клетки HepG2 на 6-луночный планшет в количестве 500000 клеток на лунку в 2 мл антибиотика-Free Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубировать в течение 24 ч при 37 ° С и 5% CO _2.
2. Трансфекции клетки с плазмидой коэкспрессирующих cas9 и специфический sgRNA против представляющего интереса гена с использованием соответствующего реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Например, sgRNA может быть клонирован в -2A-GFP вектора pSpCas9 (ВВ), как описано ранее ^4.
3. Заменить культуральную среду 4 - 16 ч после трансфекции с 2 мл среды свежего антибиотика свободным.
4. Около 48 ч после трансфекции, собирают суспензию одной клетки путем trypsinizing клетки.
   1. Trypsinize клеток в 0,2 мл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин. Добавьте 1 мл среды и ресуспендировали thoroughlу.
5. Сортировка клеток для GFP-положительных клонов, как описано выше ^12, и собирают около 3500 клеток.
6. Пластина GFP-положительных клеток, отсортированные на 10-см чашки на 500, 1000 и 2000 клеток на чашку в 8 мл пенициллина / стрептомицина с добавкой культуральной среды. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO _2.
7. Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO _2, заменяя среду каждые пять дней, пока они не превращаются в одноклеточных колоний , достаточно больших , чтобы быть видимыми невооруженным глазом. Для большинства клеточных линий рака, это занимает около двух недель со дня посева.
8. Когда колонии соответствующего размера (т.е., видимый невооруженным глазом), передавать отдельные колонии в лунки планшета для культуры в 96-луночный , содержащую 200 мкл DMEM с добавлением 10% FBS , дополненной.
   1. Аспирируйте колоний одноклеточных с помощью пипетки 200 мкл-с небольшим объемом среды. Ресуспендируют клетки тщательно в вделимые скважины путем растирания несколько раз.
9. Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO _2, заменяя среду каждые пять дней, пока они не достигнут 50 - 90% слияния. Для большинства клеточных линий рака, это занимает около 24 - 48 ч.

2. ДНК, извлекая сырой Геномного Использование прямого лизиса

1. Когда клетки достигают 50 - 90% слияния, удалить как можно больше культуральной среды из лунок, как это возможно с помощью многоканального вакуумного отсоса или пипетки многоканальный.
2. Добавьте 25 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА (без фенола красного) в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 7 мин.
3. Ресуспендирует трипсин клетку тщательно с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они отделены от пластиковой поверхности.
4. Создание повторности из отдельных клонов путем передачи приблизительно 5 мкл одной клеточной суспензии в пустой 96-луночный культуральный Platе. Добавьте 200 мкл культуральной среды в каждую лунку и поддерживать клетки до тех пор, пока положительные клоны идентифицируют с помощью гель-электрофореза флуоресцентного ПЦР-капиллярная (смотри ниже). Серийно расширить клетки к 10-см чашек или любому другому масштабу выбора (смотрите раздел 7).
5. Добавьте 5 мкл одной клеточной суспензии со стадии 2,3 до 10 мкл домашнего буфера прямого лизирующего (10 мМ Трис рН 8,0, 2,5 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 0,15% SDS и 0,3% Tween-20) ¹² в 96-луночный ПЦР пластины и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Центрифуга кратко (чтобы довести жидкость вниз к нижней части лунки).
6. Добавьте 200 мкл культуральной среды к оставшемуся ~ 15 мкл клеточной суспензии со стадии 2.3 , и инкубируют при 37 ° С и 5% СО _2, вместе с повторности со стадии 2.4.
7. Тема лизатов от шага 2.5 к следующей тепловой программе на велосипеде, чтобы обеспечить полный лизис клеток и выделение геномной ДНК: 65 ° С в течение 30 с, 8 ° C в течение 30 сек, 65 ° С в течение 1,5 мин, 97 ° C в течение 3 мин, 8 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 3 мин, 97 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 1 мин и 80 ° С в течение 10 мин. Центрифуга лизатов кратко.
8. Развести лизатов путем добавления 40 мкл нуклеазы без воды и тщательно перемешать с помощью вихревой мешалки. Центрифуга кратко. Разведенные лизаты могут быть использованы немедленно или хранили при -20 ° С в течение нескольких месяцев без существенной потери качества.

3. Выполнение флуоресцентный ПЦР для амплификации CRISPR / cas9 Целевые регионы

1. Дизайн два флуорофор-меченые праймеры вперед (как меченный по 5'-концу) для каждого CRISPR / cas9 целевой области; режущие участки, которые дальше , чем 300 п.н. друг от друг следует рассматривать как два отдельных целевые областей (например, зеленый флуорофору-меченый праймер для нецелевого контроля дикого типа и синего флуорофора меченных грунтовки для CRISPR / cas9-целевых клонов, см таблицы Materia Ls).
   1. Закупить эти меченые вперед праймеры и немеченый обратный праймер соответственно. Обратите внимание, что праймеры могут быть разработаны с использованием любого инструмента выбора и что ампликоны должны быть 200 - 500 Бп Лонг оснований.
2. Выполните ПЦР , как описано выше ¹² для амплификации целевых областей с использованием меченых праймеров.
   1. Используйте 3 мкл разбавленного лизата из стадии 2.8 , в реакции 20-мкл (таблица 1) и следующую термическую программу велосипедный: 94 ° C в течение 10 мин (1 цикл); 94 ° С в течение 10 с, 64 ° С в течение 30 с, 68 ° С в течение 1 мин (4 цикла); 94 ° С в течение 10 с, 61 ° С в течение 30 с, 68 ° С в течение 1 мин (4 цикла); 94 ° С в течение 10 с, 58 ° С в течение 30 с, 68 ° С в течение 1 мин (4 цикла); 94 ° С в течение 10 с, 55 ° С в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин (35 циклов).
3. Решение 5 мкл ампликонов ПЦР на агарозном геле 1% для проверки размера и относительного количества ампликоновсс = "Xref"> 12.
   Примечание: При выполнении этого шага для всех образцов рекомендуется, но не обязательно; разрешение выбранного числа выборок достаточно оценить количество ампликонов, присутствующих в образцах в целом.

4. Подготовка образцов для капиллярного гель-электрофореза

1. Развести ампликонов дикого типа (нецелевые родительских клеток) и CRISPR / cas9-целевой ДНК в нуклеазы без воды до примерно 2,5 нг / мкл. Убедитесь, что для разбавления достаточно дикого типа образец ДНК, чтобы быть добавлены к каждому целевому образца ДНК (как минимум 0,5 мкл разбавленного образца дикого типа на целевой выборке требуется).
2. Смешайте разбавленный дикий тип и целевые образцы ДНК в равном соотношении (например, смешать 1 мкл образца дикого типа с 1 мкла целевым образцом).
3. Добавить 1 мкла смешанные ампликоны до 8,7 мкла деионизованного формамида и 0,3 мкл стандартного размера меченного красителя в 96-луночного ПЦР пластины, которая совместима с генетическим апомalyzer.
   Примечание: использование мастер - смеси формамида и стандартного размера (то есть, подготовка предварительно приготовленной смеси формамида и стандартный размер в 29: 1 отношение перед добавлением ампликонов для обеспечения стандартизированных количеств) рекомендуется.
4. Плотно запечатать пластину и нагрева образцов при 95 ° С в течение 3 мин с использованием термоциклера ПЦР.
5. Поместите пластину на льду сразу же после этапа нагрева и инкубировать в течение по крайней мере 3 мин.

5. Выполнение капиллярного электрофореза в геле на Genetic Analyzer

1. Настройка параметров анализа, протокол инструмента и размера-вызов протокола о программном обеспечении электрофореза капиллярного геля, подключенном к генетическому анализатора.
   Примечание: Этот шаг необходим только для первого запуска электрофореза; программа может быть сохранена для будущего использования. Для последующих запусков, перейдите к шагу 5.2.
   1. Нажмите на иконку «Создать новую плиту» на приборной панели программного обеспечения.
   2. Дайте гип фиктивное имя и выбрать следующие параметры: Количество скважин, 96; Тарелка Тип, фрагмент; Капиллярная Длина, 50 см; и полимер, POP7. Нажмите на кнопку «Присвоить Plate Content».
   3. Под «Assays», нажмите кнопку «Создать новый Пробирной»; появится новая панель.
   4. Назовите анализ «FPCR-КГЭ Пробирный» и убедитесь, что «Тип приложения» установлен правильно, как «Фрагмент».
   5. Настройка протокола прибора, нажав на кнопку «Создать новый» в разделе «Протокол Instrument.»
      1. Установить или выбрать следующие опции и параметры в соответствующих областях: Тип приложения, фрагмент; Капиллярная Длина, 50 см; Полимер, POP7; Dye Set, G5; Запуск модуля, FragmentAnalysis; Имя протокола, FPCR-КГЭ Протокол Instrument; Температура в печи, 60 ° С; Бегите напряжение, 19,5 кВ; Предварительно запуск напряжения, 15 кВ; Инъекции напряжения, 1,6 кВ; Run Time, 1330 s; Время предварительного запуска, 180 с; Время впрыска, 15 с; и задержки данных, 1 с.
   6. ClИк на кнопку «Применить к Анализе», а затем кнопку «Сохранить в библиотеке», чтобы сохранить программу. Закройте панель, чтобы продолжить.
   7. Настройка размера-вызова протокола с помощью нажатия на кнопку «Создать новый» под «Sizecalling протокола.»
      1. Установить или выбрать следующие опции и параметры в соответствующих областях: Протокол Имя, FPCR-ВОР Sizecalling протокола; Размер стандартного, GS500 (-250) LIZ; Размер-абонент, SizeCaller v1.1.0; Анализ параметров, -; Анализ диапазон, полный; Определение размеров Диапазон, полный; Размер вызова метода, местные Южный; Праймер Peak, Present; Синий, зеленый, оранжевый каналы, (Check); Минимальная высота пика, 175 для всех каналов; Использовать сглаживание, None; Использование Baselining (Baseline Window (PTS)), (Проверить) 51; Минимальная ширина пика половины, 2; Пик Размер окна, 15; Полиномиальная степень, 3; Склон Порог Пик Пуск, 0.0; Склон Порог Пик Конец, 0.0; Настройки QC, -; Размер качества, -; Неудача, если значение <0,25; Передайте, если значение <0,75; Предположим, линейность от 0 до 80 п.о.0 п.н.; и Активизировать Pull-Up флаг, если Pull-Up Отношение ≤ 0,1 и Pull-Up Scan ≤ 1.
   8. Нажмите на кнопку «Применить к Анализе», а затем кнопку «Сохранить в библиотеке», чтобы сохранить программу. Закройте панель, чтобы продолжить.
   9. Убедитесь в том, что анализ сохраняется, нажав на кнопку «Сохранить в библиотеке» еще раз и выхода из панели, нажав на кнопку «Закрыть».
   10. Назад на странице «Присвоить Пластинчатое Содержание», нажмите на «Create New File Имя Конвенции» ссылку в разделе «Имя файла Конвенций.»
   11. Название программы "FPCR-КГЭ File Name".
   12. В разделе «Доступные атрибуты» выберите нужные атрибуты, которые будут отображаться в имени файла (например, «Дата Run», «Время Run», «Колодец Позиция» и «Sample Name»). Выберите нужное местоположение файла, в котором будут храниться результаты прогона.
   13. Нажмите на кнопке «Применить к Анализу», а затемкнопка «Сохранить в библиотеке», чтобы сохранить программу. Закройте панель, чтобы продолжить.
   14. Назад на страницу «Присвоить Plate Содержание», нажмите на ссылку «Создать новую группу результатов» в разделе «Результаты группы.»
   15. Название программы «FPCR-КГЭ Результаты игр группы.»
   16. В разделе «Доступные атрибуты» выберите нужные атрибуты, которые будут отображаться в имени файла (например, «пробирной Name»). Выберите нужное местоположение файла, в котором будут храниться результаты прогона.
   17. Нажмите на кнопку «Применить к Анализе», а затем кнопку «Сохранить в библиотеке», чтобы сохранить программу. Закройте панель, чтобы продолжить.
2. Установите программу для электрофореза запустить, выполнив указанные ниже действия.
   1. Перейти к панели управления и нажмите на иконку «Create New Plate».
   2. Имя прогона по желанию (для удобства, включают в себя дату, клеточную линию, и имя гена). Выберите следующие параметры: количество скважин, 96; Тарелка Тип, фрагмент; Капиллярная Длина, 50 см; и полимер, POP7. Нажмите на кнопку «Присвоить Plate Content».
   3. Добавьте в каждую лунку образца по желанию (например, образец может быть назван «NC» , чтобы указать , что также является отрицательным контролем).
   4. Под «Тесты», «Имя файла конвенций» и «Результаты Группы» коробки, нажмите «Добавить из библиотеки» ссылку и выберите программы, созданные на шаге 5.1.3 для 5.1.17.
   5. Выделите все ячейки, которые будут проанализированы и выбрать соответствующие программы под «Анализы», «Имя файла конвенции» и «Результаты группы», установив флажки рядом с ними.
3. Перед загрузкой пластины на лотке генетического анализатора, применять резиновый уплотнитель на 96-луночный планшет и поставить герметичную пластину в пластиковом корпусе, который приходит с генетическим анализатором.
4. Нажмите на кнопку «Tray» в передней части генетического анализатора, и когда лоток повторноноет переднюю часть оборудования, откройте дверцу и загрузите заключенную тарелку на подносе. Убедитесь в том, что пластина фиксируется на месте, а затем закройте дверцу.
5. Нажмите на кнопку «Link Plate для Run» кнопку.
6. На странице «Загрузка Планшеты для Run», сделать окончательную проверку, чтобы убедиться, что все реагенты и условия являются правильными и в порядке.
7. Нажмите на кнопку «Start Run». Каждый прогон 24 проб (первые 3x8 лунки 96-луночного планшета) занимает менее 55 минут, чтобы закончить.

6. Анализ Electropherogram для определения пар оснований Различия

1. Когда капиллярный электрофорез геля запуск будет завершен, откройте программное обеспечение для анализа для анализа результатов.
2. Нажмите на кнопку «Добавить Образцы для Project» значок и поиск в папку, содержащую файлы, запускаемые. Напомним, начиная с шага 5.1.12 присвоенная расположения файлов результатов.
3. Выберите все файлы результатов каждой инъекции в завершенном периоде и пИк на кнопку «Добавить в список»; имена этих файлов начинаются с «Inj» и содержат информацию о пробеге.
4. Нажмите на кнопку «Добавить и Analyze», чтобы приступить к анализу.
5. Выберите все образцы в бегах, нажав на первом образце, и перетаскивая курсор вниз до последнего образца, а затем нажмите кнопку «Показать сюжеты».
6. Для того, чтобы проверить качество стандартного размера, откройте оранжевый канал результатов путем проверки на оранжевый значок и отключив остальные цветные иконки; это очень важно для того, чтобы размер-колл является точным и надежным.
7. Для просмотра пиков, соответствующих фрагментов, полученных из нецелевого контроля и целевых клоны, проверьте синие и зеленые значки, чтобы открыть показания этих каналов.
8. Поместите курсор на горизонтальной оси первого участка и результатов щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «Full View.» Прокрутите вниз, чтобы просмотреть все результаты первого взгляда определить,если есть серьезная проблема с пробегом. Для увеличения определенного диапазона значений, правой кнопкой мыши на соответствующей оси участка, выберите «Zoom To ...» и ключ в диапазоне значений, представляющих интерес.
   Примечание: Один потенциальный основной проблемой является то, что все образцы дают пики низкой интенсивности. Обычно это происходит из-за длительное хранение флуорофора-меченых ампликонов до начала капиллярного электрофореза пробега или чрезмерное разбавление ампликонов, которые могут быть легко выпрямленным путем повторения стадии ПЦРА или путем разбавления ампликонов с использованием более низкий коэффициента разбавления, соответственно.
9. Для сохранения результатов, выполните действия, описанные ниже.
   1. Убедитесь в том, что синие и зеленые каналы выбраны и нажмите на значок «калибровочный стол».
   2. Сохраните таблицу значений в формате с разделителями табуляции текст (.txt), открыв «Файл» и выберите «Экспорт таблицы». Имя файла, соответственно, и выберите местоположение файла выбора.
   3. Чтобы сохранить сюжетс разбега в формате PDF, перейдите в раздел «Файл» и нажмите на кнопку «Печать». Выберите соответствующий PDF писатель и нажмите «Печать». Имя файла, соответственно, и выберите местоположение файла выбора.
10. Чтобы вычислить разницу в размерах фрагментов, полученных из нецелевого контроля дикого типа и CRISPR / cas9-целевых клонов, выполните действия, описанные ниже.
    1. Откройте файл с разделителями табуляции текст (.txt), начиная с шага 6.9.2 с электронными таблицами. Таблица должна включать в себя эти четыре важных столбца: «Dye / Sample Пик» (с указанием синий или зеленый канал), «Пример Имя файла» (первые символы указывают скважины или образца имени), «размер» (с указанием размера из фрагмент называется), и «Высота» (что указывает на интенсивность флуоресценции пика).
    2. Для того, чтобы выделить соответствующие пики, исключить те, которые не в ожидаемом диапазоне размеров.
       Примечание: Как правило, INDEL мутации редко приводят к болеечем 100 п.о. разницы в размерах; Таким образом, пики, размер которых отличается более чем на 100 пар оснований от пика управления дикого типа (доминирующего пика в зеленом канале), исключаются. Это можно легко сделать с помощью «Между» вариант под функцией «Условное форматирование» в таблице.
    3. Чтобы удалить неспецифические пики, которые неотличимы от фонового уровня, использовать «меньше чем» вариант под функцией «Условное форматирование» в программе электронных таблиц, чтобы исключить пики, чьи высоты ниже, чем 2000 единиц. Эта отсечка значение было определено эмпирически и, следовательно, может быть скорректирована, где считается нужным.
    4. Вычислить разницу в размерах фрагментов между каждым из полученных пиков в канале синего (CRISPR / cas9-целевые клоны) и единственным пик в зеленом канале (нецелевом контроле дикого типа) путем вычитания последнего от первого.
       Примечание: Важно, чтобы использовать значение, приписываемое каждый капиллярный electrophorESIS образец, так как может быть между выборочными различиями в размере фрагмента контроля дикого типа.
    5. Округляют значения до ближайшего целого числа, чтобы определить число пар оснований, которые были вставлены в или удалены из, если таковые имеются, в геномной последовательности. Когда выбивания гена представляет интерес, отбор клоны, чьи INDEL мутация не кратных 3 п.о., чтобы гарантировать, что есть в рамках считывание кодирующей последовательности.

7. Проверка Knockout Статус Клонов

1. Расширение индивидуальных клонов нокаутом из 96-луночного планшета (с шагом 2.4 и 2.6) в 24-луночный планшет с помощью trypsinizing клеток с использованием 25 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубировали при 37 ° С в течение 5 мин.
2. Добавить 125 мкл среды (DMEM с добавлением 10% FBS) к трипсином клетки и тщательно ресуспендируют.
3. Передача суспензии клеток в пробирку 15 мл и центрифугируют при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Удалить, как большая часть среды, как это возможно с помощью вакуумного отсоса или пипетки, ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл среды и передачи клеточной суспензии на лунку 24-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С и 5% CO ₂ до тех пор , пока клетки не достигают 80-90% слияния.
5. Expand отдельных клонов серийно из 24-луночного планшета с 6-луночным планшетом и из 6-луночного планшета с 10-см чашкой с, когда они достигают 80 - 90% сплошность, повторяя шаги 7.1 до 7.4, используя следующие объемы: 50 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА и 150 мкл среды (для расширения из 24-луночного планшета на 6-луночный планшет) и 200 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА и 1 мл среды (для расширения от 6- луночный планшет с 10-см чашки).
6. Урожай клонов, когда они достигают 80 - 90% слияния с trypsinizing клеток с помощью 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин.
7. Добавьте 5 мл среды (DMEM с добавлением 10% FBS) к трипсином клетки и resuspeН.Д. тщательно.
8. Передача клеточной суспензии на две равные части 15-мл центрифужные пробирки, при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить среды, насколько это возможно. Одна части клеток для экстракции геномной ДНК, а другие для полного извлечения белка.
9. Для проверки с помощью Sanger секвенирования, выполните действия, описанные ниже.
   1. Извлечение геномной ДНК из клонов , как описано ранее ^12.
   2. Выполните ПЦР-амплификации области, охватывающей / cas9 целевой сайт CRISPR, как описано в разделе 3.2, но использовать немаркированные праймеров. Не используйте маркированные праймеры для этого шага, так как флуоресценция из тега будет мешать последующей стадии секвенирования Sanger.
   3. Очищают ампликонов с использованием набора для ПЦР - очистки, как описано выше ^12.
   4. Последовательность очищенных ампликонов с использованием ПЦР-праймеров, используемых на этапе 7.9.2 для определения генотипа клонов, как описано previouslу ^12.
10. Для проверки с помощью Вестерн - блот - анализа, извлечения общего белка из клеток дикого типа и целевых клонов, как описано ранее ^12.
    1. Выполните вестерн - блот анализ с использованием соответствующих антител против белка гена - мишени, как описано выше ^12; настоящий клон Нокаут лишен экспрессии белка.

Результаты

Флуоресцентный ПЦР-метод капиллярного электрофореза гель, описанный здесь, как ожидается, будут применимы к любой области в таргетинг геноме практически в любой клеточной линии, которая поддается доставки чужеродной ДНК. Ранее мы показали свое применение при ориент?...

Обсуждение

Выбивание определенного гена в модельном клеточной линии выбора стали обычным для выяснения той роли, которую играет ген в этой конкретной сотовой связи. В самом деле, несколько общегеномных экранов в настоящее время доступны , которые используют систему / cas9 CRISPR целевой практически в?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003