Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

Riepilogo

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Abstract

Lo sviluppo di strumenti genoma di modifica programmabili ha facilitato l'uso di genetica inversa per comprendere i ruoli specifici sequenze genomiche giocano nel funzionamento delle cellule ed organismi interi. Questa causa è stata enormemente aiutato dalla recente introduzione del CRISPR / sistema-a Cas9 strumento versatile che permette ai ricercatori di manipolare il genoma e trascrittoma al fine di, tra le altre cose, knock out, abbattere, o bussano nei geni in modo mirato maniera. Allo scopo di mettere fuori un gene, CRISPR / Cas9-mediata rotture a doppio filamento reclutano fine-joining non omologhe riparazione del DNA percorso per introdurre l'inserimento frameshift causano o delezione di nucleotidi nel sito rottura. Tuttavia, un individuo RNA guida può causare indesiderati effetti off-target e per escludere questi fuori, l'uso di più RNAs guida è necessario. Questa molteplicità di bersagli significa anche che è richiesto uno screening ad alto volume di cloni, che a sua volta pone l'uso di un efciente tecnica high-throughput al genotipo i cloni eliminazione diretta. tecniche di genotipizzazione correnti sia soffrono di limitazioni intrinseche o comportano costi elevati, quindi rendendoli inadatti per alte produttività. Qui, si dettaglio il protocollo per l'utilizzo fluorescente PCR, che utilizza il DNA genomico da lisato cellulare grezzo come modello, e quindi risolvere i frammenti di PCR mediante gel elettroforesi capillare. Questa tecnica è abbastanza accurata per differenziare differenza una base-pair tra frammenti e quindi è adeguata indicante la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza codificante del gene bersaglio. Questa conoscenza precisa preclude efficacemente la necessità di una fase di sequenziamento di conferma e permette agli utenti di risparmiare tempo e costi nel processo. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato di essere versatile genotipizzazione varie cellule di mammifero di varia origine tessuto mirato da RNA guida contro numerosi geni, come mostrato qui e altrove.

Introduzione

approcci di genetica inversa hanno permesso agli scienziati per chiarire gli effetti delle alterazioni specifiche nel genoma sulla cella o tutto l'organismo. Ad esempio, l'espressione di un particolare gene può essere attenuato di silenziamento genico ^{1, 2} (riduzione parziale) o gene knockout ^{3, 4} (ablazione completa) al fine di determinare l'effetto che questo ha sulla funzione della cella o sulla sviluppo dell'organismo.

Esperimenti gene knockout sono più facili dall'introduzione della nucleasi programmabili sequenza-specifiche, quali nucleasi zinco-dito (ZFNs) e trascrizione attivatore simile nucleasi effettrici (Talens). Tuttavia, la relativamente recente caratterizzazione del cluster intervallati regolarmente breve ripetizione palindromo (CRISPR) / Sistema Cas9 ha reso estremamente facile per qualsiasi laboratorio in tutto il mondo per eseguire genesperimenti knockout e. In sostanza, il sistema / Cas9 CRISPR costituito da due componenti essenziali: un singolo guida RNA (sgRNA), che riconosce e si lega con la complementarità di base ad una sequenza specifica nel genoma, e un'endonucleasi chiamato Cas9. Le conseguenze della specifica azione vincolante e del complesso sgRNA-Cas9 su DNA genomico è la scissione doppio filamento del DNA. Questo, a sua volta, fa scattare il meccanismo di risposta al danno del DNA nella cellula, che viene successivamente riparato attraverso le vie non omologhi end-giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR). Poiché il meccanismo NHEJ riparazione (ma non il meccanismo HR) comporta spesso l'inserimento o delezione di nucleotidi casuali nel sito di riparazione, con conseguente inserimento / delezione (INDEL) mutazioni, può causare la griglia di lettura di un esone spostare. Questo può quindi provocare il knockout del gene dovuto premature terminazione della traduzione e decadimento mediato da un nonsenso ^{5, 6,7.}

Nonostante la comodità offerta dalla introduzione del sistema di CRISPR / Cas9 in buttare giù un gene, la genotipizzazione dei cloni di cellule bersaglio resta un collo di bottiglia, soprattutto in un ambiente ^{8, 9} high-throughput. tecniche esistenti o soffrono principali limitazioni intrinseche o sono finanziariamente costoso. Ad esempio, il saggio SURVEYOR o T7E1, che è un saggio enzimatico che rileva disallineamenti di DNA duplex ^10, non è in grado di distinguere tra cloni di tipo selvatico e mutanti omozigoti (cloni cui alleli sono mutati identico), poiché questi cloni hanno alleli identici e pertanto non presentano disallineamenti nella loro sequenza di DNA ^11. Inoltre, l'uso di Sanger sequenziamento, che è considerato il gold standard nella genotipizzazione cloni mutanti, in una configurazione ad alta produttività è indesiderabile a causa della sua costo elevato. Qui, vi presentiamo una detprotocollo soffriva esattamente della tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente, che può aggirare le limitazioni delle altre tecniche di genotipizzazione esistenti ed è particolarmente utile nell'esecuzione di uno schermo ad elevata capacità di cloni knockout nucleasi-mediata. Questo metodo è tecnicamente semplice da eseguire e consente di risparmiare tempo e costi.

Protocollo

1. Ottenere CRISPR / Cas9 mirati cloni singola cella

1. cellule HepG2 seme su una piastra da 6 pozzetti a 500.000 cellule per pozzetto in 2 mL di Modified Eagle Medium senza antibiotici di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS). Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO _2.
2. cellule trasfezione con il plasmide co-esprimono Cas9 e sgRNA specifica contro il gene di interesse utilizzando un reagente di trasfezione adeguato secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: per esempio, sgRNA può essere clonato nel pSpCas9 (BB) 2A-GFP vettore, come descritto in precedenza ^4.
3. Sostituire il terreno di coltura 4-16 ore dopo la trasfezione con 2 ml di terreno fresco senza antibiotico.
4. Circa 48 ore dopo la trasfezione, raccolgono cella singola sospensione dalle trypsinizing cellule.
   1. Trypsinize le cellule in 0,2 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 1 ml di terreno e risospendere thoroughly.
5. Ordinare le cellule per cloni GFP-positive, come descritto in precedenza ^12, e raccogliere circa 3.500 cellule.
6. Piastra le cellule filtrate GFP-positive sui piatti 10 cm a 500, 1000 e 2000 cellule per piatto in 8 ml di penicillina / streptomicina terreno di coltura supplementato. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO _2.
7. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO _2, sostituendo la soluzione ogni cinque giorni, fino crescono in colonie singole cellule abbastanza grandi da essere visibili a occhio nudo. Per la maggior parte linee cellulari di cancro, questo richiede circa due settimane dal giorno della placcatura.
8. Quando le colonie sono di dimensione appropriata (cioè, visibile ad occhio nudo), trasferire singole colonie di pozzetti di una piastra di coltura a 96 pozzetti contenente 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS.
   1. Aspirare le colonie singole cellule con una pipetta 200 microlitri con un piccolo volume di terreno. Risospendere le cellule a fondo in apozzi dividuo triturando più volte.
9. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO _2, sostituendo la soluzione ogni cinque giorni, fino a raggiungere 50 - 90% di confluenza. Per la maggior parte linee cellulari di cancro, questo richiede circa 24-48 ore.

2. Estrazione greggio DNA genomico usando un metodo diretto di lisi

1. Quando le cellule raggiungono 50 - 90% di confluenza, rimuovere la maggior quantità di terreno di coltura dai pozzetti possibile utilizzando aspirazione sotto vuoto multicanale o una pipetta multicanale.
2. Aggiungere 25 ml di 0,05% tripsina-EDTA (senza rosso fenolo) in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 7 minuti.
3. Risospendere le cellule trypsinized accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. Controllare le cellule al microscopio per fare in modo che essi sono staccati dalla superficie di plastica.
4. Creare una replica dei singoli cloni trasferendo circa 5 microlitri della sospensione singola cella per un 96 pozzetti cultura plat vuotoe. Aggiungere 200 ml di terreno di coltura in ciascun pozzetto e mantenere le cellule fino cloni positivi sono identificati mediante elettroforesi su gel fluorescente PCR-capillare (vedi sotto). Serie espandere le celle a piatti 10 cm o qualsiasi altra scala scelta (vedi sezione 7).
5. Aggiungere 5 ml di cella singola sospensione dal punto 2.3 a 10 ml di casalingo tampone-lyse diretta (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS, e 20 Tween-0.3%) ¹² in una 96 pozzetti PCR e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. centrifugare brevemente (per portare il liquido verso il fondo dei pozzetti).
6. Aggiungere 200 ml di terreno di coltura per il restante ~ 15 ml di sospensione cellulare dal punto 2.3 e incubare a 37 ° C e 5% di CO _2, unitamente alla replica dal punto 2.4.
7. Sottoporre i lisati dal punto 2.5 al seguente programma ciclo termico per garantire la completa lisi delle cellule e il rilascio di DNA genomico: 65 ° C per 30 s, 8 ° C per 30 s, 65 ° C per 1,5 min, 97 ° C per 3 min, 8 ° C per 1 minuto, 65 ° C per 3 min, 97 ° C per 1 minuto, 65 ° C per 1 min, e 80 ° C per 10 min. Centrifugare brevemente lisati.
8. Diluire lisati aggiungendo 40 microlitri di acqua priva di nucleasi e miscelare accuratamente con un vortex. centrifugare brevemente. I lisati diluiti possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -20 ° C per diversi mesi senza significativa perdita di qualità.

3. Esecuzione fluorescente PCR per amplificare CRISPR / Regioni Cas9 target

1. Disegno due primer fluoroforo marcato forward (sia marcato all'estremità 5' ) per ciascuna / regione bersaglio Cas9 CRISPR; siti che sono maggiori di 300 bp l'uno dall'altro dovrebbero essere considerati due regioni bersaglio separate (ad esempio, verde Primer fluoroforo-marcato per il controllo di tipo selvatico non mirati e blu innesco fluoroforo-marcato per CRISPR / cloni Cas9 mirati taglio; vedere la Tabella di Materia ls).
   1. Procurarsi questi primer marcati in avanti e un primer inverso senza etichetta di conseguenza. Si noti che i primer possono essere progettati utilizzando qualsiasi strumento di scelta e che gli ampliconi dovrebbero essere 200 - lungo 500 bp.
2. Eseguire la PCR come descritto in precedenza ¹² per amplificare regioni bersaglio utilizzando i primer marcati.
   1. Utilizza 3 ml di lisati diluiti dal punto 2.8 in una reazione di 20 microlitri (vedi Tabella 1) e il seguente programma ciclo termico: 94 ° C per 10 min (1 ciclo); 94 ° C per 10 s, 64 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 61 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 58 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, e 68 ° C per 1 min (35 cicli).
3. Risolvere 5 ml di ampliconi di PCR su un gel di agarosio 1% per controllare dimensioni e relativa quantità di ampliconiss = "xref"> 12.
   NOTA: L'esecuzione di questo passo per tutti i campioni è incoraggiato ma non necessaria; risolto un numero selezionato di campioni è sufficiente per stimare la quantità di ampliconi presenti nei campioni in generale.

4. I campioni Preparazione per capillare elettroforesi su gel

1. Diluire ampliconi di tipo selvatico (cellule parentali non mirati) e CRISPR / DNA Cas9 mirati in acqua priva di nucleasi a circa 2,5 ng / mL. Assicurati di diluire il campione sufficiente di DNA di tipo selvatico da aggiungere ad ogni campione di DNA mirata (un minimo di 0.5 ml di campione di tipo selvatico diluito per campione mirato è richiesto).
2. Mescolare il tipo selvatico diluito e campioni di DNA bersaglio a pari rapporto (ad esempio, mescolare 1 ml di campione di tipo selvatico con 1 ml di campione mirato).
3. Aggiungere 1 ml di ampliconi misti a 8,7 ml di formammide deionizzata e 0,3 ml di dimensioni standard colorante marcato con un pozzetti 96 PCR piastra che è compatibile con l'un geneticoalyzer.
   NOTA: L'uso di un master mix di formammide e lo standard dimensioni (cioè, una preparazione di una premiscela di formammide e lo standard dimensione in un 29: 1 rapporto prima dell'aggiunta di ampliconi garantire importi standardizzati) è consigliato.
4. Strettamente sigillare la piastra e riscaldare i campioni a 95 ° C per 3 minuti usando un termociclatore PCR.
5. Posizionare la piastra sul ghiaccio subito dopo la fase di riscaldamento e incubare per almeno 3 minuti.

5. L'esecuzione capillare elettroforesi su gel su un analizzatore genetico

1. Impostare parametri del test, protocollo dello strumento, e dimensione protocollo-invitando il software elettroforesi su gel capillare collegato ad un analizzatore genetico.
   NOTA: Questa fase è necessaria solo per il primo corsa elettroforetica; il programma può essere salvato per un utilizzo futuro. Per le esecuzioni successive, andare direttamente al punto 5.2.
   1. Fare clic sull'icona "Crea nuovo Plate" sul cruscotto software.
   2. Dare il run nome fittizio e selezionare le seguenti opzioni: Numero di pozzi, 96; Targhetta, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; e Polymer, POP7. Fare clic sul pulsante "Assegna Targa Contenuto".
   3. In "saggi", fai clic su "Crea nuovo Assay"; apparirà un nuovo pannello.
   4. Nome del saggio "FPCR-CGE Assay" e verificare che "Tipo di applicazione" è impostato correttamente come "frammento".
   5. Istituito protocollo dello strumento facendo clic sul pulsante "Crea nuovo" sotto "Strumento protocollo."
      1. Impostare o scegliere le seguenti opzioni e parametri nelle aree appropriate: Tipo di applicazione, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Nome protocollo, FPCR-CGE Strumento protocollo; Forno temperatura, 60 ° C; Eseguire di tensione, il 19,5 kV; Pre-run di tensione, 15 kV; Iniezione di tensione, 1,6 kV; Tempo di esecuzione, 1.330 s; Pre-Run Time, 180 s; Tempo di iniezione, 15 s; e Data Delay, 1 s.
   6. Click sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Salva in Biblioteca" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
   7. Impostare un protocollo di dimensioni-chiamata facendo clic sul pulsante "Crea nuovo" sotto "Sizecalling protocollo."
      1. Impostare o scegliere le seguenti opzioni e parametri nelle aree appropriate: nome del protocollo, FPCR-CGE Sizecalling protocollo; formato standard, GS500 (-250) LIZ; Taglia-chiamante, SizeCaller v1.1.0; Impostazioni di analisi, -; Analisi gamma, completa; Dimensionamento gamma, completa; Dimensioni metodo di chiamata, Southern locale; Peak Primer, presente; Blu, Verde, Arancione Canali, (controllo); Altezza del picco minimo, 175 per tutti i canali; Utilizzare Smoothing, None; Usa riferimento Per (Baseline Window (Pt)), (Check) 51; Minimo Peak metà larghezza, 2; Peak Dimensioni finestra, 15; Polinomiale Laurea, 3; Slope Soglia Peak Start, 0.0; Slope Soglia Peak End, 0.0; Impostazioni QC, -; Misura qualità, -; Fail se il valore è <0.25; Passare se il valore è <0,75; Assumere Linearità da 0 a 80 bp0 bp; e Actuate Pull-Up flag se Rapporto di Pull-Up ≤ 0,1 e pull-up di scansione ≤ 1.
   8. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Save to Library" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
   9. Assicurarsi che il saggio è salvato cliccando sul pulsante "Salva in Biblioteca" una volta di più e uscire dal pannello facendo clic sul pulsante "Chiudi".
   10. Torna alla pagina "Assegnare piastra contenuti", fai clic sul link "Crea nuovo file Convenzione nome" sotto "File Name Conventions".
   11. Nome del programma "FPCR-CGE File Name".
   12. In "Attributi disponibili", selezionare gli attributi desiderati che appariranno nel nome del file (ad esempio, "Data di Run", "Tempo di Run," "Beh Posizione" e "Nome campione"). Scegliere la posizione del file desiderato in cui verranno memorizzati i risultati della corsa.
   13. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poiil pulsante "Salva in Biblioteca" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
   14. Torna alla pagina "Assegnare contenuto della piastra", fai clic sul link "Crea nuovo gruppo Risultati" sotto "Risultati Gruppi."
   15. Nome del programma "FPCR-CGE Risultati Gruppi."
   16. In "Attributi disponibili", selezionare gli attributi desiderati che appariranno nel nome del file (ad esempio, "Nome Assay"). Scegliere la posizione del file desiderato in cui verranno memorizzati i risultati della corsa.
   17. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Save to Library" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
2. Impostare il programma per un elettroforesi gestito seguendo la procedura di seguito.
   1. Vai sul cruscotto e cliccare sull'icona "Crea nuovo Plate".
   2. Assegnare un nome alla corsa come desiderato (per una facile consultazione, includere la data, linea cellulare, e il nome del gene). Selezionare le seguenti opzioni: Numero di pozzi, 96; Targhetta, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; e Polymer, POP7. Fare clic sul pulsante "Assegna Targa Contenuto".
   3. Etichettare ciascun pozzetto del campione desiderato (ad esempio, un campione può essere denominato "NC" per indicare che il pozzo è un controllo negativo).
   4. Nella sezione "Saggi", "Nome file convenzioni" e "Risultati Gruppi" box, fare clic su "Aggiungi collegamento dalla libreria" e selezionare i programmi creati nel passo 5.1.3 a 5.1.17.
   5. Evidenziare tutti i pozzi da analizzare e selezionare i programmi relativi alla voce "saggi", "Nome file convenzioni" e "Risultati Gruppi" controllando le caselle accanto a loro.
3. Prima di caricare la piastra sul vassoio dell'analizzatore genetico, applicare la guarnizione di gomma sulla piastra a 96 pozzetti e mettere la piastra sigillata nel caso di plastica che viene fornito con l'analizzatore genetico.
4. Premere il pulsante "Tray" nella parte anteriore dell'analizzatore genetico, e quando il re del vassoiodolori parte anteriore dell'apparecchio, aprire la porta e caricare la piastra incassata sul vassoio. Assicurarsi che la piastra sia bloccato in posizione e quindi chiudere lo sportello.
5. Clicca su "Link Plate per Run" pulsante.
6. Nella pagina "piastre di carico per Run", fare un controllo finale per assicurare che tutti i reagenti e le condizioni sono corrette e in ordine.
7. Fare clic sul pulsante "Start Esegui". Ogni ciclo di 24 campioni (i primi pozzi 3x8 della piastra a 96 pozzetti) richiede meno di 55 minuti per completare.

6. Analisi della elettroferogramma per determinare paia di basi Differenze

1. Quando il capillare elettroforesi su gel di esecuzione, aprire il software di analisi per analizzare i risultati.
2. Fare clic su "Aggiungi campioni al progetto" icona e cercare la cartella contenente i file di esecuzione. Ricordiamo dal punto 5.1.12 la posizione assegnata dei file di risultati.
3. Selezionare tutti i file dei risultati di ogni iniezione nella corsa completato e click sul pulsante "Aggiungi a elenco"; i nomi di questi file iniziano con "Inj" e contengono i dettagli della corsa.
4. Fai clic sul pulsante "Aggiungi e analizzare" per procedere con l'analisi.
5. Seleziona tutti i campioni nella corsa cliccando sul primo campione e trascinando il cursore verso il basso per l'ultimo campione e quindi fare clic sull'icona "Mostra Terreni".
6. Per controllare la qualità del formato standard, aprire il canale arancione dei risultati controllando l'icona arancione e deselezionando il resto delle icone colorate; questo è importante assicurarsi che la dimensione-chiamata è preciso ed affidabile.
7. Per visualizzare i picchi corrispondenti ai frammenti derivati ​​dal controllo non mirati e cloni mirati, controllare le icone blu e verde di aprire letture da questi canali.
8. Posizionare il cursore sopra l'asse orizzontale dei primi risultati trama e tasto destro del mouse per selezionare "Visualizza". Scorrere verso il basso per visualizzare tutti i risultati a colpo d'occhio per determinarese c'è qualche problema principale con la corsa. Per ingrandire una specifica gamma di valori, fare clic destro con il mouse sul relativo asse della trama, scegliere "Zoom A ..." e digitare l'intervallo dei valori di interesse.
   NOTA: Un potenziale problema principale è che tutti i campioni danno picchi di bassa intensità. Ciò è generalmente dovuto allo stoccaggio prolungato di ampliconi fluoroforo etichettati prima della corsa elettroforesi capillare o l'eccessiva diluizione di ampliconi, che può essere facilmente corretti ripetendo il passo PCR o diluendo gli ampliconi con un fattore di diluizione inferiore, rispettivamente.
9. Per salvare i risultati, seguire la procedura descritta di seguito.
   1. Assicurarsi che i canali blu e verde sono selezionati e cliccare sull'icona "Sizing Table".
   2. Salvare la tabella dei valori in formato delimitato da tabulazioni di testo (.txt) aprendo "File" e scegliere "Esporta tabella". Nome del file di conseguenza e selezionare la posizione del file di scelta.
   3. Per salvare la tramas della corsa in formato PDF, andare su "File" e fare clic sull'opzione "Stampa". Scegliere il produttore del pdf relativo e premere il tasto "Stampa". Nome del file di conseguenza e selezionare la posizione del file di scelta.
10. Per calcolare la differenza di dimensioni dei frammenti derivati ​​dal controllo di tipo selvatico non mirati e le CRISPR / cloni Cas9-mirati, seguire la procedura descritta di seguito.
    1. Aprire il file di scheda di testo delimitato (.txt) dal punto 6.9.2 con un foglio di calcolo. La tabella dovrebbe includere questi quattro colonne importanti: "Dye Peak / campione" (che indica un canale blu o verde), "Sample File Name" (i primi caratteri indicano il bene o il nome del campione), "Size" (che indica la dimensione del frammento chiamato), e "altezza" (che indica l'intensità di fluorescenza del picco).
    2. Per individuare i picchi rilevanti, escludere quelli che non sono nella gamma di dimensione prevista.
       NOTA: in genere, le mutazioni INDEL raramente risultato in piùdi una differenza di 100 bp in altezza; pertanto, sono esclusi picchi le cui dimensioni differisce di più di 100 bp dal picco di controllo di tipo selvatico (picco dominante nel canale verde). Questo può essere fatto facilmente usando il "Between" opzione sotto la funzione "Formattazione condizionale" nel foglio di calcolo.
    3. Per rimuovere i picchi non specifici, che sono indistinguibili dal livello di fondo, utilizzare la "minore di" opzione sotto la funzione "Formattazione condizionale" nel foglio di calcolo di escludere picchi le cui altezze sono inferiori a 2.000 unità. Questo valore di cut-off è stato empiricamente determinata e può pertanto adeguato ove ritenuto opportuno.
    4. Calcolare la differenza di dimensione del frammento tra ciascuno dei picchi risultanti nel canale blu (CRISPR / cloni Cas9-mirate) e la suola picco nel canale verde (controllo di tipo selvatico non mirati) sottraendo il secondo dal primo.
       NOTA: E 'importante utilizzare valori attribuiti ad ogni elettrof capillarecampione ESIS, in quanto vi possono essere differenze inter-campione nella dimensione del frammento del controllo di tipo selvatico.
    5. Arrotondare i valori all'intero più vicino per determinare il numero di coppie di basi che sono stati inseriti in o cancellati da eventuali sequenza genomica in questione. Quando buttare giù un gene è di interesse, selezionare i cloni le cui mutazioni sono indel non di multipli di 3 bp al fine di garantire che non v'è frameshift nel sequenza codificante.

7. verifica dello stato di Knockout cloni

1. Espandere i singoli cloni knockout dalla piastra a 96 pozzetti (dai passi 2.4 e 2.6) ad una piastra a 24 pozzetti da trypsinizing cellule utilizzando 25 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 5 min.
2. Aggiungere 125 ml di medium (DMEM integrato con il 10% FBS) alle cellule trypsinized e risospendere accuratamente.
3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la maggior quantità del mezzo possibile aspirazione sottovuoto utilizzando o una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 500 ml di mezzo, e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ fino a quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza.
5. Espandere i singoli cloni in serie dalla piastra 24 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti e dal 6 pozzetti a 10 cm piatto quando raggiungere l'80 - 90% di confluenza ripetendo i punti da 7.1 a 7.4, utilizzando i seguenti volumi: 50 microlitri di 0,25% tripsina-EDTA e 150 ml di mezzo (per espandere dalla piastra 24 pozzetti alla piastra da 6 pozzetti) e 200 ml di 0,25% tripsina-EDTA e 1 ml di terreno (per espandere dal 6- pozzetti a 10 cm piatto).
6. Raccogliere i cloni quando raggiungere l'80 - 90% di confluenza dalle trypsinizing cellule usando 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5 min.
7. Aggiungere 5 ml di terreno (DMEM integrato con il 10% FBS) alle cellule trypsinized e resuspend accuratamente.
8. Trasferire la sospensione cellulare equamente in due provette da 15 ml, centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, e rimuovere il mezzo più possibile. Una parte delle cellule sia per l'estrazione di DNA genomico e l'altro per l'estrazione delle proteine ​​totali.
9. Per la verifica tramite sequenziamento Sanger, seguire la procedura descritta di seguito.
   1. Estrarre il DNA genomico da cloni come descritto in precedenza ^12.
   2. Eseguire l'amplificazione PCR della regione che attraversa il sito di destinazione CRISPR / Cas9, come descritto nel paragrafo 3.2, ma utilizzare primer senza etichetta. Non utilizzare primer marcati per questo passo, come la fluorescenza dal tag interferirà con la successiva fase di sequenziamento Sanger.
   3. Purificare gli ampliconi utilizzando un kit di pulizia PCR, come descritto in precedenza ^12.
   4. Sequenziare gli ampliconi purificati utilizzando i primer di PCR utilizzati nello step 7.9.2 per determinare il genotipo dei cloni, come descritto precedente ay ^12.
10. Per la verifica tramite analisi Western Blot, estrarre proteine delle cellule di tipo selvatico e cloni mirati, come descritto in precedenza ^12.
    1. Effettuare analisi Western blot utilizzando anticorpi contro la proteina appropriate del gene bersaglio, come descritto in precedenza ^12; un vero e proprio clone di eliminazione diretta è privo di espressione della proteina.

Risultati

La tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente qui descritto è previsto per essere applicabile a qualsiasi regione targetable nel genoma in qualsiasi linea cellulare che è suscettibile di consegna DNA estraneo. Abbiamo già dimostrato la sua applicazione di mira tre geni in una linea di cellule di cancro del colon-retto ^12. Qui vi mostriamo la sua efficacia in genotipizzazione una linea di cellule di carcinoma epatocellulare, HepG2, mirata con un CRISPR...

Discussione

Il bussare fuori di un gene specifico in una linea cellulare modello di scelta è diventata routine per chiarire il ruolo che il gene gioca in quel particolare contesto cellulare. Infatti, più schermate genoma sono attualmente disponibili che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 target virtualmente tutti noti geni umani nel genoma ^{14, 15, 16.} Con questi schermi di grandi dimensioni (o anche su piccola scala mira dei singoli gen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003