CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Özet

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

Özet

Programlanabilir genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi spesifik genomik diziler hücreleri ve bütün organizmaların işlev görmesi de rol oynadıklarını anlamak için ters genetik kolaylaştırmıştır. Bu neden müthiş dızı CRISPR'nın yakın zamanda piyasaya sürülmüş araştırmacılar amacıyla, diğer şeylerin yanı sıra, genom ve transkriptom manipüle nakavt, yıkmak veya hedeflenen genlerinde vurmak için izin verir / Cas9 sistem çok yönlü bir araçtır ile yardım görmüştür tavır. bir gen nakavt amacıyla CRISPR / çift iplikli sonları kırılma yerinde nükleotidlerin çerçeve neden olan ekleme veya silme tanıtmak için homolog olmayan uç birleştirme DNA onarım yolağı işe Cas9 aracılı. Ancak, tek bir kılavuz RNA istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir ve bu ekarte etmek için, çok sayıda kılavuz RNA'ların kullanılması gereklidir. hedeflerin bu çokluğu Klonlardan yüksek hacimli tarama bu da bir ef kullanımını begs olan, gerekli olduğu anlamına gelirnakavt klonları Genotip yüksek verimli tekniği ficient. Güncel genotip teknikleri ya dolayısıyla yüksek verimli amaçlar için uygunsuz render kalıcı sınırlamalar muzdarip veya yüksek ücrete tabidir. Burada, bir şablon olarak ham hücre lizatı, genomik DNA kullanan florasan PCR kullanılarak ve daha sonra, kılcal jel elektroforezi ile PCR parçası çözme ayrıntılarıyla protokolü. Bu teknik, fragmanlar arasında bir baz çift farklılığı ayırmak için yeterince doğru ve dolayısıyla hedeflenen genin kodlama dizisine bir çerçeve kayması varlığını veya yokluğunu gösteren de yeterlidir. Bu kesin bilgi etkin bir şekilde teyit dizisi aşaması için ihtiyaç engellemektedir ve kullanıcıların sürecinde zaman ve maliyetten tasarruf sağlar. Burada ve başka yerlerde gösterildiği gibi Ayrıca bu teknik, bir çok genin karşı kılavuz RNA'lar tarafından hedeflenen çeşitli doku kaynaklarından çeşitli memeli hücrelerini genotipleme içinde çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır.

Giriş

Ters genetik yaklaşımlar bilim adamları hücrede veya bütün organizma üzerinde genomun spesifik değişikliklerle olası etkisini araştırmak için izin vermiş. Örneğin, belirli bir genin ekspresyonu, bu hücrenin veya fonksiyonu üzerinde sahip olduğu etkiyi tespit etmek amacıyla gen yok ^{etme, 1, 2} (kısmi azalma) ya da gen nakavt ^{3, 4} (tamamen ortadan) zayıflatılmış edilebilir organizmanın gelişimi.

Gen knockout deneyleri, çinko-parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) olarak dizi-spesifik programlanabilir nükleazlar, girmesinden bu yana kolay hale gelmiştir. Ancak, düzenli olarak kısa palindromik tekrarını (CRISPR) serpiştirildiği kümelenmiş nispeten son karakterizasyonu / Cas9 sistemi gen gerçekleştirmek için dünyanın herhangi bir laboratuvar için son derece kolay yapmıştırE nakavt deneyleri. Esas olarak, CRISPR / Cas9 sistemi iki temel bileşenleri-a tanır ve genomunda özel bir diziye baz tamamlayıcılık ile bağlanan tek bir kılavuz RNA (sgRNA), ve Cas9 adı verilen bir endonükleaz oluşur. genomik DNA üzerinde sgRNA-Cas9 kompleksinin spesifik bağlanma ve eylem sonrasında DNA çift iplikli bölünmesidir. Bu da, daha sonra, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homolog rekombinasyon (HR) yolları ile tamir edilir hücre, DNA hasarı yanıt mekanizması devreye girer. NHEJ onarım mekanizması (ancak sıcak mekanizması) çoğu zaman ekleme / silme (indel) mutasyonlar ile sonuçlanan tamir yerinde rasgele yerleştirilmesi veya nükleotidin silinmesi ile sonuçlanmasından dolayı, bir eksonun okuma çerçevesi kaymasına neden olabilir. Bu, daha ^sonra, bağlı çeviri ve anlamsız aracılı çürüme ^{5, 6} 'nın prematüre terminasyonuna genin nakavt sonuçlanabilir^7.

Bir gen nakavt CRISPR / Cas9 sisteminin katılmasıyla elde kolaylık rağmen, hedeflenen hücre klonlarının genotipleme özellikle ^{8, 9} ayar yüksek throughput, bir tıkanıklık kalır. majör kendine özgü sınırları acı veya mali masraflı, ya Mevcut teknikleri. Örneğin, ¹⁰ dupleksleri DNA uyumsuzluklarını bulgulamaktadır enzimatik bir deneyidir bilirkişi veya T7E1 tahlili, vahşi tipli ve homozigoz mutantlar klonlar ayırt etmek mümkün değildir, bu klonlar, alele sahiptir ve dolayısıyla bu yana (olan aleller aynı mutasyona uğratılır klonları), DNA dizisi ¹¹ uyumsuzlukları mevcut değildir. Buna ek olarak, yüksek verimli bir kurulumda, mutant klonları genotipleme altın standart olarak kabul edilir, Sanger sekanslanması, bir kullanımı, yüksek maliyet istenmemektedir. Burada, bir imhaya sunmakDiğer mevcut Genotipleme teknikleri limitlerini aşmak ve nükleaz aracılı nakavt klonlarının bir yüksek verimli bir ekranı yerine getirilmesinde özellikle faydalıdır floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniğinin ailed protokolü. Bu yöntem gerçekleştirmek için teknik olarak basit ve zaman ve maliyet tasarrufu sağlar.

Protokol

1. CRISPR / Cas9 hedefli tek hücre klonları elde edilmesi

1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş antibiyotik içermeyen Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 2 mL içerisinde oyuk başına 500,000 hücre 'ucunda bir 6-yuvalı plaka üzerinde Tohum HEPG2 hücreleri. 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 inkübe edin.
2. ile transfekte edilen hücreler, plasmid birlikte ifade, üretici talimatlarına uygun olarak, uygun bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak Cas9 ve ilgi dahilindeki gen karşı özel sgRNA.
   Not: daha önce ⁴ tarif edildiği gibi örneğin, sgRNA, pSpCas9 (BB) -2A-GFP vektörüne klonlanabilir.
3. Taze antibiyotik içermeyen ortam 2 ml ile transfeksiyondan sonra 16 saat - kültür ortamı 4 değiştirin.
4. Transfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, hücreler tripsinize ile tek bir hücre süspansiyonu toplanır.
   1. % 0.25 tripsin-EDTA, 0.2 mL hücreleri tripsinize ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. thoroughl ortamın 1 ml ilave edilir ve tekrar süspansiyony.
5. Daha önce ¹² açıklandığı gibi, GFP pozitif klonlar için hücreleri sıralama ve yaklaşık 3.500 hücreleri toplamak.
6. penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı 8 mL çanak başına 500, 1000 ve 2000 hücre 10 cm'lik kaplar GFP-pozitif kriteri, hücreler plaka. 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile inkübe hücreleri.
7. Da çıplak gözle görülebilecek kadar büyük tek hücreli koloniler halinde büyümeye kadar her beş günde ortamının değiştirilmesiyle, 37 ° C'de ve% 5 _CO2 hücreleri koruyun. En kanser hücre hatlarında, bu kaplama gününden itibaren yaklaşık iki hafta sürer.
8. Koloniler, uygun boyutta (çıplak gözle yani görülebilir) olduğu zaman,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 200 uL ihtiva eden 96 oyuklu bir kültür plakasının kuyularına ayrı ayrı koloniler aktarın.
   1. orta küçük bir hacimde olan bir 200 uL pipet kullanarak tek hücreli koloniler aspire. iyice hücreler in süspanse edinbirkaç kez ezilip karıştırılarak dividual kuyu.
9. % 90 kaynaşmaya - bunlar 50 ulaşana kadar, her beş günde ortamının değiştirilmesiyle, 37 ° C'de ve% 5 _CO2 hücreleri koruyun. 48 saat - en kanser hücre hatlarında, bu yaklaşık 24 sürer.

Doğrudan Liziz Yöntemiyle 2. Sıkma Ham Genomik DNA

1. Hücreler 50 ulaştığında -% 90 kaynaşmaya mümkün kullanılarak çok kanallı vakum emme ya da çok kanallı bir pipet gibi kuyu kültür ortamının kadar çıkarın.
2. her kuyuya (fenol kırmızısı olmadan)% 0.05 tripsin-EDTA, 25 uL ilave edin ve 7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice tripsinize hücreleri tekrar. onlar plastik yüzeyden ayrılmıştır emin olmak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin.
4. bir boş, 96 kuyulu kültür plakasından için tek bir hücre süspansiyonu, yaklaşık 5 uL aktararak bireysel klonların bir sureti oluşturmae. Her bir oyuğa, kültür ortamı 200 uL ekleyin ve pozitif klonlar flöresanlı PCR kapiler jel elektroforezi (aşağıya bakınız) kullanılarak tespit kadar hücreleri korumak. Seri olarak 10 cm'lik kaplar ya da tercih edilen başka bir ölçeğe hücreleri genişletmek (bölüm 7).
5. Bir (10 mM Tris pH 8.0, 2.5 mM EDTA, 0.2 M NaCI, 0.15% SDS ve% 0.3 Tween-20) ev yapımı direkt lizis tamponu 10 uL ¹² adım 2.3 tek hücre süspansiyonu 5 uL ekleyin 96-PCR plaka ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ile iyice karıştırın. Santrifüj kısa bir süre (kuyu dibine sıvı getirmek için).
6. Birlikte adım 2.4 den suret ile, adım 2.3 hücre süspansiyonu geri kalan ~ 15 uL kültür ortamı 200 uL ekleyin ve 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile inkübe edin.
7. 3 saat 65 ° C: Tüm hücre lizizi ve genomik DNA bırakılmasını sağlamak için, aşağıdaki ısı çevrimi programa adım 2.5 den lizatları Konu0 s, 30 s için 8 ° C sıcaklıkta 1.5 dk, 1 dakika için 3 dakika boyunca 1 dakika için 3 dakika boyunca 97 ° C, 8 ° C, 65 ° C, 97 ° C, 1 saat 65 ° C, 65 ° C dakika ve 10 dakika boyunca 80 ° C. lizatları kısaca santrifüjleyin.
8. nükleaz içermeyen su 40 mcL ekleyerek lizatları seyreltin ve bir vorteks karıştırıcı kullanılarak iyice karıştırın. Santrifüj kısaca. seyreltilmiş lizatlar hemen kullanılabilir veya kalite kaybı olmadan, birkaç ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.

CRISPR / Cas9 hedef bölgesini genişletmek üzere Floresan PCR yapılması 3.

1. Her bir CRISPR / Cas9 hedef bölgenin tasarım, iki florofor ile işaretlenmiş ileri primerler (her ikisi de 5' ucunda etiketlenmiştir); birbirinden iki ayrı hedef bölgesinde (hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol ve CRISPR / Cas9 hedefli klonlar mavi fluoroforla işaretlenmiş primer için, örneğin, yeşil fluoroforla işaretlenmiş primer olarak düşünülmelidir 300 bp'den daha başka siteleri kesilmesi; Materia bakınız Tablo ls).
   1. Bu ileriye etiketlenmiş primerler ve etiketlenmemiş bir ters primer uygun olarak temin edin. 500 bp long - astarlar seçtikleri bir aracı kullanarak dizayn edilebileceğini ve amplikonlarının 200 olması gerektiğini unutmayın.
2. Etiketlenmiş primerler kullanılarak, hedef bölgeleri amplifiye etmek için daha önce tarif edildiği ^{gibi, 12} PCR gerçekleştirin.
   1. 20 pL reaksiyon aşamasında 2.8 seyreltilmiş lizatlarının 3 uL kullanarak ve takip eden termal devir programı (bakınız Tablo 1): 10 dakika boyunca (1 döngü) ile 94 ° C; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 64 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 61 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 58 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 55 ° C ve 1 dakika için 68 ° C (35 döngü).
3. boyut ve amplikonlarının nispi miktarı kontrol etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR amplikonlarının 5 uL çözmess = "xref"> 12.
   NOT: Tüm numuneler için bu adımı Sahne teşvik fakat gerekli değildir; Örneklerin belirli sayıda çözülmesi genel olarak, numunelerde amplikonların miktarını tahmin etmek için yeterlidir.

Kapiller jel elektroforezi 4. Numune Hazırlanması

1. yaklaşık olarak 2.5 ng / uL nükleaz içermeyen su içinde Vahşi tip (hedefsiz ana hücreler) ve CRISPR / Cas9 hedefli DNA amplikonları seyreltin. (Gerekli olan hedef numune başına seyreltilmiş yabani tip numunenin 0.5 uL az) Her bir hedef DNA örneği ilave edilecek kadar vahşi tipli DNA numunesinin seyreltilmesi için emin olun.
2. Eşit oranda seyreltilmiş yabani tür ve hedef DNA örnekleri karıştırın (örneğin, hedef numunesinin 1 uL, vahşi tipli numunesinin 1 uL karıştırıldı).
3. Genetik An ile uyumlu olan bir 96 çukurlu PCR plaka deiyonize formamid 8.7 uL, boya etiketli boyut standardı 0.3 uL karışık amplikonların 1 uL ekleyinalyzer.
   Not: formamid bir ana karışımı ve boyut standardı kullanımı (diğer bir deyişle, formamit bir ön karışım, bir preparat ve bir 29 boyut standardı: standart miktarlarda sağlamak için önce amplikonların ilavesinden 1 oranında) kullanılması tavsiye edilir.
4. Sıkıca plaka sızdırmaz ve bir PCR thermocycler 3 dakika süreyle 95 ° C'de numunelerin ısıtın.
5. Hemen, ısıtma aşamasından sonra buz üzerinde plaka yerleştirin ve en az 3 dakika süreyle inkübe edin.

5. Bir Genetik Analiz cihazında Kılcal Jel Elektroforez Sahne

1. Deney parametreleri, enstrüman protokolü ve genetik analiz bağlı kılcal jel elektroforezi yazılım boyut çağrı protokolü ayarlayın.
   NOT: Bu adım sadece ilk elektroforez çalışması için gereklidir; Program ileride kullanmak üzere kaydedilebilir. sonraki işlemler için, 5.2 adıma gidebilirler.
   1. Yazılım gösterge tablosunda "Yeni Plate Oluştur" ikonuna tıklayın.
   2. r verun bir kukla adı ve aşağıdaki seçenekleri belirleyin: kuyu sayısı, 96; Levha Tipi, parça; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7. "Ata Plaka İçeriği" butonuna tıklayın.
   3. Altında "Tahliller", "Yeni Testi Oluştur" tıklayın; Yeni bir paneli görünecektir.
   4. deneyi "FPCR-CGE Tahlili" adlandırın ve "Uygulama Türü" doğru olarak ayarlanmış olduğundan emin olun "Fragment."
   5. altındaki "Create New" butonuna tıklayarak enstrüman protokolünü kur "Enstrüman Protokolü."
      1. Set veya uygun alanlarda aşağıdaki seçenekleri ve parametreleri seç: Uygulama Türü, Fragment; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7; Boya Set, G5; Çalışma Modülü, FragmentAnalysis; Protokol Ad, FPCR-CGE Enstrüman Protokolü; Fırın Sıcaklık, 60 ° C; Gerilim çalıştırın 19.5 kV; Ön çalıştırma voltajı, 15 kV; Enjeksiyon voltajı, 1.6 kV; Çalışma Süresi, 1330 s; Ön çalıştırma zaman, 180 s; Enjeksiyon zamanı, 15 s; ve Veri Gecikme, 1 s.
   6. Cı"Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna Tran programını kaydetmek için. Devam etmek için paneli kapatın.
   7. altındaki "Create New" butonuna tıklayarak bir boyut çağıran protokol kur "Sizecalling Protokolü."
      1. Set veya uygun alanlarda aşağıdaki seçenekleri ve parametreleri belirleyin: Protokol Adı, FPCR-CGE Sizecalling Protokolü; Boyutu, standart, GS500 (-250) Liz; Boyut-Arayan, SizeCaller v1.1.0; Analiz Ayarları -; Analiz Menzil, Tam; Boyutlandırma Menzil, Tam; Yöntem, Yerel Güneyli çağrılması Boyutu; Astar Tepe, Bugünü; Mavi, Yeşil, Turuncu Kanalları, (Kontrol); Asgari Tepe Yüksekliği, tüm kanallar için 175; Yumuşatma, Hiçbiri kullanın; Kullanım baselining (Temel Pencere (PTS)), (kontrol) 51; Minimum pik yarı genişliği, 2; Tepe Pencere Boyutu, 15; Polinom derecesi, 3; Yamaç Eşik Tepe Başlat, 0.0; Yamaç Eşik Tepe Sonu, 0.0; QC Ayarları -; Boyut Kalite, -; Değer ise <0.25 başarısız; Değer ise <0.75 geçirin; 80 0 bp'den Doğrusallık varsayalım0 bp; ve harekete geçirir Çekme üste bayrağı Çekme 0,1 ≤ oranı ve çekme Scan ≤ 1.
   8. Programı kaydetmek için "Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna tıklayın. Devam etmek için paneli kapatın.
   9. tahlil "Kaydet Kütüphanesi" butonuna bir kez daha tıklayarak kaydedilmiş olduğundan emin olun ve "Kapat" düğmesine tıklayarak paneli çıkın.
   10. Geri "Ata Plaka İçindekiler" sayfasında, altında "Yeni Dosya Adı Konvansiyonu oluştur" linkine tıklayın "Dosya adı Sözleşmeleri."
   11. Programı Ad "FPCR-CGE Dosya Adı".
   12. Altında "Kullanılabilir Öznitelikler," (örneğin, "Run tarihi", "Run Time," "Eh Konumu", ve "Örnek Adı" gibi) dosya adında görünür istenen özelliği seçin. seferin sonuçları saklanır istenen dosya konumu seçin.
   13. Daha sonra "Uygula Testiyle" butonuna tıklayın ve"Kaydet Kütüphanesi" tuşuna basarak programı kaydedin. Devam etmek için paneli kapatın.
   14. Geri "Plaka İçeriğini atama" sayfasında, altında "Yeni Sonuçlar Grup Oluştur" bağlantısını tıklayarak "Sonuçlar Gruplar."
   15. Programı Ad "FPCR-CGE Gruplar sonuç."
   16. Altında "Kullanılabilir Öznitelikler," (örneğin, "Tahlili Adı" olarak) dosyası adında görünür istenen özelliği seçin. seferin sonuçları saklanır istenen dosya konumu seçin.
   17. Programı kaydetmek için "Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna tıklayın. Devam etmek için paneli kapatın.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek çalıştırın bir elektroforez için programı kurun.
   1. paneline git ve "Yeni Plate oluştur" simgesine tıklayın.
   2. (Kolay referans tarihi, hücre çizgisi ve gen adını içerir) istenen şekilde çalıştırmak adı. Aşağıdaki seçenekleri belirleyin: kuyuların sayısı96; Levha Tipi, parça; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7. "Ata Plaka İçeriği" butonuna tıklayın.
   3. Arzu edildiği gibi örneğin her kuyu etiketleyin (örneğin, bir örnek de, bir negatif kontrol olduğunu belirtmek için "NC" adlandırılabilir).
   4. "Tahliller", "Dosya Adı Sözleşmeleri" ve "Sonuçlar Gruplar Altında Ekle Kütüphanesi'nden" bağlantı "kutuları, click" ve 5.1.17 adım 5.1.3 oluşturulan programları seçin.
   5. Analiz edilecek tüm kuyuları vurgulayın ve altında ilgili programları seçin "Tahliller", "Dosya Adı Sözleşmeleri" ve "yanlarındaki kutuları işaretleyerek Sonuçları Gruplar".
3. Genetik analiz tepsinin üzerine plaka yüklemeden önce, 96 oyuklu bir plaka üzerinde kauçuk conta uygulamak ve genetik analiz ile birlikte plastik durumda kapalı bir tabak koydu.
4. Genetik analizör önünde "Tepsi" düğmesine basın ve ne zaman tepsi yenidenKapıyı açıp tepsiye kaplı plaka yük, ekipmanın ön ağrıyor. Plaka yerine kilitli olduğundan emin olun ve ardından kapıyı kapatın.
5. düğmesinin "Çalıştır için bağlantı Plate" seçeneğini tıklayın.
6. "Yük Tabaklar Run için" sayfasında, tüm reaktifler ve koşullar doğru ve sırayla olmasını sağlamak için son bir kontrol yapmak.
7. "Başlat Çalıştır" butonuna tıklayın. 24 örnek (96 oyuklu plakanın birinci 3x8 kuyu) her biri, çalışma tamamlamak için en az 55 dakika sürer.

Elektroferogramıyla 6. analizi baz-çifti Farklar belirlemek için

1. kapiler jel elektroforez işlemi tamamlandığında, sonuçlarını analiz etmek için analiz yazılımı açın.
2. simgesi "Proje ekle Örnekler" ve çalıştırma dosyaları içeren klasör aramak tıklayın. adım 5.1.12 sonuç dosyalarının atanan konum dan hatırlayın.
3. tamamlanan koşu ve cl her enjeksiyonun tüm sonuçlar dosyaları seçin"Listeye Ekle" butonuna Tran; Bu dosyaların isimleri "INJ" ile başlayan ve çalışmasının ayrıntılarını içermektedir.
4. analizi ile devam etmek için "ekleyin ve Analiz" düğmesine tıklayın.
5. İlk örnekteki tıklayıp son numuneye kadar aşağı imleci sürükleyerek vadede bütün örneklerini seçin ve ardından "Görüntü Entrikalar" simgesine tıklayın.
6. Turuncu simgesini kontrol ve renkli simgeler kalanını işaretini kaldırarak sonuçların portakal kanal açmak, boyut standardı kalitesini kontrol etmek; Bu boyut çağıran doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için önemlidir.
7. hedeflenmemiş kontrol türetilen fragmanları ve hedeflenen klonlarına karşılık gelen tepe noktaları görüntülemek için, bu kanallardan okumaları açık mavi ve yeşil ikonlar kontrol edin.
8. İlk sonuçlar arsa ve seçmek için sağ tıklayıp yatay eksen üzerinde imlecini "Tam Görünüm." belirlemek için bir bakışta tüm sonuçlarını görüntülemek için aşağı kaydırınrun ile herhangi bir büyük sorun varsa. arsa ilgili ekseninde fareyi sağ tıklatın değerlerin belirli bir aralıkta yakınlaştırmak için, "Zoom To ...," seçim ve ilgi değerler aralığında anahtar.
   NOT: Bir potansiyel büyük sorun bütün numuneler düşük yoğunluklu zirveleri vermeniz. Bu, kapiler elektroforez ya da kolayca PCR işlemini tekrarlama ile ya da sırasıyla, bir düşük seyreltme faktörü kullanılarak amplıkonları seyreltilmesi ile giderilebilir amplikonların aşırı seyreltme öncesinde fluoroforla işaretlenmiş amplikonların uzun süreli depolama için genellikle.
9. Sonuçları kaydetmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. mavi ve yeşil kanalları seçilmiş olduğundan emin olun ve "Boyutlandırma Tablosu" simgesine tıklayın.
   2. "Dosya" açıp seçerek sekme ayrılmış metin (.txt) biçiminde değerleri tablosuna Kaydet "İhracat Masa." buna göre Dosyayı adlandırın ve seçtikleri dosya konumu seçin.
   3. arsa kaydetmek içinPDF formatındaki çalışmasının lar, "Dosya" gidin ve "Yazdır" seçeneğine tıklayın. İlgili PDF yazar ve basın seç "Yazdır". buna göre Dosyayı adlandırın ve seçtikleri dosya konumu seçin.
10. hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol ve CRISPR / Cas9 hedefli klonlarından türetilen parçalarının büyüklüğü farkı hesaplamak için, aşağıda açıklandığı gibi yapılmalıdır.
    1. Bir elektronik tablo programı ile adım 6.9.2 sekme ayrılmış metin (.txt) dosyasını açın. tablo bu dört önemli sütunları içermelidir: "Boya / Numune Zirvesi" (mavi veya yeşil kanalı belirten), "Örnek Dosya Adı", "Boyut" (ilk karakter kuyu veya örnek adını belirtiniz) (boyutunu gösteren fragmanı olarak adlandırılır) ve tepe floresans yoğunluğunu gösteren "yüksekliği" ().
    2. İlgili zirveleri tek tek için beklenen boyut aralığı içinde olmayanlar da dahil değildir.
       NOT: Genellikle, indel mutasyonlar nadiren daha sonuçlanabilirboyutunda bir 100-bp farkından; Bu şekilde, boyutu (yeşil kanaldaki hakim zirve), vahşi tipli kontrol zirveden fazla 100 bp farklılık tepe hariçtir. Bu kolayca elektronik tabloda "Koşullu Biçimlendirme" fonksiyonu altında seçenek "Arasında" kullanılarak yapılabilir.
    3. taban seviyesinden ayırt edilemeyen spesifik olmayan zirveleri, kaldırmak için, kimin yükseklikleri 2.000 birimlerinin daha düşük doruklarına dışlamak için tablo programında "Koşullu Biçimlendirme" fonksiyonu altında "daha az" seçeneğini kullanın. Bu kesme değeri, deneysel olarak tespit edilmiş ve uyum gördüğü durumlarda, bu nedenle ayarlanabilir.
    4. Birinciden ikinci çıkarılarak mavi kanal (CRISPR / Cas9 hedefli klon) ve yeşil kanalı (hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol) tek tepe sonuçlanan tepe her biri arasında, fragman büyüklüğündeki farkı hesaplanır.
       NOT: Her kılcal Elektrofore atfedilen değerleri kullanmak önemlidirESIS örnek olarak doğal suş kontrol parçası boyutu arası örnek farklılıklar olabilir.
    5. en yakın tamsayıya değerleri kapalı yuvarlak içine veya söz konusu genomik sekans varsa, silinmiş baz çifti sayısının belirlenmesi için. bir gen nakavt ilgi olduğunda, kimin indel mutasyonlar değil 3 bp katları olan seçme klonları kodlama sekansında çerçeve kayması olmamasını sağlamak için.

Klonların Nakavt Durumu 7. Doğrulama

1. % 0.25 tripsin-EDTA, 25 uL kullanılarak hücrelerin tripsinize ve 5 dakika için 37 ° C'da kuluçkalama ile 24 oyuklu plakaya (adım 2.4 ve 2.6 ile), 96 oyuklu plakadan tek nakavt klonlar Expand.
2. trisinize edilmiş hücrelerin orta ila 125 uL (% 10 FBS ile takviye edilmiş) ilave edilir ve iyice yeniden süspanse edin.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
4. Mümkün kullanılarak vakum emme ya da pipet gibi ortam kadar çıkarın ortamının 500 uL hücre pelletini, ve 24-çukurlu plaka iyi hücre süspansiyonu aktarın. Hücreler% 80-90 ulaşana kadar 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile inkübe edin.
5. 24 gözlü levhadan 6 kuyulu bir plakaya ve 6 oyuklu plaka bu 80 ulaşmak 10 cm'lik bir tabak için seri olarak tek tek klonlar genişletme - aşağıdaki miktarlar kullanılarak tekrar adım 7.1 ve 7.4,% 90 kaynaşmaya: % 0.25 50 uL tripsin-EDTA ve (6-çukurlu plaka 24 gözlü levhadan genişletilmesi için) ortamın 150 uL ve% 0.25 200 uL tripsin-EDTA ve ortamın 1 ml (6- genişletilmesi için oyuk) 10 cm'lik bir tabak için plaka.
6. % 0.25 tripsin-EDTA 1 mL kullanılarak ve 5 dakika için 37 ° C'de inkübe hücrelerin tripsinize% 90 kaynaşmaya - bunlar 80 ulaştığında klonlar hasat.
7. trisinize edilmiş hücrelerin ve resuspe orta ila 5 mL (% 10 FBS ile takviye edilmiş) ilaveİyice nd.
8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de iki adet 15 ml tüpler, santrifüj içine eşit hücre süspansiyonu aktarın ve mümkün olduğu kadar orta kaldırmak. hücrelerin bir kısmı, genomik DNA izolasyonu için ve diğer toplam protein ekstre içindir.
9. Sanger dizileme yoluyla doğrulama için aşağıda açıklanan adımları uygulayın.
   1. Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 12} klon, genomik DNA ekstrakte edilir.
   2. Bölüm 3.2 de tarif edildiği gibi, CRISPR / Cas9 hedef bölgenin kapsayan bölgenin PCR amplifikasyonu gerçekleştirmek ancak işaretlenmemiş primerler kullanılır. etiketten floresan müteakip Sanger sıralama adımı engel olacak şekilde, bu adım için işaretli primerler kullanmayın.
   3. Daha önce tarif edildiği gibi ^12, bir PCR temizleme kiti kullanılarak amplikonları arındırın.
   4. tarif previousl olarak klonların genotipini belirlemek için aşama 7.9.2 kullanılan PCR primerleri kullanılarak saflaştırılmış amplikonları, Diziy ^12.
10. Daha ^{önce, 12} anlatıldığı gibi Batı benek analizi ile doğrulaması için, vahşi tipli hücreler ve hedef klonlardan total protein ekstrakte edilir.
    1. Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 12,} hedef genin proteine karşı uygun antikorlar kullanılarak Western blot analizi gerçekleştirir; gerçek bir nakavt klonu protein ekspresyonu yoksundur.

Sonuçlar

Burada tarif edilen floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniği yabancı DNA teslim için uygun olan hemen hemen herhangi bir hücre hattında genomunda hedeflenebilir bölgesi için geçerli olması beklenmektedir. Daha önce, bir kolorektal kanser hücresi hattı ¹² üç geni hedef alan ile uygulanmasına göstermişlerdir. Burada, bir dızı CRISPR'nın hedeflenen bir hepatoselüler karsinom hücre hattı, HepG2, genotipleme kendi etkinlik / Cas9 1 (NAP...

Tartışmalar

seçim modeli hücre hattında spesifik bir genin nakavt geni söz konusu hücresel bağlamda oynadığı rol ortaya çıkması için rutin hale gelmiştir. Aslında, çeşitli, genom çapında taramalarla genom ^{14, 15, 16,} hemen hemen tüm bilinen insan dizilerini hedef CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak şu anda mevcuttur. Bu büyük ölçekli ekranlar (veya ilgili tek tek genlerin hedeflenmesi daha küçük ölçekli) ile tasar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003