JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.

Abstract

השחלה הוא האיבר הראשי של מערכת הרבייה הנשית, חיוני לייצור של גמטות הנשי ולבקרה המערכת האנדוקרינית, אבל את מערכות היחסים המורכבות מבני תלת מימד (3D) להערכת ארכיטקטורות של השחלה מתוארים לא טוב. על מנת להמחיש את חיבורי 3D ואדריכלות של כלי הדם בשחלה ללא פגע, הצעד החשוב הראשון היא להפוך את השחלה שטיחות ברורה. כדי למנוע התכווצות של רקמות, היינו את הידרוג המבוסס על קיבוע בהירות פסיבי (החלפת השומנים נקה קשיח hybridized אקרילאמיד הידרוג רקמות הדמיה / Immunostaining/ב באתרו הכלאה-תואם) פרוטוקול השיטה כדי לנקות שחלה ללא פגע . Immunostaining קונפוקלית multiphoton מתקדמות, תמונות 3D-שחזורים ואז שימשו את הפריט החזותי של כלים השחלות נימים הזקיקים. באמצעות גישה זו, אנחנו הראו מתאם חיובי משמעותי (P < 0.01) בין האורך נימים הזקיקים, נפח של הקיר הזקיקים.

Introduction

הזקיק הוא יחידת מבניים ופונקציונליים של השחלה, התפתחותו קשורה מאוד להערכת בתוך השחלה. כלי הדם לספק תזונה והורמונים לנשירה, וכך לשחק תפקידים חשובים גדילה, התבגרות של זקיקי1.

שילוב של טכנולוגיות, כולל כלי דם סלקטיבי סמני עכבר הטרנסגניים מודלים, פיתוח פרמצבטי, הגדילו את הידע שלנו אודות רשתות כלי דם השחלות, אנגיוגנזה את תפקוד כלי הדם folliculogenesis. השחלה מכונה איבר פעיל כי זה remodels שונים רקמות, רשתות כלי דם במהלך folliculogenesis, ביוץ. כזה שיפוץ פעיל ב גודל ומבנה של כלי נדרש עבור הפונקציה הביולוגי של פיתוח, גיוס זקיקים.

שיטות היסטולוגית ו histomorphometric מסורתיות באמצעות סעיפים השחלות ו immunolabeling של כלי הדם מוגבלות דו-ממדית (תמונות דו-ממד)2. עם התפתחות טכנולוגיות שחזור תלת מימדי (3D), תמונות דו-ממד של רקמות פרוסות יכול להיות חופף כדי להפוך מבנה תלת-ממדי, אך לשיטה זו יש עדיין כמה מגבלות — חלוקתה של הרקמה יכול להרוס את מזערים, חלקים מסוימים לעתים קרובות חסרים רקמות, עבודה משמעותית מעורב בביצוע שחזורים תלת-ממדיים מתמונות המתקבל פרוסות. כל רקמה הדמיה תלת-ממדית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול להתגבר על רבות מההגבלות הללו, אך שיטות אלה מוגבלות להערכת אנגיוגנזה של השחלה עובריים3. השימוש ברקמה כל ניקוי שיטות כגון בהירות4 יכול להגביר את עוצמת מטמיעים כדי לפתור את הבעיות האלה של השחלות כמחנכת, למבוגרים, שיטות כאלה לספק אישור אופטי של השחלה ללא כל העיוותים מבנית. הדמיה של הארכיטקטורה תלת-ממד של השחלה שלם מספק מסד נתונים של תמונה מדויקת עבור תוכנת ניתוח התמונה, כגון חבילת התוכנה Imaris נעשה שימוש בעבודה זו.

שיפוץ של השחלה ברחבי לבגרות הוא חלק מערכת פיזיולוגית דינאמית, וזה יהפוך השחלה מודל מצוין עבור חקירות ברגולציה של אנגיוגנזה. יתר על כן, להעריך את התפקיד של כלי הדם השחלות בתנאים פיפטות של מערכת הרבייה הנשית כגון תסמונת שחלות פוליציסטיות או סרטן השחלות יכול להילמד דרך רקמות השחלה כל הדמיה. הפיתוח של שיטת בהירות פסיבית ושימוש של תמונה מתקדם ניתוח תוכנה סיפקו מידע מרחבי מפורט על הקשרים בין כלי הדם ולא השחלה מבנים כמו זקיקי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אחרי ההנחיות של ועדת האתיקה חיה בשנחאי מדיקל קולג ', אוניברסיטת פודאן (אישור מספר 20160225-013).

1. הכנת השחלה העכבר שקוף

  1. אופן ההכנה של פתרונות
    1. להכין תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) פתרון (1 מ', pH 7.6) עם 0.1% טריטון X-100 (PBST). כדי להפוך את 1 ליטר של פתרון מניות PBS x 10, לערבב 87 גר' NaCl, 3.1 גר' NaH2PO4 · 2H2O ו- 28.7 גר' נה2HPO4 ·12H2O. להוסיף dH2O ל- 1 L ומערבבים ~ 2 ה התאם ל pH 7.4 עם 1 N NaOH ולאחסן בטמפרטורת החדר. לדלל את הפתרון מניות 10 x 1/10 באמצעות dH2O ובצע 0.1% X-100 Triton ב- PBS.
    2. להכין את הפתרון הידרוג (pH 7.5) על ידי mixings 4% (wt/כרך) paraformaldehyde (PFA) פתרון, 4% (wt/כרך) אקרילאמיד, bisacrylamide 0.05% (wt/כרך) ו- 0.25% (wt/כרך) יוזם VA-044 במים מזוקק פעמיים על קרח.
    3. הכן את פתרון סליקה (pH 8.5) על ידי ערבוב נתרן בוראט 200 מ"מ מאגר המכיל 4% (wt/כרך) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים מזוקק פעמיים.
  2. הכנה זלוף, השחלה Transcardial
    1. לשמור על כל הפתרונות על קרח במהלך כל ההליכים.
    2. עזים ומתנגד למבוגרים נקבה פראי סוג העכבר C57BL/6 עם זריקה בקרום הבטן של פתרון פנטוברביטל (0.35 מ ג/ק ג). ברגע זה מראה שום תגובה הבוהן-קורט, העכבר הוא מורדם כראוי.
    3. שימוש בסרט. הדביק לתקן את העכבר עם הגפיים שרוע על לוח שטוח מוקצף.
    4. לחשוף את הלב על ידי חתך על הסרעפת דרך החזה, עור, עצמות עם מספריים.
    5. בחתך אל העלייה הימנית של החיה ולאחר מכן perfuse החדר השמאלי עם 20 מ של PBS קר כקרח 1 x ב- 10 מ ל/דקה.
    6. Perfuse החיה לפחות 20 מ"ל של הידרוג פתרון ב- 10 מ ל/דקה.
    7. תחתכי את העור מעל הבטן לאורך הקו medioventral עם מספריים, שחושף את כל enterocoelia, ולהסיר את המעיים. לאסוף את השחלות, כמו גם הרחם כדי לשמור על היושרה של מורפולוגיה השחלות.
    8. הסר את רקמות השומן סביב השחלה תחת מיקרוסקופ.
  3. Degassing
    1. מקם את השחלות 10 מ ל תמיסת הידרוג ב 4 ° C עבור קיבעון במשך 3 ימים.
    2. העברת השחלה לתוך צינור 5-mL ולמלא את הצינור עם הידרוג פתרון. למתוח את מצלמות-מיקרוסקופים מעל החלק העליון של הצינור, ואז לעטוף מצלמות-מיקרוסקופים סביב צווארה של הצינור.
      התראה: ודא כי ישנם אין בועות בין מצלמות-מיקרוסקופים את הפתרון הידרוג.
    3. מניחים את הצינורית על מטרף בחממה ב 37 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שעות כדי לאפשר את הידרוג פולימריזציה.
    4. להסיר את השחלה של הג'ל בעזרת מרית, בזהירות להסיר את הג'ל עודף מ סביב השחלה על ידי נייר טישו. לשטוף את השחלה ארבע פעמים עם 1 x PBS.
  4. סליקה פסיבי
    1. להטביע את השחלה ב 10 מ"ל של הפתרון סליקה. מנערים בעדינות על סל ד 80 ב 37 ° C כדי להתחיל את תהליך ניקוי.
    2. בשבוע הראשון, לשנות את הפתרון כל 3 ימים. אחרי שבוע אחד, לרענן את פתרון סליקה לאחר שבוע עד השחלה נעשה ברור. בדרך כלל תהליך זה לוקח כ- 2-3 שבועות.
      הערה: השחלה ניתן ישירות immunostained או יכול להיות מאוחסן אזיד הנתרן (0.02%) ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני immunostaining.

2. Immunostaining

  1. לשטוף את השחלה פעמיים ב PBST ביום 1-37 מעלות צלזיוס על מטרף.
  2. דגירה השחלה על מטרף בפתרון נוגדנים ראשי/PBST (טבלה 1) על יום 2-3-37 מעלות צלזיוס. העבודה המוצגת כאן, הנוגדנים העיקרי היו תאי אנדותל-טסיות אדהזיה מולקולה 1 (CD31), טירוזין hydroxylase מדולל ב 1:10 ו- 1:50 ב- PBST, בהתאמה.
    התראה: אם שניים או יותר סוגים של נוגדן ראשוני משמשים, ודא כי ישנם מקורות בעלי חיים שונים.
  3. לשטוף הנוגדנים הראשי באמצעות מאגר PBST ב 37 מעלות צלזיוס ביום 4 על מטרף.
  4. דגירה השחלה עם נוגדנים משניים הרצוי ב- PBST-יום 5-6-37 מעלות צלזיוס על מטרף. העבודה המוצגת כאן, הנוגדנים משני היו אלכסה הקמח 488 טירוזין hydroxylase, אלכסה הקמח 594 עבור CD31 מדולל 1:50 ב- PBST.
  5. לשטוף את הנוגדנים משני עם מאגר PBST ב 37 מעלות צלזיוס ביום 7 על מטרף.
  6. להעביר את הרקמה לתוך שבירה התאמת פתרון שבירה המגון ביום 8. לשים את הרקמה על פיסת נייר עם קווי רשת כדי לבדוק את בהירות חזותית על-ידי בדיקה אם ניתן לראות את קווי הרשת. ברגע הרקמה יש מלא הובהרו, זה יכול לדימות.
  7. להפוך גליל putty יכול רק המקיף את הרקמה, לעצב אותם לצורת פרסה ואז הקש על הרכס החיצוני בחוזקה על זכוכית כדי להפוך חלל אטום. הגובה של הטיט צריך להיות גבוה יותר השחלה.
  8. למקם את השחלה מובהר בזהירות לתוך המרכז של הטיט ולהוסיף שבירה התאמת פתרון. לשים קערת זכוכית-התחתון מעל הטיט בחוזקה ולהשתמש פוטי לתקן את המנה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, שבלוח "ני-E" לבחור את העדשה (ב זה מקרה טבילה במי 25 X עדשה אובייקטיבי, 1.1-נה, מ מ 2-WD) עם המרחק עובד תקין (במ מ 2.0 במקרה הזה).
  2. בחלונית ' "רכישת" ', בחר את מספר הערוצים. . כאן, להשתמש בשלושה ערוצי.
    1. תחילה, השתמש הכרטיסיה "עין יציאה" והיא הג'ויסטיק בקר XY כדי לעבור את הרקמה במרכז השדה על-ידי בדיקה דרך עיניות מיקרוסקופ.
    2. לאחר כיבוי האור תריס, לחץ על הכרטיסיה "חי" כדי להתאים את "כוח לייזר", "HV (רווח)", ו "היסט" עבור כל ערוץ בנפרד. כוח עליון לייזר ו- HV יכול להוביל אותות גבוה יותר, היסט גבוה יותר יכול להפחית את רעשי הרקע.
    3. בחר את נאות "גודל סריקה" ואת "ספירה". השתמש גודל סריקה של 1024 x 1024 מיקרומטר2 ספירה של 4 עד 8.
  3. לאחר הגדרת איכות התמונה להגדרת עומק הרקמה בחלונית "Z בעוצמה correction", לאחר איתור העדשה ברובד העליון של השחלה (במרכז של הרקמה) והזזת הרכישה עבור השכבה העליונה, לחץ על "פלוס" לחצן כדי להגדיר את השכבה העליונה.
    1. להזיז את העדשה, להגדיר את HV מתאימה ואת עוצמת הלייזר על החלק התחתון של הרקמה ולהוסיף את המידע השכבה הנמוכה ביותר אל הטבלה תיקון Z-עוצמת. לחץ על "כדי ND" כדי לסנכרן את ההגדרה עם הפאנל "ND רכישה".
  4. בתוך "ND הרכישה" פנל, הסט הראשון מספר סריקה צעדים. לאחר מכן, לתקתק את הכרטיסיות "Z" ו- "תמונה גדולה".
    1. . לך לחלון 'סריקה תמונה גדולה' כדי להגדיר את גודל השדה לפי הגבול של הרקמה בעזרת ויזואליזציה רקמות דרך עיניות לחזור ללוח "ND רכישה" קלט את גודלו של אזור הסריקה ("שדות") ובחרו את החפיפה בין 10% ל-15%.
    2. לחץ על "הפעל Z correction", לא "תברח עכשיו", באופן אוטומטי לקבוע את נאות HV, עוצמת הלייזר, ההיסט עבור כל שכבה, ולחכות התמונה כדי לעבד.

4. 3D שחזור של זקיקי בודדים, Vasculatures שלהם

  1. תחילה, השתמש ImageJ5 כדי לפתוח את הקובץ המקורי ש ח. לחץ על הלחצן 'תמונה' ובחרו את "צבע" ואת 'פצל ערוצים'. לאחר מכן, לחץ על "קובץ", בנפרד לשמור את הערוצים כסידרה קובץ tiff באמצעות האפשרות "רצפי תמונות" ב- "שמירה בשם".
  2. השתמש Imaris כדי לפתוח את אחת מהאפשרויות הסדרה קובץ tiff. לחץ על כפתור "ערוך" ובחר באפשרות "הוסף ערוצים" כדי להוסיף את שאר הערוצים. הכרטיסיות "התאמת התצוגה" יכול לשנות את השם ואת הצבע של הערוץ. העובי של הרקמה ייתכן שיהיה עליך לתקן בחלונית 'תמונות מאפיינים' ברשימה הנפתחת תחת "עריכה".
  3. חיתוך תלת-ממד של תמונות הסופי, הסרה של חלקים עודף, לחץ על כפתור "ערוך" ובחר "חיתוך 3D". ניתן לכוונן את הגודל של השדה על-ידי גרירת הגבול.
  4. לשחזר את האותות כלי עם האלגוריתם חוטים בחלונית ' Surpass ', לחץ על לחצן "חוטים" כדי ליצור נימה חדשה ולחץ על הבא.
    1. על מנת להגדיר הגדול ביותר של הקוטר הדק, ללוח "פרוסה" ומצא את הספינה העקיבה. המרחק יוצגו באופן אוטומטי על הלוח "מדידה" על-ידי בחירת שתי נקודות-הרוחב המרבי של כלי השיט.
    2. חזור ללוח "Surpass", קלט את רוחב מדוד ולחץ על הבא.
  5. התאם את סף נקודת המוצא ואת הזרע. בחלונית ' "המצלמה" ', בחרו 'בחר'. אם חלק הכדורים באופן אוטומטי המיוצרים צורך להסיר, הקש shift ולחץ על הנקודה. על ידי בחירת "לנווט" ולאחר הזזת העכבר, ניתן לסובב את המבנה על מנת להבטיח כי כל הנקודות הנכונות שלו נשמרו ולאחר מכן לחץ על הבא.
  6. לבחור את הסף הגבוה ביותר עבור הניגוד מקומי, לחץ על הבא. לא בחר "לזהות קוצים" ולהמשיך לסיים את השחזור של הגליל כלי דם. ניתן לערוך את הצבע על ידי לחיצה על הכרטיסיה "צבע". הנתונים הסטטיסטיים ניתן לחלץ שבחלונית "סטטיסטיקת" של חוט הלהט המשוחזרת. ניתן להסיר חלקים עודף שבלוח "עריכה".
    הערה: אלגוריתמים אחרים יכול לשמש למדידת הנפח של זקיקי הכולל או קירות הזקיקים. עבודה המוצגת כאן, oocytes סומנו על ידי autofluorescence של שני נוגדנים משניים. בגלל כמות גדולה של נתונים, שרת העבודה שימשה ניתוח הנתונים.

5. ניתוח סטטיסטי

הערה: נתוני ניתוח התמונה מוצגים כפי שאומר ± תקן שגיאות.

  1. לבצע השוואות בין הזקיקים באמצעות דגימת עצמאית-t-test, והשתמש מבחן המתאם של פירסון להשוות מקדמי המתאם של קיר הזקיקים ואורך נימי. להגדיר ערך של P < 0.05 כמגבלת מובהקות סטטיסטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנחנו ששולבו שיטת בהירות פסיבי שיטה מהירה ופשוטה השחלה פסיבי ניקוי תוך שמירה על האדריכלות הזקיקים ואת כלי הדם וקבלת ניאון האות הגבוה ביותר של סמנים שכותרתו של כלי זקיקים. הארכיטקטורה תלת-ממד של הזקיקים להערכת נקבע על-ידי immunostaining עבור CD31, סמן תאי אנדותל6. CD31 מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר הנוכחי, אנו מציגים 3D הדמיה כדי להעריך את קשרי הגומלין בין נימים זקיקים גידול בודדים. בעבודה הקודמת שלנו באמצעות פרוטוקול זהה 9, למדנו את התפקידים של להערכת גדולים, האינטראקציות בין זקיקים, ואת המיקום של זקיקים של השחלות העכבר ללא פגע. הגישה בהירות פסיבי אפשר לנו ללמוד מיק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן מיוחד סינית עבור והפוסט-דוקטורנטים (2014T70392 מס כדי YF), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81673766 מס כדי YF), הקרן החדשה הטרמה המורה, היסוד Zuoxue של אוניברסיטת פודאן (fudan), לבין ההתפתחות פרויקט לרפואה אינטגרטיבית-דיסציפלינות שיא שנגחאי (20150407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrylamideAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acidSinopharm Chemical Reagent10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Chemical Reagent10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azideSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O)Sinopharm Chemical Reagent20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfateSinopharm Chemical Reagent30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

References

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673(2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013(2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628(2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895(2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved