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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Anpassung der passiven Klarheit und 3D-Rekonstruktion Methode zur Visualisierung der Eierstöcke Gefäßsystem und follikulären Kapillaren in intakten Maus Eierstöcke.

Zusammenfassung

Der Fruchtknoten ist das wichtigste Organ des weiblichen Fortpflanzungssystems und ist unerlässlich für die Produktion von weiblichen Gameten und für die Steuerung des endokrinen Systems, aber die strukturellen Zusammenhänge und dreidimensionale (3D) Gefäßsystem Architekturen von der Eierstöcke sind nicht gut beschrieben. Um die 3D Verbindungen und Architektur der Blutgefäße im Eierstock intakt zu visualisieren, ist der erste wichtige Schritt, den Eierstock optisch klar zu machen. Um Gewebe Schrumpfung zu vermeiden, wir nutzten das Hydrogel Fixierung-basierte passive Klarheit (klar Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert Rigid Imaging / Immunostaining/In Situ-Hybridisierung-kompatible Gewebe Hydrogel) Protokoll Methode um ein intaktes Eierstock zu löschen . Immunostaining, erweiterte multiphoton confocal Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionen Bild wurden dann für die Visualisierung der ovariellen Gefäße und follikulären Kapillaren verwendet. Mit diesem Ansatz, wir zeigten eine signifikante positive Korrelation (P < 0,01) zwischen der Länge des follikulären Kapillaren und Volumen der follikulären Wand.

Einleitung

Die Follikel ist die strukturelle und funktionelle Grundeinheit des Eierstocks, und seine Entwicklung bezieht sich stark auf das Gefäßsystem innerhalb des Eierstocks. Blutgefäße versorgen, Ernährung und Hormone zu den Follikeln und somit eine wichtige Rolle für das Wachstum und die Reifung der Follikel1.

Eine Kombination von Technologien, einschließlich selektive Blutgefäß Marker, transgenen Mausmodellen und pharmazeutische Entwicklung, haben unser Wissen über Eierstockkrebs vaskulären Netzwerken, Angiogenese und die Funktion der Blutgefäße im erhöht Folliculogenesis. Der Fruchtknoten ist als aktives Organ bekannt, weil es verschiedenen Geweben und vaskulären Netzwerken während Folliculogenesis und Ovulation umbaut. Solche aktiven Umbau in der Größe und Struktur der Schiffe ist erforderlich für die biologische Funktion der Entwicklung und der Rekrutierung Follikel.

Traditionelle histologische und Histomorphometric Methoden mit Eierstockkrebs Abschnitte und Immunolabeling der Blutgefäße beschränken sich auf zweidimensionale (2D) Bilder2. Mit der Entwicklung von dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion Technologien, 2D-Bilder Gewebe Scheiben können überlappt werden, um eine 3D-Struktur zu machen, aber diese Methode hat noch einige Einschränkungen – Schneiden des Gewebes zerstören die Mikrostrukturen, einige Teile der Gewebe sind oft fehlen, und bedeutende Arbeit engagiert sich bei der Herstellung von 3D Rekonstruktionen aus Bilder von Scheiben. Gesamte Gewebe 3D-Bildgebung mit konfokalen Mikroskopie kann viele dieser Beschränkungen überwinden, aber diese Methoden beschränken sich auf die Bewertung der Angiogenese in der embryonalen Eierstock-3. Mit ganzen Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit4 können Sie die Lautstärke visualisierte um diese Probleme postnatale und Erwachsenen Eierstöcke und solche Methoden bieten optische Freiraum des Eierstocks ohne strukturelle Verformungen. Bildgebung der 3D Architektur der intakten Eierstöcke bietet eine genaue Bilddatenbank für Bildanalyse-Software, wie z. B. die Imaris-Software-Paket in dieser Arbeit verwendet.

Umbau des Eierstocks im gesamten Erwachsenenalter ist Teil eines dynamischen physiologischen Systems, und dadurch dem Eierstock ein hervorragendes Modell für Untersuchungen über die Regulierung der Angiogenese. Darüber hinaus kann die Bewertung der Rolle der Eierstöcke Blutgefäße unter pathologischen Bedingungen des weiblichen Fortpflanzungssystems wie PCO-Syndrom oder Eierstockkrebs durch ganze Eierstockgewebe Bildgebung untersucht werden. Die Entwicklung der passiven Klarheit-Methode und die Verwendung von modernen Bildanalyse-Software haben detaillierte Rauminformationen über die Beziehungen zwischen Blutgefäßen und ovarielle Strukturen wie Follikel zur Verfügung gestellt.

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Protokoll

Alle Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen folgen die Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission am Shanghai Medical College, Fudan-Universität (Zulassungsnummer 20160225-013).

1. Vorbereitung des Eierstocks Transparent Maus

  1. Vorbereitung der Lösungen
    1. Bereiten Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung (1 M, pH 7.6) mit 0,1 % Triton x-100 (PBST). Um 1 L 10 X PBS-Stammlösung zu machen, mischen Sie 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O, 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L und Rühren ~ 2 h. anpassen auf pH 7.4 mit 1 N NaOH und bei Raumtemperatur lagern. Diese Stammlösung 10 X 1/10 verdünnen mit dH2O und dann 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer.
    2. Hydrogel-Lösung (pH 7,5) durch Vermischungen 4 % (wt/Vol) Paraformaldehyd (PFA) Lösung, 4 % (wt/Vol) Acrylamid, 0,05 % (wt/Vol) Bisacrylamide und 0,25 % (wt/Vol) VA-044-Initiator in bidestilliertem Wasser auf Eis zubereiten.
    3. Bereiten Sie die Clearing-Lösung (pH 8,5) durch das Mischen von 200 mM Natrium Borat Puffer, 4 % (wt/Vol) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) in bidestilliertem Wasser enthält.
  2. Transcardial Perfusion und Eierstock Vorbereitung
    1. Halten Sie alle Lösungen auf Eis, während alle Verfahren.
    2. Erwachsene weibliche Wildtyp C57BL/6 Maus mit eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (0,35 mg/kg) Lösung zu betäuben. Sobald es keine Zehe-Prise Reaktion zeigt, ist die Maus richtig betäubt.
    3. Verwendung Klebeband, die Maus mit Gliedmaßen zu beheben ausgestreckt auf einem flachen Hartschaumplatten.
    4. Setzen Sie das Herz durch einen Schnitt auf dem Xiphoid-Prozess durch die Brust, Haut und Knochen, mit einer Schere.
    5. Einen Einschnitt in das Tier rechten Vorhof, und dann Durchspülen des linken Ventrikels mit 20 mL eiskaltes 1 X PBS mit 10 mL/min.
    6. Durchspülen Sie das Tier mit mindestens 20 mL Hydrogel-Lösung mit 10 mL/min.
    7. Einschneiden der Haut über den Bauch entlang der Medioventral Linie mit einer Schere, die die ganze Enterocoelia macht, und den Darm entfernen. Sammeln Sie die Eierstöcke sowie der Gebärmutter, die Integrität der Eierstöcke Morphologie.
    8. Entfernen Sie das Fettgewebe um den Eierstock unter dem Mikroskop.
  3. Entgasung
    1. Legen Sie die Eierstöcke in 10 mL Hydrogel Lösung bei 4 ° C zur Fixierung für 3 Tage.
    2. Übertragen Sie des Eierstocks in einer 5-mL-Tube und füllen Sie das Rohr mit Hydrogel-Lösung. Dehnen Sie Parafilm über der Oberseite des Rohres zu und dann wickeln Sie Parafilm um den Hals des Rohres.
      Achtung: Sicherstellen Sie, dass keine Luftblasen zwischen den Parafilm und der Hydrogel-Lösung gibt.
    3. Legen Sie das Rohr auf einen Shaker im Inkubator bei 37 ° C für maximal 3 h erlauben das Hydrogel zu polymerisieren.
    4. Entfernen Sie der Eierstöcke aus dem Gel mit einem Spatel und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Gel aus um den Eierstock durch Tissue-Papier. Waschen Sie der Fruchtknoten viermal mit 1 X PBS.
  4. Passive clearing
    1. Tauchen Sie den Eierstock in 10 mL der Clearing-Lösung. Schütteln Sie bei 80 u/min bei 37 ° C zu den Clearing-Prozess zu starten.
    2. In der ersten Woche wechseln Sie die Lösung alle 3 Tage. Aktualisieren Sie nach einer Woche die Clearing-Lösung einmal wöchentlich bis zu den Eierstöcken deutlich wird. Dieser Prozess dauert in der Regel ca. 2-3 Wochen.
      Hinweis: Der Eierstock kann direkt Immunostained oder in verstaubar Natriumazid (0,02 %) mit PBS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen vor Immunostaining.

(2) Immunostaining

  1. Waschen Sie den Eierstock zweimal in PBST am 1. Tag bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker.
  2. Inkubieren Sie der Fruchtknoten auf einem Shaker in primären Antikörper/PBST Lösung (Tabelle 1) am Tag 2-3 bei 37 ° c In der Arbeit präsentierten hier die primäre Antikörper Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül 1 (CD31) und Tyrosin-Hydroxylase 01:10 und 01:50 in PBST, bzw. verdünnt.
    Achtung: Wenn zwei oder mehr Arten von primären Antikörper verwendet werden, stellen Sie sicher gibt es verschiedene tierische Quellen.
  3. Die primären Antikörper mit PBST Puffer bei 37 ° C am Tag 4 auf einem Boston-Shaker abwaschen.
  4. Inkubieren Sie den Eierstock mit der gewünschten Sekundärantikörper in PBST am Tag 5-6 bei 37 ° C in einen Shaker geben. In der hier vorgestellten Arbeit wurden der Sekundärantikörper Alexa Mehl 488 für Tyrosin-Hydroxylase und Alexa Mehl 594 für CD31 01:50 in PBST verdünnt.
  5. Abwaschen der Sekundärantikörper mit PBST Puffer bei 37 ° C am Tag 7 in einen Shaker geben.
  6. Übertragen Sie das Gewebe in Brechungsindex für Brechungsindex Homogenisierung am 8. Tag passende Lösung. Legen Sie das Gewebe auf einem Papier mit Gitternetzlinien seine visuelle Klarheit zu überprüfen, indem Sie überprüfen, ob die Gitternetzlinien gesehen werden können. Sobald das Gewebe vollständig geklärt ist, kann es abgebildet werden.
  7. Machen Sie einem Kitt Zylinder, der nur Umgebung könnte das Gewebe in einer Hufeisenform Formen Sie und drücken Sie die äußeren Grat fest auf einen Glasobjektträger um einen versiegelten Raum zu bilden. Die Höhe der Kitt sollte ein wenig größer als der Fruchtknoten.
  8. Legen Sie die geklärten Eierstock vorsichtig in die Mitte der Kitt und fügen Sie Brechungsindex, die passende Lösung. Eine Glasboden Gericht über den Kitt fest und verwenden Sie Kitt, um die Schale zu fixieren.

(3) konfokalen Mikroskopie

  1. Für die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop, im Bereich "Ni-E" wählen Sie das Objektiv (in diesem Fall Wasser eintauchen 25 X Objektiv, 1.1-NA, 2 mm-WD) mit der richtigen Arbeitsabstand (in diesem Fall 2,0 mm).
  2. Wählen Sie im Bereich "Acquisition" die Anzahl der Kanäle. Hier die verwenden Sie drei Kanäle.
    1. Verwenden Sie zuerst die Registerkarte "Auge Port" "und die XY-Controller Joystick das Gewebe in die Mitte des Feldes verschieben, indem die Überprüfung durch das Mikroskop Okulare.
    2. Nach dem Ausschalten der Auslöser Licht, klicken Sie auf "live"-Fenster anpassen "Laser-Energie", "HV (Gain)" und "Offset" für jeden Kanal separat. Höhere Laserleistung und HV führen zu höheren Signale und höhere Versatz kann die Hintergrundgeräusche reduzieren.
    3. Wählen Sie die richtige "Scan-Größe" und "Count". Verwenden Sie eine Scangröße von 1024 x 1024 µm2 und eine Anzahl von 4 bis 8.
  3. Klicken Sie nach der Einstellung der Bildqualität für die Definition der Tiefe des Gewebes im Bereich "Z-Intensität-Korrektur", und nach Auffinden der Linse auf die oberste Schicht des Eierstocks (in der Mitte des Gewebes) und die Übernahme für die oberste Schicht anpassen auf das "Plus" Taste, um die oberste Schicht zu definieren.
    1. Unten Sie das Objektiv nach und legen Sie die entsprechenden HV und Laserleistung für die Unterseite des Gewebes und fügen Sie die niedrigste Schicht Informationen in die Z-Intensität-Korrektur-Tabelle hinzu. Klicken Sie auf ", ND", die Einstellung mit dem "ND Erwerb" Panel zu synchronisieren.
  4. In die "ND-Übernahme" panel, erste Reihe, die die Anzahl der Scan-Schritte. Dann kreuzen Sie die Registerkarten "Z" und "Großbild".
    1. Gehen Sie zum Fenster "Große Bild", die Größe des Feldes nach der Grenze des Gewebes mit Hilfe von Gewebe Visualisierung durch die Okulare zu definieren. Gehen Sie zurück zum Fenster "ND Erwerb" geben Sie die Größe des Scanbereichs ("Felder") und wählen die Überlappung zwischen 10 % und 15 %.
    2. Klicken Sie auf "Run Z Korrektur", nicht "Run jetzt", um automatisch die richtige HV, Laserleistung und Offset für jede Schicht gesetzt, und warten auf das Bild, um zu verarbeiten.

(4) 3D-Rekonstruktion der einzelnen Follikel und ihre Vasculatures

  1. Erstens verwenden Sie ImageJ5 , um die ursprünglichen NIS-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bild" und wählen Sie "Farbe" und die "Split-Kanäle". Dann klicken Sie auf "Datei" und speichern Sie die Kanäle separat als TIFF-Datei Reihe mithilfe der "Bild-Sequenzen" Option in "Save as".
  2. Verwenden Sie Imaris, um eines der Baureihe TIFF-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bearbeiten" und wählen Sie "Add Channels", den Rest der Kanäle hinzuzufügen. Den Namen und die Farbe des Kanals können auf den Registerkarten "Display-Einstellung" geändert werden. Die Dicke des Gewebes kann im Bereich "Bildeigenschaften" in der Dropdown-Liste unter "Bearbeiten" korrigiert werden müssen.
  3. Klicken Sie für die 3D Zuschneiden der fertigen Bilder und Entfernung der überschüssigen Teile auf die Schaltfläche "Bearbeiten" und wählen Sie "Ernte 3D". Die Größe des Feldes kann durch die Grenze zu ziehen.
  4. Um die Schiff-Signale mit der Filamente Algorithmus im Bedienfeld "Surpass" zu rekonstruieren, klicken Sie auf "Filamente" zum Erstellen einer neuen Filament und klicken Sie auf weiter.
    1. Um die größte und die dünnste Durchmesser zu definieren, gehen Sie zum Fenster "Scheibe" und finden Sie die Ablaufverfolgung Schiff zu. Der Abstand wird automatisch im Feld "Maß" indem Sie zwei Punkte auf die maximale Breite des Schiffes auswählen angezeigt.
    2. Gehen Sie zurück zum Fenster "Surpass" und geben Sie die gemessenen Breite und klicken Sie auf weiter.
  5. Passen Sie die Anfangs- und Saatgut Punkt-Schwelle. Wählen Sie im Bereich "Kamera" "Select". Wenn einige der automatisch erzeugten Kugeln entfernt werden müssen, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf den Punkt. Durch die Auswahl "Navigate" und bewegen Sie die Maus, kann die Struktur gedreht werden, um sicherzustellen, dass die richtigen Punkte wurden beibehalten, und klicken Sie dann auf weiter.
  6. Wählen Sie den höchsten Schwellenwert für den lokalen Kontrast und klicken Sie auf weiter. Nicht wählen Sie "Erkennen Dornen", und weiterhin die Rekonstruktion des Zylinders Blutgefäß abzuschließen. Die Farbe kann bearbeitet werden, indem Sie auf die Registerkarte "Farbe". Die statistischen Daten können im Bereich "Statistik" des rekonstruierten Filaments extrahiert werden. Im Bereich "Bearbeiten" können überflüssige Teile entfernt werden.
    Hinweis: Andere Algorithmen können für die Messung des Volumens des gesamten Follikel oder follikulären Wände verwendet werden. In der hier vorgestellten Arbeit wurden die Eizellen der Autofluoreszenz der beiden Sekundärantikörper geprägt. Wegen der großen Menge von Daten war ein Workstation-Server für die Datenanalyse verwendet.

5. statistische Analyse

Hinweis: Analyse der Bilddaten werden vorgestellt, wie ± Standardfehler bedeutet.

  1. Führen Sie Vergleiche zwischen den Follikeln mit unabhängigen Stichproben t-Test aus und verwenden Sie Pearson Korrelation Test Korrelationskoeffizienten von follikulären Wand- und Kapillarlänge zu vergleichen. Legen Sie einen Wert von P < 0,05 als Grenze für statistische Signifikanz.

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Ergebnisse

Wir haben die passive Klarheit-Methode in eine schnelle und einfache Methode für passive Eierstock clearing-unter Wahrung der follikulären und vaskulären Architektur und Erlangung der höchsten Fluoreszenzsignal von beschrifteten Marker von Schiffen und Follikel angepasst. Die 3D Architektur des follikulären Gefäßsystems wurde durch Immunostaining für CD31, ein Marker für die Endothelzellen6bestimmt. CD31 Färbung in den Eierstöcken erwachsener Mäuse wurd...

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Diskussion

In der aktuellen Studie präsentieren wir 3D imaging um die Beziehungen zwischen den Kapillaren und einzelnen wachsenden Follikel zu bewerten. In unserer bisherigen Arbeit mit dem gleichen Protokoll 9haben wir die Rollen von großen Gefäßsystem, Wechselwirkungen zwischen Follikel und der Position der Follikel in den Eierstöcken intakt Maus untersucht. Die passive Klarheit Ansatz erlaubt uns, Mikro und Makro-Vasculatures, Folliculogenesis und die Zusammenhänge zwischen der Corpora Lutea und Fol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem chinesischen Sonderfonds für Postdocs (Nr. 2014T70392, YF), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81673766, YF), der neue Lehrer Grundieren Fonds, das Zuoxue Fundament der Fudan-Universität und die Entwicklung Projekt der Shanghai Peak Disziplinen-Integrative Medizin (20150407).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrylamideAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acidSinopharm Chemical Reagent10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Chemical Reagent10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azideSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O)Sinopharm Chemical Reagent20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfateSinopharm Chemical Reagent30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

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