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要約

ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.

要約

卵巣は、女性の生殖器系の主要な器官と雌性の配偶子の生産構造の複雑な関係との三次元 (3 D) 血管アーキテクチャが、内分泌系を制御するために不可欠です、卵巣は記述されていません。3 D の接続とそのまま卵巣の血管の構造を視覚化するために最初の重要なステップは、光学的に透明の卵巣をすることです。ヒドロゲルを用いて組織の収縮を避けるためには、受動的な明快さの固定ベース (アクリルアミド ハイブリダイズ リジッドのオフ脂質交換イメージング/染色/の場-交配-互換性のある組織ハイドロゲル) プロトコルをそのまま卵巣をクリアする方法.染色、高度な多光子の共焦点顕微鏡と 3 D 画像再構成それから卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化のために使用されました。このアプローチを使用すると、有意な正の相関を示した (P < 0.01) 卵胞の毛細血管と卵胞壁量の長さの間。

概要

卵胞が卵巣の構造と機能の基本単位とその開発は、卵巣内にある血管に関連性の高い。血管は栄養と卵胞ホルモンと成長と1卵胞の成熟に重要な役割を担っています。

選択的血管マーカー、トランスジェニック マウス モデル、医薬品開発などの技術の組み合わせは、卵巣の血管網、血管新生、血管の機能に関する知識を増加しています。卵胞形成。卵巣は、卵胞発育と排卵の間に様々 な組織や血管のネットワークを改造するためにアクティブな器官と呼ばれます。サイズと血管の構造のようなアクティブな改造開発、採用に卵胞の生物学的機能に必要です。

卵巣のセクションおよび血管の反応を使用して従来の組織学的および組織計量方法は二次元 (2 D) 画像2に限定されます。三次元 (3 D) 再構成技術の発展に伴い、組織スライスの 2 D 画像を 3 D 構造に重ねることができますが、この方法はまだいくつかの制限を持って-微細構造の一部を破壊することが組織の区分、組織は、不足していると多くの労働力がスライスから得られた画像からの 3次元再構成の製作にかかわっています。全体組織 3 D 共焦点顕微鏡イメージングは、これらの制限の多数を克服できるがこれらのメソッドは萌芽期卵巣3における血管新生の評価に限定。生後および成体卵巣におけるこれらの問題を解決するために可視化されたボリュームを増やして全体ティッシュ クリア透明度4などのメソッドを使用して、このようなメソッドは任意の構造変形せず卵巣の光のクリアランスを提供します。そのまま卵巣の 3 D 構造のイメージングは、本作で使用されている Imaris ソフトウェア パッケージなどの画像解析ソフトウェアの正確な画像データベースを提供します。

動的な生理学的システムの一部である成人期にわたって卵巣の改造、これ卵巣血管新生の調節に調査のための優秀なモデル。さらに、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣癌などの女性生殖器系の病的な状態で卵巣血管の役割の評価は全卵巣組織イメージングを通じて学ぶことができます。パッシブのクラリティ法の開発と高度な画像解析ソフトウェアの使用は、血管や毛包などの卵巣構造の関係に関する詳細な空間情報を提供しました。

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プロトコル

動物を対象とするすべてのプロシージャ上海医科大学、復旦大学 (承認番号 20160225-013) の動物倫理委員会のガイドラインに従った。

1. 透明なマウス卵巣の準備

  1. 溶液の調製
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション (1 M、pH 7.6) 0.1% 準備トリトン X-100 (pbst;)。10 x PBS 原液 1 リットルを作るためには、87 g の塩化ナトリウム、NaH2PO4 · 3.1 g を混ぜる2 H2O、および Na2HPO4 ·12H2O. 28.7 g dH2O に 1 L 攪拌 ~ 2 h. 調整 pH 7.4 に 1 N naoh を追加し、常温で保存します。1/10 この 10 倍原液を希釈 dH2O を使用し、0.1% トリトン X-100 PBS で。
    2. 混合 (wt/巻) 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、4% (重量/巻) アクリルアミド、0.05% (重量/巻) bisacrylamide、ダブル蒸留水氷の上の 0.25% (重量/巻) VA 044 イニシエーターによるゲル溶液 (pH 7.5) を準備します。
    3. 4% (重量/巻) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 二重蒸留水に 200 mM ホウ酸ナトリウム緩衝を混ぜてクリア ソリューション (Ph8.5) を準備します。
  2. Transcardial 血流と卵巣の準備
    1. すべてのプロシージャの間に氷の上のすべてのソリューションをしてください。
    2. ペントバルビ タール (0.35 mg/kg) ソリューションの腹腔内注入成人女性野生型 c57bl/6 マウスを麻酔します。それはつま先ピンチの応答を示しています、一度マウスに麻酔がかかる適切。
    3. フラットの発泡ボードを伸ばして手足でマウスを固定する粘着テープを使用。
    4. ハサミで胸、肌や骨を剣状突起上を切開すること、心臓を公開します。
    5. 動物の右房切開を行い、20 ml 10ml/分で冷たい 1 × PBS の左心室を灌流します。
    6. 少なくとも 20 ml ゲル液 10 mL/分での動物を灌流します。
    7. ハサミには、全体の enterocoelia を公開している medioventral ラインに沿って腹部の皮膚を切開し、腸を削除します。卵巣の形態の整合性を維持するために子宮と卵巣を収集します。
    8. 顕微鏡下で卵巣の周りの脂肪組織を削除します。
  3. 脱ガス
    1. 3 日間の固定のための 4 ° C で 10 mL ゲル ソリューションに卵巣を配置します。
    2. 5 mL チューブに卵巣を転送し、ハイドロゲル ソリューションとチューブを入力します。チューブの上にパラフィルムをストレッチし、管の首にパラフィルムをラップします。
      注意: は、パラフィルムとハイドロゲル ソリューションの泡がないことを確認します。
    3. 37 ° C で重合するハイドロゲルを許可する 3 h の最大のためのインキュベーターのシェーカーにチューブを置きます。
    4. ヘラを使用してゲルから卵巣を削除、ティッシュ ペーパーで卵巣の周りから余分なゲルを注意深く取り外します。1x PBS で 4 回卵巣を洗います。
  4. パッシブ クリア
    1. クリア溶液 10 mL で卵巣が水没します。消去プロセスを開始する 37 ° C で 80 rpm で軽く振る。
    2. 最初の週に 3 日おきにソリューションを変更します。卵巣まで週が明確になったら、一週間後クリア ソリューションを更新します。通常このプロセスは、約 2-3 週間かかります。
      注: 卵巣 immunostained を直接することができます。 またはに格納できるアジ化ナトリウム (0.02%) PBS の 4 ° C で免疫染色の前に数週間。

2. 免疫染色

  1. Pbst; で 2 回シェーカーで 37 ° C で 1 日目に卵巣を洗います。
  2. 37 ° C で 2-3 日目の主な抗体/PBST ソリューション (表 1) にシェーカーで卵巣を孵化させなさい血小板内皮細胞接着分子 1 (CD31) をされた一次抗体をここで提示する仕事でチロシン水酸化酵素それぞれ 1:10 と 1:50 PBST で希釈します。
    注意: 一次抗体の 2 つ以上の種類を使用している場合は、別の動物の源があるを確認します。
  3. シェーカーで 4 日目に 37 ° C で PBST バッファーと一次抗体を洗浄します。
  4. シェーカーで 37 ° C で 5 - 6 日目 PBST 目的の二次抗体と卵巣を孵化させなさい。ここで紹介する作業、二次抗体はチロシン水酸化酵素と 1:50 PBST 内で希釈した CD31 の Alexa 小麦粉 594 が Alexa 小麦粉 488 とだった。
  5. シェーカーで 7 日で 37 ° C で PBST バッファーと二次抗体を洗浄します。
  6. 屈折率マッチング ソリューション 8 日目に屈折率の均質化のために組織を転送します。目盛線目盛線を見ることができるかどうかを確認することでその映像の明瞭さをチェックすると紙の上には、組織を置きます。組織が完全に明らかにされて、一度はイメージすることができます。
  7. 作ることをちょうど囲むパテ シリンダー、組織とし馬蹄形に形状、密閉された空間を作るためにスライド ガラスにしっかりと外縁隆起帯を押します。パテの高さは卵巣より少し背が高いはずです。
  8. パテの中心に明らかに卵巣を慎重に配置し、屈折率整合ソリューションを追加します。しっかりとパテの上にガラス底皿を置くし、お皿を修正するためパテを使用します。

3. 共焦点顕微鏡

  1. 共焦点顕微鏡を用いたイメージング、「Ni E」パネルで (この場合 2.0 mm) の適切な作動距離で (この場合は水浸漬 25 X 対物レンズ、1.1 NA、2 mm WD) レンズを選択します。
  2. 「取得」パネルでチャンネル数を選択します。ここでは、3 つのチャンネルを使用します。
    1. まず、顕微鏡接眼レンズを通じてチェックすることによって組織をフィールドの中央に移動するのに「目ポート」タブと XY コント ローラー ジョイスティックを使用します。
    2. シャッター光を切って"HV (利得)"、「レーザー パワー」を調整する「ライブ」のタブをクリックし、"オフセット ' 各チャネル個別に。ハイパワー レーザーおよび HV より高い信号をもたらすし、高いオフセットがバック グラウンド ノイズを減らすことができます。
    3. 適切な「スキャン サイズ」と「数」を選択します。スキャン サイズを 1024 x 1024 μ m2 4 ~ 8 のカウントを使用します。
  3. 「Z 強度補正」パネルで組織の深さを定義する画像品質を設定後、(で、組織の中心) 卵巣の最上位層のレンズを見つけるとトップ層の獲得を調整後、「プラス」をクリックトップにレイヤーを定義します。
    1. レンズを下に移動、適切な HV と組織の下のレーザー パワーを設定し、Z 強度補正テーブルに最低のレイヤー情報を追加します。「ND 取得」パネルで設定を同期するの"に ND"をクリックします。
  4. 「ND 取得」パネル、スキャン数のステップの最初のセット。その後、"Z"と「大きな画像」タブを選択します。
    1. 接眼レンズを通して組織の可視化の助けを借りて、組織の境界線に従ってフィールドのサイズを定義する「大きな画像をスキャン」ウィンドウに移動します。スキャン領域 (「フィールド」) のサイズを入力し、10% と 15% 間の重複を選択して「ND 取得」パネルに戻ります。
    2. 「実行 Z 補正」、ない「今すぐ実行」自動的に各レイヤーに適切な HV、レーザー出力とオフセットを設定し、画像を処理するのを待つをクリックしてします。

4. 個別包とその血管の三次元

  1. まず、ImageJ5を使用して、元の NIS ファイルを開きます。「イメージ」ボタンをクリックしてし、「色」と"分割チャンネル"を選択します。「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」で「イメージ シーケンス」オプションを使用して tiff ファイル シリーズとしてチャンネルを個別に保存します。
  2. Imaris を使用すると、tiff ファイル シリーズのうちの 1 つを開きます。「編集」ボタンをクリックし、「チャンネルの追加」を選択してチャンネル残り部分を追加します。「ディスプレイの調整」タブでは、名前およびチャネルの色を変更できます。 されます組織の厚さは、「編集」下のドロップ ダウン リストで「イメージ プロパティ」パネルで修正される必要があります。
  3. 最終のイメージと余分な部分の除去の 3 D のトリミング、"Edit"ボタンをクリックし、「トリミング 3 D」を選択します。フィールドのサイズは、枠線をドラッグして調整できます。
  4. サーパス パネルにおけるフィラメント アルゴリズムを用いた船舶信号を再構築するには、新しいフィラメントを作成し、次へをクリックする「フィラメント」をクリックします。
    1. 最大かつ最薄の直径を定義するために「スライス」パネルに移動しをトレース船を見つけます。容器の最大幅で 2 つの点を選択することにより、距離が自動的に「測定」パネルに表示されます。
    2. 「サーパス」パネルに戻ると幅の測定値を入力次へをクリックして。
  5. 開始とシード ポイントのしきい値を調整します。「カメラ」パネルで「選択」を選択します。自動的に作り出された球のいくつかが削除する場合は、shift キーを押し、ポイントをクリックします。「移動」を選択して、マウスを動かして、によってすべての正しいポイントが保持されている, し、次へをクリックを確認する構造を回転できます。
  6. 局所的なコントラストの高いしきい値を選択し、[次へ] をクリックします。「検出の棘」を選択しないし、血管柱の再構成を完了する続行。色は、「カラー」タブをクリックしてして編集できます。再建されたフィラメントの「統計」パネルで統計データを抽出できます。[編集] パネルで余分な部分を削除できます。
    注: 合計卵胞または濾胞壁のボリュームを測定するための他のアルゴリズムを使用できます。ここで紹介する作業、卵母細胞は両方の二次抗体の蛍光によって示されました。データ量が大きいためワークステーションのサーバーは、データ分析のため使用されました。

5. 統計解析

注: ± 標準誤差を手段として、画像解析データが掲載されています。

  1. 独立したサンプルの t 検定を使用して卵胞の比較実行し、ピアソンの相関テストを使用して卵胞壁毛細血管の長さの相関係数を比較します。P の値設定 < 統計的有意性の制限と 0.05 です。

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結果

我々 は受動的な卵巣の卵胞期と血管のアーキテクチャを維持すると、容器と包のラベル付きのマーカーからの最高の蛍光信号の取得をオフに迅速かつ簡単な方法にパッシブのクラリティ法を適応しました。卵胞血管の 3 D アーキテクチャは、CD31、内皮細胞6マーカーの免疫染色により決定されました。CD31 染色成体マウスの卵巣では卵胞の毛細血管と...

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ディスカッション

現在の研究では、毛細血管と個々 の発育卵胞の間の関係を評価するイメージング 3 D を提案する.筆者らは同じプロトコル9を使用して、大血管、毛包とそのままマウス卵巣内の卵胞の場所間の相互作用の役割を検討しました。パッシブわかりやすくアプローチでは、マイクロおよびマクロ生、卵胞形成、および黄体と卵胞だけでなくさまざまな発達段階で卵巣の建築を再建?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、ポスドクの中国特別基金からの助成金によって支えられた (YF に号 2014T70392)、中国の国家自然科学基金 (YF に号 81673766)、新しい教師プライミング基金、復旦大学、Zuoxue 財団、開発上海ピーク分野統合医学 (20150407) のプロジェクト。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrylamideAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acidSinopharm Chemical Reagent10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Chemical Reagent10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azideSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O)Sinopharm Chemical Reagent20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfateSinopharm Chemical Reagent30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

参考文献

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673(2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013(2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628(2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895(2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

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