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요약

여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.

초록

난소는 여성의 생식 시스템의 주요 기관 이다 하 고 여성 gametes의 생산에 대 한 복잡 한 구조 관계와 3 차원 (3D) 맥 관 구조 아키텍처의 내 분 비 시스템을 제어 하기 위한 필수적 이다는 난소는 잘 기술 된다. 3D 연결과 그대로 난소에 혈관의 아키텍처를 시각화 하기 위해 첫 번째 중요 한 단계는 광학 투명 난소를 만드는 것입니다. 피하 조직의 수축, 우리가 사용 하는 하이드로 겔 고정 기반 수동 선명도 (아크릴 때 교배 고정 취소 지질 교환 이미징 / Immunostaining/에서 제자리 교 잡-호환 조직 히드로) 메서드는 그대로 난소를 프로토콜 . Immunostaining, 고급 multiphoton confocal 현미경 검사 법, 그리고 3D 이미지 복원 다음 난소 혈관 및 소 낭 모양 모 세관의 시각화를 위해 사용 되었다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 상당한 긍정적인 상관 관계 보였다 (P < 0.01) follicular 벽의 볼륨과 follicular 모 세관의 길이 사이.

서문

여 포는 난소의 기본적인 구조상과 기능 단위 이며 그 개발 높은 난소 내에서 맥 관 구조에 관련 된. 혈관 영양과 모 낭에 호르몬을 공급 하 고 따라서 성장과 낭1의 성숙에 중요 한 역할.

선택적 혈관 마커, 유전자 변형 마우스 모델 및 제약 개발을 포함 하 여 기술의 조합 난소 혈관 네트워크, 신생, 혈관의 기능에 대 한 우리의 지식을 증가합니다 folliculogenesis입니다. 난소는 그것 folliculogenesis와 배 란 기간 동안 다양 한 조직 및 혈관 네트워크를 개장 하기 때문에 활성 장기로 알려져 있다. 혈관의 구조와 크기에 이러한 활성 개장 하는 것은 개발 및 낭의 생물 학적 기능을 위한 필요 이다.

난소 및 혈관의 immunolabeling를 사용 하 여 전통적인 조직학 및 histomorphometric 메서드는 2 차원 (2D) 이미지2. 3 차원 (3D) 재구성 기술 개발 조직 조각의 2D 이미지 3 차원 구조를 만들기 위해 중첩 수 있습니다 하지만이 방법은 여전히 몇 가지 한계가-조직의 단면 마이크로 구조의 일부를 파괴할 수는 조직, 자주 그리고 상당한 노동은 조각에서 얻은 이미지에서 3 차원 개조를 제작에 관련 된. Confocal 현미경 검사 법으로 전체 조직의 3D 영상 많은, 이러한 한계를 극복할 수 있지만 이러한 방법은 배아 난소3신생의 평가에 제한 됩니다. 전체 조직의 선명도4 같은 방법의 선택을 취소를 사용 하 여 산 후 및 성인 난소에 이러한 문제를 해결할 수 있도록 시각화 된 볼륨을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 이러한 방법을 모든 구조적 변형 없이 난소의 광학 정리 제공. 그대로 난소의 3D 아키텍처의 이미징이이 작품에 사용 된 Imaris 소프트웨어 패키지 같은 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 정확한 이미지 데이터베이스를 제공 합니다.

성인 기에 걸쳐 난소의 개장 동적 생리 체계의 일부 이며 이것은 난소 신생의 규칙에 대 한 조사에 대 한 우수한 모델. 또한, polycystic 난소 증후군이 나 난소 암 등 여성 생식의 pathologic 상태에서 난소 혈관의 역할을 평가 전체 난소 조직 영상 통해 공부 될 수 있다. 수동 선명도 방법의 개발 및 고급 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 혈관과 모 낭 등 난소의 구조 간의 관계에 자세한 공간 정보 제공.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 절차에서 상해 의학 대학, 복 단 대학 (승인 번호 20160225-013) 동물 윤리 위원회의 지침에 따 랐 다.

1입니다. 투명 마우스 난소의 준비

  1. 솔루션의 준비
    1. 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 (1 M, pH 7.6) 0.1% 트라이 톤 X-100 (PBST). 10 x PBS 재고 솔루션 1 L을 혼합 87 g의 NaCl, NaH2포4 · 3.1 g 2 H2O, 그리고 나2HPO4 ·12H2오의 28.7 g dH2O L 1과 볶음 ~ 2 h. pH 7.4에 조정 1 N NaOH를 추가 하 고 상 온에서 저장. 1/10이 10 배 재고 솔루션을 희석 0.1% 이며 dH2O를 사용 하 여 PBS에 트라이 톤 X-100.
    2. Mixings 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) 솔루션, 4% (wt/vol) 아크릴, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide, 및 0.25% (wt/vol) VA-044 초기자 두 번 증 류 물 얼음에 의해 히드로 솔루션 (pH 7.5)를 준비 합니다.
    3. 4% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이중 증 류 물에서 포함 된 200 m m 나트륨 붕 산 염 버퍼를 혼합 하 여 개간 솔루션 (pH 8.5)를 준비 합니다.
  2. Transcardial 관류와 난소 준비
    1. 모든 절차 동안 얼음에 모든 솔루션을 유지.
    2. 성인 여성 와일드 타입 C57BL/6 마우스 pentobarbital (0.35 mg/kg) 솔루션의 복 주사와 anesthetize 발가락-핀치 응답 보여줍니다, 일단 마우스 제대로 마 취.
    3. 사지와 마우스를 해결 하기 위해 사용 스티커 테이프 플랫 폼 보드에 밖으로 뻗어.
    4. 가 위로 가슴, 피부, 뼈를 통해 칼 프로세스에 절 개를 마음에 노출.
    5. 동물의 오른쪽 아 트리 움로 절 개 하 고 perfuse 10 mL/min에서 얼음 1 x PBS의 20 mL와 좌 심 실.
    6. 20 mL 이상 10 mL/min에서 히드로 솔루션으로 동물 perfuse
    7. 가 위, 전체 enterocoelia를 노출, medioventral 라인을 따라 복 부에 피부 incise 고 내장을 제거 합니다. 난소 뿐만 아니라 자 궁 난소 형태학의 무결성을 유지 하기 위해 수집 합니다.
    8. 현미경으로 난소 주위 지방 조직을 제거 합니다.
  3. 기체 제거
    1. 3 일 동안 고정을 위한 4 ° C에서 10 mL 히드로 솔루션에 난소를 놓습니다.
    2. 5 mL 관으로 난소를 전송 하 고 히드로 솔루션 튜브를 입력 합니다. 튜브 위에 parafilm 스트레칭 하 고 튜브의 목 parafilm 포장.
      주의:는 parafilm와 히드로 솔루션 사이 아무 거품 인지 확인 합니다.
    3. 유해를 하이드로 겔 수 있도록 3 h의 최대 37 ° C에서 인큐베이터에서 통에 튜브를 놓습니다.
    4. 주걱을 사용 하 여 젤에서 난소를 제거 하 고 조심 스럽게 티슈 페이퍼에 의해 난소 주위에서 초과 젤을 제거. 4 번 1 x PBS 가진 난소를 씻어.
  4. 수동 청소
    1. 청소 솔루션의 10 mL에 난소 잠수함 개간 과정을 시작 하는 37 ° C에서 80 rpm에서 부드럽게 흔들어.
    2. 첫 주에 3 일 마다 솔루션을 변경 합니다. 일단 난소까지 주 분명해 1 주일 후 청소 솔루션을 새로 고칩니다. 일반적으로이 프로세스는 약 2-3 주 걸립니다.
      참고: 난소 또는 immunostained를 직접 수 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.02%)에 PBS에 4 ° C에서 immunostaining 전에 몇 주 동안.

2입니다. Immunostaining

  1. 통에 37 ° C에서 1 일에 PBST에 두 번 난소를 씻어.
  2. 37 ° c.에 2-3 일에 1 차 항 체/PBST 솔루션 (표 1)에 통에 난소를 품 어 에 여기에 제시, 기본 항 체 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 1 (CD31) 했다 일과 티로신 hydroxylase 각각 1시 10분, PBST에 1시 50분에 희석.
    주의: 두 개 이상의 종류 1 차적인 항 체의 사용 하는 경우 다른 동물 소스 있는지 확인 합니다.
  3. 하루에 4 통에 37 ° C에서 PBST 버퍼 기본 항 체를 씻어.
  4. 하루 5-6 통에 37 ° C에 PBST에서 원하는 보조 항 체와 난소를 품 어. 여기에 제시 된 작품에 2 차 항 체 티로신 hydroxylase와 알 렉 사 가루 594 CD31 PBST에 1시 50분에 희석에 대 한 알 렉 사 가루 488을 했다.
  5. 통에 7 일에 37 ° C에서 PBST 버퍼와 2 차 항 체를 씻어.
  6. 주 8에 굴절률 균질에 대 한 굴절률 매칭 솔루션으로 조직의 전송. 눈금선의 시각적 선명도 눈금선을 볼 수 있는지 여부를 확인 하 여 확인 하는 종이에 조직을 넣어. 일단 조직을 완전히 명확히 있다, 몇 군데 될 수 있습니다.
  7. 단지 주변을 수 퍼 실린더 조직, 그리고 말굽 모양으로 모양을 만들고 밀폐 공간을 만들기 위하여 유리 슬라이드에 밀접 하 게 외부 릿지를 누릅니다. 퍼 티의 높이 난소 보다 조금 키가 있어야 합니다.
  8. 명확히 난소 신중 하 게 퍼 티의 중심에 놓고 굴절률 일치 하는 솔루션을 추가 합니다. 유리 하단 접시 퍼 티에 단단히 넣고 퍼 티를 사용 하 여 요리를 해결.

3. confocal 현미경 검사 법

  1. Confocal 현미경 이미징, "Ni-E" 패널에서 선택 (이 경우 물 침수 25 X 렌즈, 1.1-나, 2 mm-WD)에 렌즈 (이 경우 2.0 m m)에 적절 한 작업 거리.
  2. "수집" 패널에서 채널 수를 선택 합니다. 여기에, 3 개의 채널을 사용 합니다.
    1. 첫째, 사용 하 여 "눈 포트" 탭 및 XY 컨트롤러 조이스틱 현미경 접 안 렌즈를 통해 확인 하 여 조직 필드의 중심을 이동.
    2. 셔터 라이트를 끈 후 조정 "레이저 파워", "HV (이득)", "라이브" 탭을 클릭 하 고 "오프셋 ' 각 별도로 채널. 높은 레이저 전원 및 HV 높은 신호를 발생할 수 있습니다 그리고 더 높은 오프셋 배경 잡음을 줄일 수 있습니다.
    3. 적절 한 "스캔 크기"와 "수"를 선택 합니다. 사용 하 여 1024 x 1024 µ m2 의 스캔 크기와 4 ~ 8의 수 있습니다.
  3. 설정 패널에서 조직의 깊이 정의 하기 위한 이미지 품질 "Z 강도 보정", 후 (조직 중심)에서 난소의 최상위 계층에 렌즈를 찾아서 최상위 계층에 대 한 인수를 조정 후, 클릭 "더하기" 버튼을 상위 계층을 정의 합니다.
    1. 렌즈를 이동 하 고 적절 한 HV 및 조직의 하단에 대 한 레이저 전원 설정 Z 강도 보정 테이블에 낮은 레이어 정보 추가. "하 차" "ND 수집" 패널 설정을 동기화 하려면 클릭 합니다.
  4. "ND 수집" 패널, 스캔 수 단계 첫 번째 집합. 그런 다음, "Z"와 "큰 이미지" 탭 체크.
    1. 접 안경 통해 조직 시각화의 도움으로 조직의 경계에 따라 필드의 크기를 정의 하려면 "스캔 큰 이미지" 창으로 이동 합니다. 다시 검색 영역 ("필드")의 크기를 입력 하 고 10%와 15% 사이 오버랩 선택 "ND 수집" 패널으로 이동.
    2. "실행 Z 수정" 하지 "실행" 지금", 자동으로 각 계층에 대 한 적절 한 HV, 레이저 파워와 오프셋을 설정 하 고 이미지 처리를 위해 대기를 클릭 합니다.

4. 개별 낭과 그들의 Vasculatures의 3D 재구성

  1. 첫째, ImageJ5 를 사용 하 여 원래 NIS 파일을 엽니다. "이미지" 버튼을 클릭 하 고 "색상" 및 "분할 채널"을 선택 합니다. 다음, "파일"을 클릭 하 고 별도로 "다른 이름으로 저장"에서 "이미지 시퀀스" 옵션을 사용 하 여 tiff 파일 시리즈로 채널을 저장.
  2. Imaris를 사용 하 여 tiff 파일 시리즈 중 하나를 엽니다. "편집" 버튼을 클릭 하 고 "채널 추가"를 선택 추가 채널의 나머지를. 이름 및 색상 채널의 "디스플레이 조정" 탭에서 변경할 수 있습니다. 직물의 두께 "편집" 드롭 다운 목록에서 "이미지 속성" 패널에서 수정 해야 합니다.
  3. 3D 자르기 최종 이미지의 과잉 부분 제거, 대 한 "편집" 버튼을 클릭 하 고 "3D 자르기"를 선택 합니다. 테두리를 끌어 필드의 크기를 조정할 수 있습니다.
  4. Surpass 패널에 필 라 멘 트 알고리즘으로 선박 신호를 재구성 하 새로운 필 라 멘 트를 생성 하 고 클릭 합니다 "필" 버튼을 클릭 합니다.
    1. 가장 크고 가장 얇은 직경을 정의 하기 위해 "슬라이스" 패널에가 고 추적 선박을 찾을. 거리 선박의 최대 너비에 두 포인트를 선택 하 여 "측정" 패널에 자동으로 표시 됩니다.
    2. "Surpass" 패널에 돌아가 측정된 폭을 입력을 클릭 합니다.
  5. 시작 및 씨앗 포인트 임계값을 조정 합니다. "카메라" 패널에서 "선택"을 선택 합니다. 자동으로 생산된 분야의 일부는 제거 될 필요가, shift 하 고 지점에 클릭 하십시오. "이동"을 선택 하 고 마우스를 이동, 구조는 모든 올바른 포인트 유지 되 고 다음을 클릭 합니다 회전할 수 있습니다.
  6. 로컬 대비를 위한 높은 임계값을 선택 하 고을 클릭 합니다. "쪽이 검출"를 선택한 혈관 실린더의 재건을 마무리 계속 하지 마십시오. 색상은 "색상" 탭을 클릭 하 여 편집할 수 있습니다. 통계 데이터는 복원 된 필 라 멘 트의 "통계" 패널에서 추출할 수 있습니다. "편집" 패널에서 초과 부분을 제거할 수 있습니다.
    참고: 다른 알고리즘은 총 낭 또는 소 낭 모양 벽의 볼륨을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 작품에는 oocytes 두 이차 항 체의 autofluorescence에 의해 표를 했다. 많은 양의 데이터 때문에 워크스테이션 서버 데이터 분석을 위해 사용 되었다.

5. 통계 분석

참고: 이미지 분석 데이터는 ± 표준 오류를 의미 하는 대로 표시 됩니다.

  1. 독립 표본 t-검정를 사용 하 여 모 공 사이의 비교를 수행 하 고 피어슨의 상관 관계 테스트를 사용 하 여 상관 관계 계수 follicular 벽 및 모 세관 길이 비교. P의 값을 설정 < 0.05 통계적 의미에 대 한 제한.

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결과

우리는 수동 난소 follicular와 혈관 구조를 보존 하 고 혈관과 모 낭의 레이블이 표시에서 높은 형광 신호를 취득 하는 동안 지우기에 대 한 신속 하 고 간단한 방법으로 수동 선명도 메서드를 적응. Follicular 맥 관 구조의 3D 아키텍처 CD31, 내 피 세포6표식에 대 한 immunostaining에 의해 결정 되었다. 필 라 멘 트 알고리즘을 사용 하 여 및 follicular 모 세관 및 기본...

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토론

현재 연구에서 선물이 3D 이미징 모세 혈관과 개별 성장 낭 사이의 관계를 평가 하기 위해. 우리의 이전 작품에서는 동일한 프로토콜 9를 사용 하 여, 우리는 큰 맥 관 구조, 모 공, 그대로 마우스 난소에서 난 포의 위치 사이 상호 작용의 역할을 공부 했습니다. 수동 선명도 접근 수 마이크로 및 매크로 vasculatures, folliculogenesis, corpora lutea의 다른 발달 단계에서 난소 아키텍처를 재구...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구는 초나라에 대 한 중국 특별 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (YF No. 2014T70392), 국립 자연 과학 재단의 중국 YF (No. 81673766), 새로운 교사를 못쓰게 기금, 복 단 대학의 Zuoxue 재단 및 개발 상하이 최대 분야 통합 의학 (20150407)의 프로젝트.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrylamideAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acidSinopharm Chemical Reagent10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Chemical Reagent10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azideSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O)Sinopharm Chemical Reagent20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfateSinopharm Chemical Reagent30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

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