Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

Abstract

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא טכניקה נפוץ עבור מיפוי הלוקליזציה של שינויים היסטוניים post-translationally שונה, גרסאות היסטון, גורמי שעתוק או שינוי כרומטין אנזימים של לוקוס נתון או בקנה מידה הגנום כולו. השילוב של מבחני שבב עם הדור הבא רצפי (קרי, צ'יפ-Seq) היא גישה רב-עוצמה לחשוף באופן גלובלי רשתות בקרה רגולטריות וכדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום, במיוחד של רצפי תקינה ללא קידוד. שבב פרוטוקולים מחייבים בדרך כלל כמויות גדולות של חומר הסלולר, ובכך מסלק את הישימות של שיטה זו לחקירת סוגי תאים נדיר או ביופסיות רקמות קטנה. על מנת להפוך וזמינותו שבב תואם כמות חומר ביולוגי אשר בדרך כלל ניתן להשיג ויוו במהלך המוקדמות מופרה חוליות, נתאר כאן פרוטוקול שבב פשוטה שבה מספר השלבים הדרושים להשלמת assay הצטמצם כדי למזער את אובדן הדגימה. פרוטוקול שבב זה שימש בהצלחה לחקור שינוי היסטון שונים שונים עוף עובריים ורקמות העכבר למבוגרים באמצעות נמוך עד בינוני תא מספרים (5 x 104 - 5 x 105 תאים). חשוב, פרוטוקול זה תואם טכנולוגיית שבב-seq בשיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך לספק epigenomic גלובל מפות ברקמות עובריים מאוד רלוונטי.

Introduction

שינויים post-translational היסטון מעורבים ישירות תהליכים תלויי-כרומטין שונים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2,3. יתר על כן, שינויים שונים היסטון להראות חיובי (למשל, H3K4me3 ו- H3K27ac) או שלילי (למשל, H3K9me3 ו- H3K27me3) מתאמים עם ביטוי גנים, יכול להיות מוגדר באופן רחב כמו הפעלת או מדכאת היסטון מסמן, בהתאמה2,3. כתוצאה מכך, מפות שינוי היסטון גלובלית, המכונה גם epigenomic מפות, הופיעו כלי אוניברסלי ועוצמתי להוסיף ביאור פונקציונלית הגנום חוליות4,5. לדוגמה, דיסטלי רצפים רגולטוריות כגון משפרי ניתן לזהות המבוסס על הנוכחות של חתימות כרומטין ספציפיים (למשל, פעיל משפרי: H3K4me1 ו- H3K27ac), אשר להבדיל ביניהם לבין יזם proximal אזורים (למשל, היזמים פעיל: H3K4me3)6,7,8. מצד שני, גנים עם פונקציות הרגולציה של זהות תא העיקריים נמצאים בדרך כלל עם כרומטין רחבה תחומים מסומנים H3K4me3 או H3K27me3, בהתאם למצב פעיל או לא פעיל transcriptionally של גנים הבסיסית, בהתאמה9 ,10. באופן דומה, הביטוי של גנים זהות תא מרכזי נראה להיות לעתים קרובות תחת פיקוח מרובים והמרגשים מקובצים באשכולות משפרי (קרי, סופר משפרי), אשר יכול להיות מזוהה תחומים רחבה המסומן H3K27ac11.

כיום, מפות שינוי היסטון נוצרות באמצעות טכנולוגיית שבב-seq, אשר לעומת גישות קודמות כגון צ'יפס-שבב (צ'יפ מצמידים מיקרו-מערכים) מספק רזולוציה גבוהה יותר, חפצים פחות, פחות רעש, כיסוי גדול ואת התחתון עולה12. ובכל זאת, הדור של מפות epigenomic באמצעות טכנולוגיית שבב-seq יש מגבלות הטבועות, הקשורים בעיקר היכולת לבצע בהצלחה שבב הדגימות עניין. פרוטוקולים שבב מסורתי נדרש בדרך כלל מיליוני תאים, אשר מגבלת תחולתה של שיטה זו חוץ גופית בתוך תא קווים או תאים אשר ניתן בקלות מבודד ויוו (למשל, תאי דם). השנים האחרונות, מספר פרוטוקולים שבב ששונה תואם עם מספרי הטלפון הנייד נמוך כבר מתואר13,14,15,16. עם זאת, פרוטוקולים אלה נועדו במיוחד כדי להיות יחד עם הדור הבא רצפי (קרי, צ'יפ-seq), הם בדרך כלל להשתמש אד הוק ספריית הכנה שיטות13,14, 15 , 16.

כאן, אנו המתואר פרוטוקול הצ'יפ שיכול לשמש כדי לחקור שינוי היסטון פרופילים באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוכים בינוניים (5 x 104 - 5 x 105 תאים) או לוקוסים שנבחר (קרי, שבב-qPCR) או באופן גלובלי (קרי, שבב-seq) (איור 1). כאשר משולב שבב-seq לטכנולוגיה, פרוטוקול השבב שלנו יכול לשמש יחד עם שיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך בהרחבה נגיש מעבדות רבות10. פרוטוקול זה שימש לחקור מספר סימני היסטון (למשל, H3K4me3, H3K27me3 ו H3K27ac) ברקמות עוף שונה עובריים (למשל, בעמוד השדרה שפופרת פגמים בתעלה (SNT), frontonasal prominences ו epiblast). עם זאת, אנו צופים כי זה צריך להיות בהרחבה החלים על אורגניזמים אחרים שבו דגימות רלוונטי מבחינה ביולוגית או קלינית יכולה להיות מושגת רק בסכומים נמוכים.

Protocol

בהתאם להנחיות גרמני טיפול בבעלי חיים, אין אישור מוסדי חיה טיפול, שימוש הוועדה (IACUC) היה צורך לבצע את הניסויים העובר עוף. על פי הנחיות מקומיות, רק ניסויים עם עוף HH44 (18-יום) העוברים ומעלה מחייבות אישור IACUC. עם זאת, העוברים השתמשו במחקר זה היו לבושים בבגדי בשלבים מוקדמים של התפתחות (קרי, HH19 (72 h)).

הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לספק תיאור מפורט של שבב וזמינותו אז זה יכול להיות משולב בצורה יעילה עם qPCR או הדור הבא רצפי (קרי, צ'יפ-seq) לחקור היסטון שינויים ב נמוך-שפע דוגמאות עובריים (החל 5 x 10 4-5 x 10 5 תאים עבור כל תגובה צ'יפ) ואת סוגי רקמות שונות ( איור 1). הפרוטוקול צריך להיות ישים חוקרת את הפרופילים מחייב בין גורמי שעתוק שיתוף activators (למשל, p300). עם זאת, בשל שפע התחתון של אלה חלבוני, מספרי הטלפון הנייד גדול יותר צפויים להיות הנדרש (5 x 10 5 - 5 x 10 6 תאים עבור כל תגובה צ'יפ).

1. הכנה של ביצים, Microdissection של תחנת SNT עוף

הערה: ההליך microdissections טכנית שונה עבור רקמה לרקמה, המודל החייתי במודל בעלי חיים. סעיף זה מתאר בפירוט פרוטוקול לנתיחה נהגה לקבל איחתי SNT קטעים מן הבמה-HH19 עוברי עוף כדוגמה.

  1. דגירה שה"לגהורן פורייה התרנגולת ביצים, המתקבל תרבית מקומית, בכיוון אופקי ב- 37 ° C ו- 80% לחות למשך 3 ימים לקבל את הבמה-HH19 עוברי עוף.
  2. לקבוע השלבים לפי המבורגר המילטון עוף עובריים התפתחותית הזמני מערכת 17.
  3. לבצע כל microdissections בתנאים קרים; אחרת, יכול להיות בסכנה שלמות כרומטין.
  4. לבודד את העוברים HH19.
    1. כדי להפוך את העוברים נגיש, לחלץ 3 מ"ל של אלבומין באמצעות מזרק 10-mL עם מחט (0.90 x 40 מ מ) להוריד את blastoderm.
    2. להפוך חור קטן בתוך הביצה באמצעות מספריים בסדר ולהוסיף 1 מ"ל של לוק פתרון (ראה חומרים משלים על המתכון) כדי להקל על הסרת ריריות עובריים במיוחד.
    3. מזריקים דיו הודי שחור/לוק 10% הפתרון באמצעות מזרק 1-mL עם מחט (0.55 x 25 ממ 2) תחת blastoderm כדי להקל את החזיית העוברים.
    4. לחתוך את קרום במיוחד עובריים המקיף את העובר תוך שימוש רפואי מספריים כירורגיים בסדר וחדים.
    5. להשתמש בכף מחוררת כדי להעביר את העובר 4.5 ס מ המכיל 20 מ של 1 x PBS פתרון צלחת פטרי.
  5. לנתח משם את השפיר ואת החלקים הנותרים של ממברנה במיוחד עובריים באמצעות מספריים בסדר ומלקחיים תחת stereomicroscope.
  6. לחתוך על קטע SNT רוחבי ברמה איחתי של העובר, הרחבת הקליפה אל אזור בית החזה כדי לבודד תחנת SNT ( איור 2).
  7. להסיר רקמות המקיפים רוחבית/ventrally תחנת SNT (למשל, צלחת לרוחב והמזודרם האאקטודרם, מיתר הגב, אבי העורקים) באמצעות מלקחיים ( איור 2).
  8. לטבול כל קטע SNT ביתור העוף ב- 3.5 ס מ פטרי המכילות 5 מ של טריפסין חמים (37 ° C) (טריפסין/EDTA פתרון 1:250).
  9. תפסיקו את הטיפול טריפסין התרופפות של הרקמות ללא עצביות סביב תחנת SNT מזוהה תחת stereomicroscope.
    הערה: הזמן trypsinization חייבים להיות בחוזקה מבוקרים כדי למנוע את הפיזור של רקמת העצבים והעיכול יתר וכדי לשמור על שלמות המבנה של תחנת SNT.
  10. לאחר טיפול טריפסין, להסיר את הרקמות הנותרים באופן ידני כדי להכין את המקטע SNT נקי mesenchymal, ectodermal.
  11. להעביר את המקטע SNT צינור 1.5 mL, הקפאה זה בחנקן נוזלי. פעם אחת מספיקה SNT מקטעים מצטבר (בריכה תחנת SNT סעיפים מעוברים עוף ~ 30 עבור התגובה שבב אחד), לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס
    הערה: אם מתחלקים מספיקות (קרי, 5 x 10-5-5 x 10 6 תאים) יכול להיות גזור אחת או כמה עוברי עוף, ואז לקפוא אין צורך זה אפשרי להמשיך ישירות אל השלבים הבאים. נא עיין במדריך של פתרון בעיות בטבלה 1-
    הערה: זהירות! חנקן נוזלי יש על טמפרטורה נמוכה מאוד, לענוד הגנה הולמת.

2. Crosslinking חלבונים ל- DNA: יום 1

הערה: לבצע את כל השלבים על קרח אלא אם צוין אחרת.

  1. µL להוסיף 500 של DMEM עם 10% FBS ו 10 µL של 1 מ' נה-butyrate ישירות אל הרקמה קפוא או, לחילופין, מיד לרקמת טרי גזור. Homogenize התאים על ידי מחדש השעיית בעדינות עם פיפטה 1 מ"ל.
    הערה: התוספת של Na-butyrate הוא אופציונלי אך מומלץ אם חוקרים acetylation היסטון. במקום DMEM - 10% FBS, דגימות יכול להיות resuspended ב 1 x PBS עם 0.1% BSA. התוספת של FBS או BSA היא אופציונלית, אך הוא מקל pelleting הדגימות בשלבים הבאים צנטריפוגה.
  2. להוסיף µL 13.5 של 37% פורמלדהיד (1% פורמלדהיד הסופי) ומניחים אותו על מסובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זהירות! פורמלדהיד הוא רעיל.
  3. להוסיף 25 µL של גליצין 2.5 מטר הצינור ומניחים אותו על מסובב 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להרוות את הפורמלדהיד.
  4. לסובב את הצינור ב- g x 850 עבור 5 דקות ב 4 ° C ומפרידה שולחני. למחוק את תגובת שיקוע.
  5. לרחוץ את גלולה פעם אחת עם 500 µL של קור שטיפת הטרי מאגר (ראה חומרים משלים על המתכון), צנטריפוגה-850 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע.

3. פירוק, Sonication

  1. פירוק השלם להכין מאגר (ליברות) (ראה חומרים משלים על המתכון), צונן על קרח. עבור 1 מ"ל, להשתמש µL 950 ק ג, µL 40 של תרכיז מעכב פרוטאז (25 x) ו 10 µL של 100% PMSF.
  2. Resuspend בגדר ב- 300 µL של LB מלאה על-ידי pipetting ומניחים אותו על פלטפורמה נדנדה עבור 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  3. Sonicate הדגימות באמצעות ההגדרות הבאות: Temp = 4 ° C, סה כ זמן = 7 דקות, “ על ” מרווח = 30 s, “ את ” מרווח = 30 s, משרעת = 25%
    הערה: Sonication צריך להיות אופטימיזציה עבור כל רקמות והתנאים ישתנו בהתאם sonicator פעם. מומלץ להשתמש בהגדרות sonication הנמוך כי התוצאה ב- DNA הוטו, החל מ- 200 ועד 600 bp בגודלם. הטיית משתנה מאוד בהתאם לסוג הרקמה, quanti. טיי, נפח sonication, crosslinking תנאים וציוד. נא עיין במדריך של פתרון בעיות בטבלה 1-
  4. ספין מדגם sonicated ב g 16,000 x 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה ההריסות הסלולר.
  5. להעביר את lysate (תגובת שיקוע) צינור 1.5-mL טריים.
    הערה: אם חומר המוצא נחשבת מספיק עבור שני ניסויים שבב, ואז µL 300 של LB מלאה ניתן להוסיף את כרומטין sonicated (קרי, גמר נפח: 600 µL).
  6. להוסיף 30 µL של 10% octylphenol ethoxylate עבור כל µL 300 של sonicated lysate (ריכוז סופי: 1%) על ידי pipetting.
    הערה: זהירות! Octylphenol ethoxylate הוא בחריפות רעיל (דרך הפה, עורי, אינהלציה).

4. הדגירה נוגדן

  1. Aliquot 330 µL של sonicated lysate לתוך שני צינורות 1.5-mL: 300 µL עבור שבב ו 30 µL של הפקד קלט (10% של חומר המוצא). החנות " 30 µL פקד קלט מדגם " ב-20 מעלות צלזיוס
    הערה: אם שתי תגובות שבב מבוצעות מדגם זהה, ואז µL 660 של sonicated lysate יכול להיות מופץ לתוך 1.5 mL שלושה צינורות (300 µL עבור שבב #1, 300 µL עבור השבב #2, µL 60 כפקד קלט (20% של חומר המוצא של כל שבב) ).
  2. µG 3-5 של נוגדן להוסיף µL 300 של aliquot sonicated כרומטין, ' היפוך ' כדי לערבב.
    הערה: במחקר זה, כל תגובה שבב בוצעה עם נוגדן ספציפי עבור tri היסטון H3 מפוגל ב K4 (H3K4me3), H3 היסטון di מפוגל ב K4 (H3K4me2), tri היסטון H3 מפוגל-K27 (H3K27me3), ו- H3 היסטון acetylation tri-K27 (H3K27me3). ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה לחלוטין האיכות של הנוגדן בשימוש. הנוגדן צריך להיות ספציפי ויעיל -immunoprecipitation של חלבון ספציפי. חשוב לקבוע את כמות נוגדנים יכולים לשמש immunoprecipitate החלבון תפור-הדנ א מורכבים. כמו כן, ניתן לבדוק יחודיות של הנוגדן מאת תספיג כדי להבטיח כי הוא מזהה את החלבון הנכון. נוגדן שמזהה מספר להקות ספציפי אינה מומלצת עבור השבב.
  3. למקם את הצינורית על פלטפורמה נדנדה ב 4 ° C בלילה (12-16 שעות) כדי לאגד הנוגדן כרומטין.
    הערה: נא עיין במדריך של פתרון בעיות בטבלה 1-

5. הכנת Beads מגנטי: ביום 2

  1. Aliquot 50 - 100 µL של slurry חרוז חלבון G/מגנטי עבור כל תגובה השבב לתוך microfuge 1.5 mL צינור על קרח
  2. לרחוץ את החרוזים מגנטי שלוש פעמים עם בלוק קר פתרון (ראה חומרים משלים על המתכון) (4 ° C). להוסיף 500 µL של פתרון בלוק קר ומיקס על ידי היפוך או להכות אותך. להכניס את הצינור מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור. יוצקים את הנוזל צלול וחזור. לאחר השטיפה האחרונה הסרת כל נוזל עם טיפ ג'ל העמסה.

6. Immunoprecipitation של כרומטין

  1. להוסיף את µL 300 של נוגדן מכורך כרומטין החרוזים שטף, היפוך לערבב.
  2. סובב בצורה אנכית על שפופרת מסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות כדי לאגד נוגדנים את החרוזים.

7. לשטוף Elute, להפוך את Crosslinks

  1. להירגע ריפה שטיפת מאגר (ראה חומרים משלים על המתכון) על קרח, להגדיר את המים הרותחים עד 65 ° צלזיוס, precool לצנטריפוגה 4 ° C.
  2. לרחוץ את החרוזים כרומטין מכורך ארבע פעמים ב 1 מ"ל מאגר שטיפת ריפה קר ולשמור על קרח. כדי לבצע זאת, הוסף 1 מ"ל של מאגר שטיפת ריפה, מיקס קר על-ידי היפוך או מצליף. למקם את הצינור לתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור. יוצקים את הנוזל צלול וחזור.
    הערה: מספר שוטף עם מאגר שטיפת ריפה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים בהתאם סוג הדגימה, מדגם, והשפע הנוגדן בשימוש. עלייה במספר שוטף ומפחיתות את הרקע אבל יהיה גם להקטין את הסכום הכולל של DNA התאושש, אשר יכולה לסכן את ניתוח במורד הזרם על ידי qPCR או שבב-תת סעיף.
  3. להוסיף 1 מ"ל של טה/50 מ מ NaCl הצינור, להעביר את החרוזים מאוגד-כרומטין של טה/50 מ מ NaCl צינור microfuge 1.5-mL טריים לפני הסרת הנוזל באמצעות מחזיק מגנטי, כפי שתואר לעיל.
  4. לסובב את החרוזים ב g x 900 למשך 3 דקות ב 4 ° C, למקם את הצינור בחזרה לתוך מחזיק מגנטי, ולהסיר טה כל הנותר עם טיפ ג'ל העמסה.
  5. µL 210 להוסיף מאגר • תנאי (ראה חומרים משלים על המתכון) בטמפרטורת החדר, resuspend על ידי מצליף.
  6. Elute למשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום תוך טלטול.
  7. לסובב את החרוזים-16,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ומניחים את הצינור לתוך מחזיק מגנטי.
  8. להעביר את תגובת שיקוע (~ 200 µL) צינור microfuge טרי ברגע החרוזים התיישבו.
  9. להפשיר את פקד קלט הדגימות (30 µL)-20 ° C לטמפרטורת החדר (קפוא בשלב 4.1), מוסיפים 3 כרכים • תנאי מאגר (90 µL), ומערבבים על ידי בקצרה vortexing.
  10. דגירה בדגימות שבב ושליטה ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה (12-16 שעות) כדי להפוך את crosslinks.

8. תקציר הסלולר חלבון ו- RNA: יום 3

  1. 8.1At בטמפרטורת החדר, להוסיף נפח 1 טה מאגר למחזור (כדי לדלל את מרחביות), ' היפוך ' כדי לערבב: להוסיף 120 µL של טה µL 120 הבקרה מדגם של 200 µL של טה כדי µL 200 המדגם שבב.
  2. להוסיף RNase A ריכוז סופי 0.2 מ"ג/מ"ל ו ' היפוך ' כדי לערבב: להוסיף µL 2.4 של 20 מ"ג/מ"ל RNase A µL 240 דגימת הבקרה של 4 µL של 20 מ"ג/מ"ל RNase A כדי µL 400 המדגם שבב-
  3. דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור 2 h לעכל את הרנ א.
  4. להוסיף K Proteinase כדי ריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל, ' היפוך ' כדי לערבב: להוסיף µL 2.4 של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase K µL 240 דגימת הבקרה של 4 µL של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase K כדי µL 400 המדגם שבב-
  5. Incubate ב 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור 2 h כדי לעכל את החלבון ולטהר את הדנ א.

9. שבב-qPCR

הערה: לבצע הפקת דנ א, טיהור, כפי שמתואר חומרים משלים.

הערה: ודא sonication יעילות כמתואר חומרים משלימים, כדי לאשר כי שברי DNA 200 ל 500-bp - מתקבלים ( איור 3).

הערה: שלב קריטי זה כדי לקבוע אם השבב באמת עבד. אם שם ידועים אתרי קישור גנומית של החלבון עניין, תחל ניתן לעצב עבור ה-PCR כמותי (qPCR) כדי לקבוע אם האתרים ידוע במיוחד מועשרים ב- ChIP הדנ א, לעומת אזורים שלילי-פקד לא צפוי להיות מחויב על ידי קנדיתאריך חלבונים. לדוגמה, עבודה זו מציגה את התוצאות שבב-qPCR שהושג עם שבבי שבוצעה עבור H3K4me3 (סימן היסטון יזם פעיל) ו H3K27me3 (סימן היסטון יזם לא פעילים) בסעיפים SNT מבודד מן העוברים צ'יק HH14 ( איור 4A ).

  1. לערבב כל זוג פריימר (ואחורה) בצינור אותו ולהכין ריכוז מניות ב 20 מיקרומטר כל שימוש dH 2 O (טבלה 2).
    הערה: היעילות של כל זוג פריימר צריך להעריך לפני ניתוח שבב-qPCR.
  2. להשתמש שבב ו-20% קלט בפקד ה-DNA שהושג בשלב 8.5 עבור אופטימיזציה qPCR.
    הערה: הקלט הדנ א הוא בדרך כלל מדולל 20 x (ל- 1% של חומר המוצא המשמשים את התגובות צ'יפ) לניתוח qPCR.
  3. עבור כל µL 10 של ה-PCR, לערבב את המרכיבים הבאים בשפופרת PCR: DNA mastermix, להוסיף 2 µL של dH2O, µL 2.5 של מיקס SYBR ירוק ו- 1 µL של ה-DNA (מ- 1% קלט או צ'יפ); עבור mastermix עם צבעי יסוד , להוסיף µL 2.375 dH2O, µL 2.5 של מיקס SYBR ירוק ו 0.125 µL של פריימר ואחורה מיקס.
  4. לערבב את הדוגמאות על-ידי vortexing עבור 2 s ו בקצרה צנטריפוגה-g x 900 עבור מינימלית 1
  5. לבצע PCR בזמן אמת (דוגמה תחל תנאי הרכיבה המשמש כאן ניתן למצוא בטבלה 2 ו- 3 טבלה, בהתאמה).
    הערה: שבב-qPCR ניתוח נתונים: שבב אותות מחושבים האחוזים של הקלט. בקיצור, פעם הערכים Ct מתקבלים עבור כל תגובה qPCR, גורם לדילול של מחזורי 100 או 6.644 (log2 של 100) מוחל על הערכים Ct השיג עבור תגובות דנ א קלט. לאחר מכן, עבור אזור נתון עניין (קרי, צמד פריימר), האותות שבב מחושבים כדלקמן:
    מותאם קלט = Ct (קלט) - 6.644
    שבב אות = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10-צ'יפ-seq ספריית הכנה; סיום תיקון: יום 4

  1. לדלל עד 100 ng של שבב-DNA ב µL 60 • תנאי מאגר (ראה חומרים טבלה).
  2. להוסיף 40 μL סיום תיקון מיקס, פיפטה בעדינות 10 פעמים.
  3. Incubate ב- 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על הצנטרפוגה תרמי.
  4. מערבולת המגנטי חרוזים ולהוסיף 160 μL הצינור המכיל את התמהיל תיקון סוף. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מקם את הצינור לתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד הצינור.
  6. יוצקים את הנוזל צלול.
  7. תוך שמירה על הצינור במתקן מגנטי, להוסיף 200 μL של 80% טריות EtOH.
  8. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 30 s ו להשליך תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.
  9. לשמור את הצינור למשך 15 דקות על מחזיק מגנטי בטמפרטורת החדר. לאחר בגדר יבש, להסיר את הצינור ממחזיק מגנטי.
  10. Resuspend בגדר ב μL 20 resuspension מאגר. בעדינות פיפטה 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.
  11. Incubate למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. למקם את הצינור לתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור. להעביר μL 17.5 של תגובת שיקוע צינור חדש.

11. שבב-seq ספריית הכנה; אדנילאט 3 ' מסתיים

  1. μL להוסיף 12.5 של A-עוקב מיקס החדש ובשעות לערבב ביסודיות על ידי pipetting בעדינות לאורך 10 פעמים. למקם את הצינורית על הצנטרפוגה תרמי, דגירה לפי התוכנית הבאה: 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות והחזק ב 4 ° C

12. שבב-seq ספריית הכנה; מאתרים ומפסיקים מתאמי

מאגר
  1. להוסיף 2.5 μL של resuspension, μL 2.5 של מיקס מצדו, μL 2.5 של מדד המתאים של מתאם ה-RNA. לערבב ביסודיות על ידי pipetting בעדינות לאורך 10 פעמים.
  2. Incubate על הצנטרפוגה תרמי 10 דקות ב 30 מעלות.
  3. ΜL 5 להוסיף מאגר מצדו עצירה, לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים.
  4. מערבולת המגנטי חרוזים ולהוסיף 42.5 μL המדגם. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מקם את הצינור לתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור, יוצקים את הנוזל צלול
  6. תוך שמירה על הצינור במתקן מגנטי, להוסיף 200 μL של 80% טריות EtOH.
  7. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 30 s ו להשליך תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.
  8. להמשיך ברכבת התחתית מחזיק מגנטי ולא, תן הדגימה מילה נהדרת במשך 15 דקות.
  9. להסיר את הצינור ממחזיק מגנטי, resuspend בגדר ב μL 52.5 מאגר resuspension. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, להכניס את הצינורית בתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור. להעביר 50 μL של תגובת שיקוע ברור צינור חדש.
  10. מערבולת המגנטי חרוזים ולהוסיף 50 μL הדגימה. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. למקם את הצינור לתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור, יוצקים את הנוזל צלול.
  12. תוך שמירה על הצינור במתקן מגנטי, להוסיף 200 μL של 80% טריות EtOH.
  13. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 30 s ו להשליך תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.
  14. לשמור את הצינורית על מחזיק מגנטי, ותנו את האוויר מדגם יבש במשך 15 דקות
  15. להסיר את הצינור ממחזיק מגנטי, resuspend בגדר ב- 27.5 μL resuspension מאגר. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים.
  16. Incubate בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, להכניס את הצינורית בתוך מחזיק מגנטי ולחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור. 25 μL של תגובת שיקוע ברורה להעביר צינור.

13. שבב-seq ספריית הכנה; הגברה של מקטעי דנ א

  1. µL 12.5 המקום של התבנית ב- 0.2 מ ל PCR שפופרת. להוסיף 2.5 μL של ה-PCR פריימר קוקטייל, 10 μL של משופרת PCR מיקס. לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. למקם את הצינורית על הצנטרפוגה תרמי ולהשתמש בתנאים המתוארים בטבלה 4.
  2. מערבולת המגנטי חרוזים ולהוסיף 25 μL המדגם. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. במקום הצינור לתוך מחזיק מגנטי, לחכות החרוזים להתיישב בצד של הצינור, יוצקים את הנוזל צלול.
  4. תוך שמירה על הצינור במתקן מגנטי, להוסיף 200 μL של טריות 80% EtOH. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ו להשליך תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.
  5. לשמור הצינור, מחזיק מגנטי, תן האוויר מדגם יבש במשך 15 דקות להסיר את הצינור ממחזיק מגנטי, resuspend בגדר ב- 32.5 μL resuspension מאגר. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים.
  6. דגירה ה-PCR הצינור פלטה/למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. במקום פלטה/הרכבת התחתית של PCR על הדוכן מגנטי בטמפרטורת החדר, לחכות החרוזים להתיישב בצד הצינור ולהעביר μL 30 של תגובת שיקוע ל צינור חדש.

14. שבב-seq ספריית הכנה; ספריית אימות

הערה: האימות של הספרייה מתבצעת באמצעות מערכת בקרת איכות DNA ו- RNA. הכנה של הסולם: aliquot 1 µL של סולם הדנ א הגנומי לתוך הראשון צינור/היטב ולהוסיף 3 µL דוגמת המאגר.

  1. הכנת המדגם: לערבב 1 µL של המדגם ספריה (10-100 ng/µL) עם 3 µL דוגמת המאגר בצינור. ספין למטה ולאחר מכן מערבולת על המהירות המרבית לסיבוב ס' 5 למטה כדי למקם את הדגימה בתחתית השפופרת.
  2. לטעון את הדגימות לתוך מערכת בקרת איכות.
  3. לאחר סיום המרוץ, לנתח את התוצאות על-ידי הגדרת הניגודיות עם ערך מרבי כדי לוודא כי אין הדימרים פריימר נוכחים המדגם ( איור 5); פריימר הדימרים צריכה להתאים-להקה בסביבות 135 bp. אם אפילו להקה חלשה, להמשיך השני לנקות על-ידי הוספת • תנאי מאגר (ראה טבלת חומרים) עד נפח 50 µL ולהוסיף µL 47.5 של חרוזים מגנטי מעורבת. אם הריכוז של המדגם נמוכה מדי (< 2 ננומטר), להמשיך להפעיל את ה-PCR (שלב 13.1), באמצעות 18 מחזורים במקום 15, עם נפח 12.5-µL לדוגמה משמאל שלב 12.16.
  4. לכמת את הספריות בנפרד על-ידי qPCR באמצעות ערכות זמינים מסחרית.
    הערה: בריכות של ספריות יכול להיות רציף באמצעות ברצף עם יחיד-קריאת הפרוטוקול nt 1 x 50 מכוון 30 מ' reads/המדגם.

תוצאות

כדי להמחיש את הביצועים של פרוטוקול השבב שלנו, ביצענו ניסויים באמצעות סעיפים SNT במאגר מעוברים עוף HH19, prominences בלסת העליונה של HH22 עוף העוברים ולאחר שלב-HH3 עוברי עוף לחקור את הפרופילים איגוד של שבב-seq למגוון היסטון שינויים (קרי, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 ו- H3K27me3). ברגע DNAs שבב התקבלו, היע...

Discussion

Epigenomic פרופיל של שינוי היסטון באמצעות שבב-seq יכול לשמש כדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום חוליות שונות בהקשרים הסלולר4,5,18. פרופילים אלה epigenomic יכול לשמש, בין היתר, כדי לזהות רכיבים משפר, להגדרת המדינה הרגולציה של מוצרי טיפוח טבעיים (קר?...

Disclosures

המחברים אין לכל אינטרסים כלכליים מתחרים להיות מגולה.

Acknowledgements

המחברים תודה Jan אפל לסיוע טכני מעולה שלו במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. לעבודה במעבדה ראדה-איגלסיאס נתמך על-ידי CMMC מגזר מימון, מענקי מחקר DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, ו טה 1007/3-1), UoC מתקדמים החוקרת קבוצת גרנט, המענק CECAD.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
BSA powderCarl Roth3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)Sigma AldrichD8537
Tris-HCL pH8.0Sigma AldrichT1503
NaClCarl Roth3957.2
EDTACarl Roth8043.2
EGTACarl Roth3054.2
Na-DeoxycholateSigma AldrichD6750-24
N-lauroylsarcosineSigma Aldrich61743-25G
HepesApplichemA3724,0250
LiClCarl Roth3739.2
NP-40Sigma AldrichI3021-100ml
SDSCarl Roth1833
Protein G/magnetic beadsInvitrogen1004D
37% FormaldehydeSigma Aldrich252549-1L
Glycine
RNasePeqlab12-RA-03
Proteinase KSigma Aldrich46.35 E
Na-butyrateSigma AldrichSLB2659V
Proteinase inhibitorRoche5892791001
SYBRgreen Mixbiozym617004
dH2OSigma AldrichW4502
1Kb ladderThermofisherSM1333
Orange GSigma Alrich03756-25
AgaroseInvitrogen16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)Roth3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)Gibco31331-028
Gel loading tips MultiflexA.HartensteinGS21
qPCR PlatesSarstedt721,985,202
384 wellSarstedt721,985,202
1.5 mL tubesSarstedt72,706
100-1000µl Filter tipsSarstedt70,762,211
2-20µl Filter tipsSarstedt70,760,213
2-200µl Filter tipsSarstedt70,760,211
0.5-10µl Filter tipsSarstedt701,116,210
H3K27me3 antibodyActive Motif39155
H3K27ac antibodyActive Motif39133
H3K4me3 antibodyActive Motif39159
H3K4me2 antibodyActive Motif39141
End Repair MixIlluminaFC-121-4001
Paramagnetic beadsBeckman CoulterA63881
Resuspension bufferIlluminaFC-121-4001
A-Tailing MixIlluminaFC-121-4001
Ligation MixIlluminaFC-121-4001
RNA Adapter IndexesIlluminaRS-122-2101
Stop Ligation BufferIlluminaFC-121-4001
PCR Primer CocktailIlluminaFC-121-4001
Enhanced PCR MixIlluminaFC-121-4001
Genomic DNA ladderAgilent5067-5582
Elution BufferAgilent19086
Sample BufferAgilent5067-5582
Library Quantification KitKapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggsLSL Rhein MainKN: 15968
Needle (Neoject)A.Hartenstein10001
Syringe (Ecoject 10ml)Dispomed witt oHG21010
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
CentrifugeHermleZ 216 MK
ThermoshakerITABISMKR13
SonicatorActive MotiveEpiShear probe sonicator
SonicatorDiagenodeBioruptor Plus
RotatorStuartSB3
Variable volume (5–1,000 μl) pipettesEppendorfN/A
TimerSigmaN/A
Magnetic holderThermo FisherDynaMag-2 12321D
Table spinnerHeathrow ScientificSprout
MixerLMSVTX 3000L
Real-Time PCR CyclerRocheLight Cycler; Serial Nr.5662
PCR CyclerApplied BiosystemsGene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control systemAgilentAgilent 4200 TapeStation System
ForcepsDumont5-Inox-H
Perforated spoonWorld precision instruments501997

References

  1. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  8. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  9. Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
  10. Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
  11. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  12. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  13. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  14. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  15. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  16. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
  18. Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
  19. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  20. Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126immunoprecipitationseqepigenomic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved