Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Résumé

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Résumé

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique largement utilisée pour cartographier la localisation des histones modifiées post-traductionnellement, variants d’histones, facteurs de transcription ou des enzymes modifiant la chromatine à un locus donné ou sur une échelle de tout le génome. La combinaison de tests de puce avec génération de séquençage (c.-à-d., ChIP-Seq) est une approche puissante pour découvrir dans le monde des réseaux de régulation génique et améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes, en particulier des séquences régulatrices non codantes. Puce protocoles nécessitent généralement de grandes quantités de matériel cellulaire, ce qui annule l’applicabilité de cette méthode à une enquête sur les types de cellules rares ou des biopsies tissulaires petit. Afin de rendre l’analyse de puce compatible avec la quantité de matières biologiques qui en général peuvent être obtenus in vivo au cours de l’embryogenèse précoce de vertébrés, les auteurs décrivent ici un protocole simplifié de puce dans lequel le nombre d’étapes nécessaires pour terminer le test ont été réduits pour minimiser la perte de l’échantillon. Ce protocole ChIP a été utilisé avec succès pour enquêter sur des modifications d’histone différentes dans différents poulet embryonnaire et les tissus de souris adulte moyen faible pour un nombre moyen de cellules (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ cellules). Surtout, ce protocole est compatible avec la technologie ChIP-seq, à l’aide de méthodes de préparation de la bibliothèque standard, fournissant ainsi l’épigénomique global cartes dans les tissus embryonnaires très pertinents.

Introduction

Modifications post-traductionnelles des histones sont directement impliquées dans divers processus dépendants de chromatine, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN pour^1,2,3. En outre, les modifications d’histone différents montrent positifs (par exemple, H3K4me3 et H3K27ac) ou négatif (par exemple, H3K9me3 et H3K27me3) corrélations avec l’expression du gène et peuvent être définis de façon large comme marque d’histone activant ou répressive, respectivement^2,3. Par conséquent, cartes de modification globale histone, également appelées cartes épigénomique, sont apparus comme des outils puissants et universels d’annoter fonctionnellement des génomes de vertébrés^4,5. Par exemple, les séquences régulatrices distales comme exhausteurs peuvent être identifiés basé sur des signatures spécifiques de chromatine (p. ex., active exhausteurs : H3K4me1 et H3K27ac), qui les distinguent des régions promotrices proximal (par exemple, promoteurs actifs : H3K4me3)^6,7,8. En revanche, gènes avec fonctions réglementaires d’identité cellulaire majeur se trouvent généralement avec les domaines de la chromatine large marquées avec H3K4me3 ou H3K27me3, suivant l’État transcriptionnellement actif ou inactif des gènes sous-jacent, respectivement^{9 ,},¹⁰. De même, l’expression des gènes d’identité cellulaire majeure semble être fréquemment contrôlée par de multiples et dans l’espace en cluster exhausteurs (c.-à-d., les exhausteurs de Super), qui peuvent être identifiés comme grands domaines marqués H3K27ac¹¹.

Actuellement, modification des histones cartes sont générées en utilisant la technologie ChIP-seq, qui, par rapport aux approches précédentes telles que ChIP-chip (puce couplée à des puces à ADN), offre une résolution plus élevée, moins d’artefacts, moins de bruit, la couverture supérieure et inférieure frais¹². Néanmoins, la génération de cartes épigénomique utilisant la technologie ChIP-seq a ses limites inhérentes, surtout associés à la capacité de réaliser avec succès la puce dans les échantillons d’intérêt. Protocoles de puce traditionnels généralement requis des millions de cellules, qui limite l’applicabilité de cette méthode pour cellulaire in vitro des lignes ou des cellules qui peut facilement être isolés en vivo (par exemple, les cellules sanguines). Dans ces dernières années, un certain nombre de mis à jour le protocoles de puce compatibles avec un nombre faible de cellules ont été décrits^13,14,15,16. Toutefois, ces protocoles sont spécifiquement conçus pour être couplé avec la nouvelle génération séquençage (c.-à-d., ChIP-seq), et ils utilisent généralement ad hoc bibliothèque préparation méthodes^{13,14, 15 , 16}.

Ici, nous avons décrit un protocole de puce qui peut être utilisé pour étudier les profils de modification d’histone en utilisant le nombre de cellules faible à intermédiaire (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ cellules) locus soit sélectionné (c'est-à-dire, ChIP-qPCR) ou dans le monde (par exemple, ChIP-seq) (Figure 1). Lorsqu’il est couplé à la technologie ChIP-seq, notre protocole de puce peut être utilisé ainsi que les méthodes de préparation de bibliothèque standard, ce qui le rend largement accessible à de nombreux laboratoires¹⁰. Ce protocole a été utilisé pour étudier plusieurs marques d’histone (par exemple, H3K4me3, H3K27me3 et H3K27ac) dans les tissus embryonnaires de poulet différentes (par exemple, la colonne vertébrale du tube neural (SNT), fronto proéminences et épiblaste). Cependant, nous pensons qu’il devrait être largement applicable à d’autres organismes qui échantillons biologique et/ou cliniquement pertinentes peuvent être obtenus seulement en faibles quantités.

Protocole

selon les directives allemandes de protection des animaux, aucune approbation institutionnelle animalerie et utilisation Comité (IACUC) n’était nécessaire pour réaliser les expériences d’embryon de poulet. Selon les directives locales, seules des expériences avec des embryons de poulet CM44 (18 jours) et plus âgés nécessitent l’approbation IACUC. Cependant, les embryons utilisés dans cette étude étaient tous dans les premiers stades du développement embryonnaire (c.-à-d. CM19 (72 h)).

Remarque : ce protocole vise à fournir une description détaillée de l’analyse de la puce, donc il peut être réuni avec qPCR ou séquençage de prochaine génération (c.-à-d., ChIP-seq) d’enquêter sur des modifications d’histone dans des échantillons de faible abondance embryonnaires (allant de 5 x 10, ⁴-5 x 10 ⁵ cellules pour chaque réaction de puce) et types de tissus différents ( Figure 1). Le protocole devrait être applicable à une enquête sur les profils de liaison des facteurs de transcription et co activateurs (p. ex., p300). Toutefois, en raison de la plus faible abondance de ces protéines régulatrices, les plus grands nombres de cellules sont susceptibles d’être requis (5 x 10 ⁵ - 5 x 10 ⁶ cellules pour chaque réaction de puce).

1. préparation d’oeufs et Microdissection de la SNT poulet

Remarque : la procédure de microdissections techniquement diffère de tissus tissus et de modèle animal pour le modèle animal. Cette section décrit en détail le protocole de dissection utilisé pour obtenir brachiale SNT sections du stade-CM19 des embryons de poulet par exemple.

1. Incuber des oeufs de poules leghorn blanche fertile, obtenus chez un éleveur local, en position horizontale à 37 ° C et 80 % d’humidité pendant 3 jours pour obtenir le stade-CM19 des embryons de poulet.
2. Déterminer les étapes selon le Hamburger et Hamilton de poulet embryonnaire du développement sur le système intermédiaire ¹⁷.
3. Effectuer des microdissections tous dans des conditions froides ; dans le cas contraire, l’intégrité de la chromatine est compromise.
4. Isoler les embryons CM19.
   1. Pour les embryons de la rendre accessible, extrait de 3 mL d’albumine à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille (0,90 x 40 mm) pour abaisser le blastoderme.
   2. Faire une petite ouverture dans le œuf à l’aide des ciseaux et ajouter 1 mL de solution de Locke (voir les Documents complémentaires pour la recette) pour faciliter l’enlèvement des membranes extra embryonnaires.
   3. Injecter 10 % indien noir d’encre/Locke solution en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille (0,55 x 25 mm ²) sous le blastoderme pour faciliter la visualisation des embryons.
   4. Couper la membrane extra embryonnaire qui entoure l’embryon à l’aide des ciseaux fins médicaux chirurgicaux et forceps.
   5. Une cuillère perforée permet de transférer l’embryon d’une boîte de Pétri contenant 20 mL de solution de PBS 1 x 4. 5 cm.
5. Disséquer loin l’amnios et le reste de la membrane extra embryonnaire à l’aide de ciseaux fine et forceps sous un stéréomicroscope.
6. Couper le segment SNT transversal au niveau brachial de l’embryon, s’étendant en direction caudale vers la région thoracique pour isoler la SNT ( Figure 2).
7. Enlever les tissus qui entourent latéralement/ventralement la SNT (p. ex., plaque latérale mésoderme, ectoderme, notochorde et aorte) à l’aide de pinces ( Figure 2).
8. Plonger chaque segment SNT poulet découpé dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de trypsine tiède (37 ° C) (1/250 de solution de trypsine/EDTA) de 3,5 cm.
9. Arrêter le traitement par la trypsine lorsqu’un relâchement des tissus non-neurale autour de la SNT est détecté sous un stéréomicroscope.
   NOTE : Le temps de la trypsinisation doit être étroitement contrôlé afin d’éviter la digestion excessive et la dispersion du tissu neural et de conserver l’intégrité structurale de la SNT.
10. Après traitement par la trypsine, supprimer les autres tissus mésenchymateux et ectodermiques manuellement pour préparer la section propre de la SNT.
11. Transférer la section SNT dans un tube de 1,5 mL et flash-congélation dans l’azote liquide. Une fois suffisamment SNT sections sont accumulée (piscine le SNT des sections d’embryons de poulet de ~ 30 pour une réaction de puce), à stocker à -80 ° C.
    Remarque : Si des tissus embryonnaires suffisante (c.-à-d. 5 x 10 ⁵-5 x 10 ⁶ cellules) peut être disséqué d’une seule ou quelques embryons de poulet, puis gel n’est pas nécessaire et il est possible de procéder directement à l’étape suivante. Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1.
    Remarque : attention ! Azote liquide a une température extrêmement basse, de porter une protection appropriée.

2. Protéines de réticulation à l’ADN : jour 1

Remarque : Exécutez toutes les étapes sur la glace, sauf indication contraire.

1. Ajouter 500 µL de DMEM avec 10 % FBS et 10 µL de 1 M Na-butyrate directement sur les tissus congelés ou, alternativement, immédiatement au tissu fraîchement disséqué. Homogénéiser les cellules en re-suspension doucement avec une pipette de 1 mL.
   Remarque : L’ajout de Na-butyrate est facultative mais recommandée si l’acétylation des histones. Au lieu de FBS DMEM - 10 %, les échantillons peuvent être charriés dans du PBS 1 x avec 0,1 % de BSA. L’ajout de FBS ou BSA est facultative, mais elle facilite les échantillons dans les étapes ultérieures de centrifugation de la granulation.
2. Ajouter 13,5 µL de 37 % de formaldéhyde (1 % formaldéhyde final) et le placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15 minutes.
   Remarque : attention ! Le formaldéhyde est toxique.
3. Ajouter 25 µL de glycine de 2,5 M dans le tube et le placer sur un agitateur pendant 10 min à température ambiante pour étancher la formaldéhyde.
4. Tourner le tube à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de table-top. Jeter le surnageant.
5. Laver le culot avec 500 µL de froid lavage fraîchement préparée (voir les Documents complémentaires pour la recette), centrifugeuse de la mémoire tampon à 850 x g et 4 ° C pendant 5 min et éliminer le surnageant.

3. Lyse et Sonication

1. Prepare lyse complète tampon (LB) (voir les Documents complémentaires pour la recette) et froid sur la glace. 1 ml, utilisez 950 µL de LB et 40 µL de concentré d’inhibiteur de protéase (x 25) 10 µL de 100 % PMSF.
2. Resuspendre le culot dans 300 µL de LB complet de pipetage et posez-le sur une plate-forme bascule pendant 10 min à 4 ° C.
3. Laisser agir les échantillons en utilisant les paramètres suivants : Temp = 4 ° C, temps Total = 7 minutes, “ sur ” intervalle = 30 s, “ hors ” intervalle = 30 s, amplitude = 25 %
   NOTE : Les conditions de Sonication doivent être optimisées pour chaque tissu et varieront selon le sonicateur utilisé. Il est recommandé d’utiliser les paramètres de sonication plus bas qui donnent lieu à ADN cisaillé allant de 200 à 600 bp en taille. Cisaillement varie considérablement selon le type de tissu, quantiTy, le volume de la sonication, conditions de réticulation et équipement. Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1.
4. Faites tourner l’échantillon aux ultrasons à 16 000 x g pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les débris cellulaires.
5. Transférer le lysat (surnageant) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   Remarque : Si le produit de départ est jugé suffisant pour deux expériences de puce, puis 300 µL de LB complète peut être ajouté à la chromatine aux ultrasons (c'est-à-dire le volume final : 600 µL).
6. Ajouter 30 µL de 10 % octylphénol éthoxylé pour chaque 300 µL de sonication lysat (concentration finale : 1 %) et de la composition de pipetage.
   Remarque : attention ! Octylphénol éthoxylé présente une toxicité aiguë (par voie orale, cutanée, inhalation).

4. Incubation des anticorps

1. partie aliquote les 330 µL de sonication lysat dans deux tubes de 1,5 mL : 300 µL pour puce et 30 µL sous le contrôle d’entrée (10 % des matières premières). Magasin la " 30 µL d’échantillon contrôle d’entrée " à -20 ° C.
   Remarque : Si les deux réactions de puce sont effectuées à partir du même échantillon, puis les 660 µL de sonication lysat peuvent être distribuées dans trois tubes de 1,5 mL (300 µL pour puce #1 300 µL pour puce #2 et 60 µL dans le contrôle d’entrée (20 % de la matière première de chaque puce) ).
2. Ajouter 3-5 µg d’anticorps à la 300 µL de chromatine aux ultrasons aliquote et inverti mélanger.
   Remarque : Dans cette étude, chaque réaction de puce a été réalisée avec un anticorps spécifique pour le tri d’Histone H3 méthylée à K4 (H3K4me3), di Histone H3 méthylée à K4 (H3K4me2), tri d’Histone H3 méthylée à K27 (H3K27me3) et l’acétylation tri Histone H3 à K27 (H3K27me3). Le succès de ce protocole est entièrement dépendant de la qualité de l’anticorps utilisé. L’anticorps doit être spécifique et efficace à l’immunoprécipitation d’une protéine spécifique. Il est important de déterminer la quantité d’anticorps qui peut être utilisé pour l’immunoprécipitation l’ADN-protéine réticulé complexes. En outre, la spécificité de l’anticorps peut être vérifiée par Western blot pour s’assurer qu’il détecte la protéine correcte. Un anticorps qui détecte plusieurs bandes non spécifiques n’est pas recommandé pour puce.
3. Placer le tube sur une plate-forme bascule à 4 ° C durant la nuit (12-16 h) pour lier les anticorps à la chromatine.
   Remarque : Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1.

5. Préparation des billes magnétiques : jour 2

1. Aliquot 50 - 100 µL de protéine G/magnétique coulis perle pour chaque réaction de puce dans un microtubes de 1,5 mL de tube sur glace.
2. Laver les billes magnétiques trois fois avec une solution froide de bloc (voir les Documents complémentaires pour la recette) (4 ° C). Ajouter 500 µL de solution de bloc froid et mélanger par inversion ou pichenette. Mettre le tube dans un support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Décanter le liquide clair et répéter. Après le dernier lavage, évacuer tout le liquide avec une pointe de gel-chargement.

6. Immunoprécipitation de la chromatine

1. Ajouter les 300 µL de chromatine lié aux talons lavées puis retournez pour mélanger.
2. Faire pivoter verticalement sur une coiffe de tube à 4 ° C pendant au moins 4 h pour lier les anticorps aux talons.

7. Laver, éluer et inversez les croisements

1. RIPA de Chill, tampon de lavage (voir les Documents complémentaires pour la recette) sur la glace, mettre au bain-marie à 65 ° C et refroidir le centrifuger à 4 ° C.
2. Laver les perles de la chromatine lié aux quatre fois dans 1 mL de tampon de lavage froid RIPA et rester sur la glace. Pour ce faire, ajouter 1 mL de froid tampon de lavage RIPA et mélanger par inversion ou pichenette. Placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Décanter le liquide clair et répétez.
   Remarque : Le nombre de lavages avec tampon de lavage RIPA devrez peut-être être optimisée selon le type d’échantillon, l’abondance de l’échantillon et anticorps étant utilisé. Un augmentation du nombre de lavages permettra diminuer le fond mais aussi diminution de la quantité totale d’ADN récupéré, ce qui peut compromettre l’analyse en aval de qPCR ou ChIP-Seq.
3. Ajouter 1 mL de NaCl TE/50 mM dans le tube et transférer les perles de la chromatine-bondissent en TE/50 mM NaCl dans un tube de frais microtubes de 1,5 mL avant de retirer le liquide en utilisant le support magnétique, tel que décrit ci-dessus.
4. Tourner les talons à 900 x g pendant 3 min à 4 ° C, placer le tube dans le support magnétique et supprimer tous les autres TE avec une pointe de gel-chargement.
5. Ajouter 210 µL de tampon d’élution (voir les Documents complémentaires pour la recette) à température ambiante et remettre par pichenette.
6. Élution pendant 15 min à 65 ° C dans un bloc chauffant et en agitant.
7. Tourner les talons à 16 000 x g pendant 1 min à température ambiante et placer le tube dans MagNet holder.
8. Transférer le surnageant (~ 200 µL) dans un tube à centrifuger frais une fois que les perles sont sont installés.
9. Décongeler les échantillons de contrôle d’entrée (30 µL) de-20 ° C à température ambiante (congelés à l’étape 4.1), ajouter les 3 volumes du tampon d’élution (90 µL) et mélanger brièvement vortexer.
10. Incuber les échantillons à puce et contrôle à 65 ° C pendant la nuit (12-16 h) pour inverser les croisements.

8. ARN et des protéines cellulaires Digest : jour 3

1. 8.1At la température ambiante, ajouter 1 volume de tampon TE par tube (pour diluer le SDS) et inverser pour mélanger : ajouter 120 µL de TE à 120 µL de l’échantillon témoin et 200 µL de TE dans 200 µL de l’échantillon de ChIP.
2. Ajouter RNase A à une concentration finale de 0,2 mg/mL et l’inverser pour mélanger : ajouter 2,4 µL de 20 mg/mL RNase A à 240 µL de l’échantillon témoin et 4 µL de 20 mg/mL RNase A à 400 µL de l’échantillon de la puce.
3. Incuber les tubes à 37 ° C dans un bain-marie pendant 2 h digérer l’ARN.
4. Ajouter protéinase K à une concentration finale de 0,2 mg/mL et inverti pour mélanger : ajouter 2,4 µL de 20 mg/mL de protéinase K 240 µL de l’échantillon témoin et 4 µL de 20 mg/mL de protéinase K à 400 µL de l’échantillon de la puce.
5. Incuber à 55 ° C au bain-marie pendant 2 h pour digérer les protéines et purifier l’ADN.

9. Puce-qPCR

Remarque : effectuez l’extraction d’ADN et de purification, comme décrit dans les Documents complémentaires.

Remarque : vérifier l’efficacité de la sonication, tel que décrit dans les Documents complémentaires pour confirmer que les fragments d’ADN de 200 à 500-PB sont obtenues ( Figure 3).

Remarque : une étape cruciale consiste à déterminer si la puce effectivement travaillées. S’il sont connus des sites de liaison génomique pour la protéine d’intérêt, des amorces peuvent être conçus pour PCR quantitative (qPCR) pour déterminer si les sites connus sont spécifiquement enrichis dans l’ADN de la puce, par rapport aux régions de contrôle négatif ne devrait ne pas être lié par le candiprotéines de date. Ainsi, ce travail montre les résultats de ChIP-qPCR obtenus avec jetons pour H3K4me3 (marque d’histone promoteur actif) et H3K27me3 (marque d’histone promoteur inactif) dans les sections SNT isolées des embryons de poulets CM14 ( Figure 4 a ).

1. Mélanger chaque paire d’amorces (avant et arrière) dans le même tube et préparer une concentration stock à 20 µM à chaque utilisation dH ₂ O (tableau 2).
   Remarque : l’efficacité de chaque paire d’amorces devrait être évaluée avant l’analyse par puce-qPCR.
2. Utiliser le contrôle d’entrée ChIP et 20 % ADN obtenu à l’étape 8,5 pour l’optimisation de qPCR.
   NOTE : L’entrée de l’ADN est généralement dilué 20 x (à 1 % de la matière première utilisée dans les réactions de la puce) pour l’analyse de qPCR.
3. Pour chaque 10 µL de PCR, mélanger les composants suivants dans un tube PCR : pour ADN mastermix, ajouter 2 µL de dH2O 2,5 µL du mélange SYBR green et 1 µL d’ADN (à partir de puce ou un apport de 1 %) ; pour mastermix avec des amorces , ajouter 2.375 µL de 0,125 µL du mélange de l’apprêt avant et arrière, 2,5 µL du mélange SYBR green et dH2O.
4. Mélanger les échantillons au Vortex pendant 2 s et brièvement la centrifugeuse à 900 x g pendant 1 min.
5. Effectuer des PCR en temps réel (exemple des amorces et des conditions vélo utilisées ici se trouvent dans le tableau 2 et tableau 3, respectivement).
   NOTE : Analyse des données ChIP-qPCR : signaux de puce sont calculés comme le pourcentage de l’apport. Brièvement, une fois les valeurs de Ct sont obtenues pour chaque réaction de qPCR, un facteur de dilution de 100 ou 6.644 cycles (log2 100) est appliqué aux valeurs Ct obtenues pour les réactions d’entrée de l’ADN. Puis, pour une région donnée d’intérêt (c.-à-d., paire d’amorces), les signaux de la puce sont calculées comme suit :
   ajusté entrée = Ct (entrée) - 6.644
   signal de puce = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Réparation de fin : Jour 4

1. diluer jusqu'à 100 ng d’ADN-ChIP dans 60 µL de tampon d’élution (voir le tableau sur les matières).
2. Ajouter 40 μL de fin mélange de réparation et Pipeter doucement 10 fois.
3. Incuber à 30 ° C pendant 30 min sur un thermocycleur.
4. Vortex magnétique perles et ajouter 160 μl dans le tube contenant le mélange de réparation de fin. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
5. Placer le tube dans le support magnétique et attendre pour les perles de s’installer sur le côté du tube...
6. Décanter le liquide clair.
7. Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
8. Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répétez une fois..
9. Maintenir le tube pendant 15 min sur le support magnétique à température ambiante. Une fois que la pastille est sec, retirez le tube du Magnet holder.
10. Resuspendre le culot dans 20 μL de tampon de resuspension. Pipetez doucement 10 fois pour homogénéiser.
11. Laisser incuber pendant 2 min à température ambiante.
12. Placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 17,5 μL de surnageant dans un nouveau tube.

11. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; 3 l’adénylate ' se termine

1. Ajouter 12,5 μL d’A-tailing mix sur le nouveau tube et mélanger soigneusement par pipetage doucement et descendre de 10 fois. Placer le tube sur un thermocycleur et incuber selon le programme suivant : 37 ° C pendant 30 min, 70 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C

12. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Ligaturer les adaptateurs

1. Ajouter 2,5 μL de resuspension tampon, 2,5 μl du mélange de ligation et 2,5 μL de l’indice d’adaptateur RNA approprié. Mélanger soigneusement par pipetage doucement et descendre de 10 fois.
2. Incuber sur un thermocycleur pendant 10 min à 30 °.
3. Ajouter 5 μL de tampon de butée ligature et mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois.
4. Vortex magnétique perles et ajouter 42,5 μL à l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
5. Placer le tube dans le support magnétique et d’attendre les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair
6. Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
7. Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
8. Maintenir le tube sur le support magnétique et, l’échantillon a laissé sécher à l’air pendant 15 min.
9. Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 52,5 μL de tampon de resuspension. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 2 min, placer le tube dans le support magnétique et attendre pour les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 50 μL de surnageant clair dans un nouveau tube.
Perles de
10. vortex magnétique et ajouter 50 μl de l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
11. Placer le tube dans le support magnétique et d’attendre les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair.
12. Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
13. Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
14. Maintenir le tube sur le support magnétique et laissez l’air échantillon sécher pendant 15 min.
15. Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 27,5 μL de tampon de resuspension. Mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois.
16. Incuber à température ambiante pendant 2 min, placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 25 μL de surnageant clair dans un nouveau tube.

13. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Amplification de Fragments d’ADN

1. Place 12,5 µL du modèle dans un PCR de 0,2 mL de tube. Ajouter 2,5 μL d’amorce PCR cocktail, 10 μL de mélange PCR améliorée. Mix soigneusement en pipettant également monter et descendre de 10 fois. Placer le tube sur un thermocycleur et utiliser les conditions décrites dans le tableau 4.
2. Vortex magnétique perles et ajouter 25 μL de l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
3. Placer le tube dans le support magnétique, attendez que les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair.
4. Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH. Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
5. Garder le tube sur le support magnétique et, laissez l’air de l’échantillon sec pendant 15 min. Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 32,5 μL de tampon de resuspension. Mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois.
Incuber les
6. la PCR/plaque tubulaire pendant 2 min à température ambiante. Placer la tube/plaque PCR sur le support magnétique à température ambiante, attendez que les perles s’installer sur le côté du tube et transférer 30 μL de surnageant dans un nouveau tube.

14. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Validation de la bibliothèque

Remarque : la validation de la bibliothèque est effectuée à l’aide d’un système de contrôle de la qualité d’ADN et ARN. Préparation de l’échelle : aliquote 1 µL d’échelle d’ADN génomique dans le premier tube/puits et ajouter 3 µL de tampon de.

1. Préparation de l’échantillon : mélanger 1 µL de l’échantillon de la bibliothèque (10 à 100 ng/µL) avec 3 µL de tampon d’échantillon dans un tube. Rotation vers le bas, puis vortex sur la vitesse maximale pour 5 s. vitesse de rotation vers le bas pour positionner l’échantillon au fond du tube.
2. Charger les échantillons dans le système de contrôle de la qualité.
3. Une fois que la série est terminée, analyser les résultats en définissant le contraste à la valeur maximale pour s’assurer qu’aucun dimères d’amorce ne sont présents dans l’échantillon ( Figure 5) ; dimères d’amorce doivent correspondre à une bande d’environ 135 bp. S’il présente encore une faible bande, procéder à un deuxième nettoyage en ajoutant le tampon d’élution (voir la Table des matières) jusqu'à un volume de 50 µL et ajouter 47,5 µL de billes magnétiques mixtes. Si la concentration de l’échantillon est trop faible (< 2 nM), continuez à exécuter le PCR (étape 13,1), à l’aide de 18 cycles au lieu de 15, avec le volume de 12,5 µL de l’échantillon à gauche de l’étape 12.16.
4. Quantifier les bibliothèques individuellement en utilisant des kits disponibles dans le commerce de qPCR.
   NOTE : Piscines de bibliothèques peuvent être séquencés à l’aide d’un séquenceur avec un simple lecture du protocole de nt 1 x 50 visant à 30 M lectures/échantillon.

Résultats

Pour illustrer la performance de notre protocole de puce, nous avons effectué des ChIP-seq expériences utilisant des sections SNT mise en commun des embryons de poulet CM19, maxillaires proéminences de HH22 poulet embryons et les embryons de poulet stade-HH3 pour enquêter sur les profils de liaison de modifications d’histone différents (c.-à-d., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 et H3K27me3). Une fois la puce ADN ont été obtenues, l’efficacité de la sonication a été évalu...

Discussion

Épigénomique profilage de modification d’histone à l’aide de ChIP-seq peut être utilisé pour améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes de vertébrés dans différents contextes cellulaire^4,5,18. Ces profils épigénomique peuvent être utilisés, entre autres, d’identifier les éléments d’enhancer, pour définir l’État réglementaire des activateurs (c'est-à-dire actif, apprêtée, ou sur le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100-1000µl Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2-20µl Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2-200µl Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5-10µl Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10ml)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997