Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Резюме

Здесь мы описываем иммунопреципитации chromatin (обломока) и чип seq библиотека подготовки протокола для создания глобального epigenomic профили из эмбриональных образцов куриного низким изобилие.

Аннотация

Иммунопреципитации Chromatin (обломока) — это метод широко используется для сопоставления локализации post-translationally модифицированных гистонов, гистонов варианты, факторов транскрипции или chromatin изменения ферментов в данном локусе или геном масштабе. Сочетание чип анализов с следующего поколения последовательности (то есть чип-Seq) представляет собой мощный подход глобально раскрыть генных сетей регулирования и улучшения функционального Аннотация геномов, особенно некодирующих последовательностей регулирования. Протоколы обломока обычно требуют большого количества клеточным материалом, исключая, таким образом, применимость данного метода расследованию типы редких клеток или биопсии малых тканей. Для того, чтобы сделать пробирного чип совместим с количество биологического материала, которые обычно могут быть получены в естественных условиях в раннем эмбриогенезе позвоночных, опишем здесь упрощенный протокол чип, в котором количество шагов, необходимых для завершения пробы были сокращены свести к минимуму потери образца. Этот чип протокол успешно использовался для изучения различных гистона изменения в различных эмбриональные куриные и тканей взрослой мыши с помощью низкого числа средних клеток (5 х 10⁴ - 5 x 10⁵ клеток). Важно отметить, что этот протокол совместим с чип seq технологии с использованием методов подготовки стандартной библиотеки, обеспечивая тем самым глобальное epigenomic карты в весьма актуальным эмбриональных тканей.

Введение

Столб-поступательные изменения гистона непосредственно участвуют в различных хроматина зависимых процессов, включая транскрипции и репликации ДНК ремонт^1,2,3. Кроме того, различные гистона изменения показывают положительные (например, H3K4me3 и H3K27ac) или отрицательным (например, H3K9me3 и H3K27me3) корреляции с экспрессии генов и может быть широко определены как активация или репрессивных гистона метки, соответственно^2,3. Следовательно глобальные гистона модификации карты, также упоминается как epigenomic карты, превратились в мощные и универсальные инструменты функционально аннотировать позвоночных геномов^4,5. Например, дистальная регулирования последовательности такие как усилители могут быть определены основаны на наличие конкретных хроматина подписи (например, Активные расширители: H3K4me1 и H3K27ac), которые отличают их от проксимальных промоутер регионов (например, активных промоутеров: H3K4me3)^6,,78. С другой стороны гены с крупных клеток личность регулирующих функций обычно встречаются с широким хроматина доменов, отмеченные H3K4me3 или H3K27me3, в зависимости от транскрипционно активным или неактивным статус основных генов, соответственно^{9 ,10}. Аналогично выражение основных клеток идентификации генов кажется, часто контролироваться многочисленными и пространственно кластерного усилители (т.е., супер-усилители), которые могут быть определены как широкий H3K27ac-отмечен доменов¹¹.

В настоящее время изменения гистона карты создаются с помощью чип seq технологию, которая по сравнению с предыдущих подходов, таких как чип микросхема (чип в сочетании с microarrays) обеспечивает более высокое разрешение, меньше артефактов, меньше шума, большего охвата и нижнего ¹²расходы. Тем не менее поколение epigenomic карт с помощью технологии ChIP-seq имеет свои присущие ограничения, главным образом связанные с успешно выполнять чип в образцах, представляющих интерес. Традиционные протоколы обломока обычно требуются миллионы клеток, который предел применимости этого метода в пробирке клеток линии или клетки, которые могут быть легко изолированных в естественных условиях (например, клетки крови). В последние несколько лет количество измененных протоколы обломока, совместимый с низкой сотовый номера были описаны^13,14,,1516. Однако эти протоколы специально разработаны, чтобы быть в сочетании с следующего поколения последовательности (то есть чип seq), и они обычно используется Специальная библиотека подготовка методы^{13,14, 15 , 16}.

Здесь, мы описали чип протокол, который может использоваться для расследования гистона модификации профилей с помощью числа низкой для промежуточных клеток (5 х 10⁴ - 5 x 10⁵ клеток) либо отдельных локусах (т.е., чип ПЦР) или глобально (т.е. Чип seq) (рис. 1). При сочетании технологию чип seq, наш чип протокол может использоваться вместе с методами подготовки стандартной библиотеки, таким образом делая его широко доступными для многих лаборатории¹⁰. Этот протокол был использован для изучения нескольких меток гистона (например, H3K4me3, H3K27me3 и H3K27ac) в различных курица эмбриональных тканях (например, спинного нервной трубки (СНТ), лобно протуберанцы и Эпибласт). Однако мы ожидаем, что он должен быть широко применим для других организмов, в которых биологически или клинически соответствующие образцы можно только получить в малых количествах.

протокол

согласно директивам немецкий ухода за животными, не институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) одобрение было необходимо для выполнения экспериментов куриного эмбриона. По данным местных руководящих принципов только эксперименты с куриных эмбрионах (18 день) в HH44 и старше требуют утверждения IACUC. Однако, эмбрионы, используемые в данном исследовании были все в более ранних стадий эмбрионального развития (т.е., HH19 (72 ч.)).

Примечание: целью настоящего Протокола является предоставить подробное описание пробирного чип, так что он может эффективно сочетаться с ПЦР или секвенирование нового поколения (т.е., чип seq) расследовать изменения гистона в низкий изобилие эмбриональных образцов (начиная с 5 x 10-⁴-5 x 10 ⁵ клетки для каждого чипа реакции) и типы различных тканей ( рис. 1). Протокол должен быть применим к расследованию профили связывания транскрипционных факторов и Сопредседатель возбудителей (например, p300). Однако, из-за более низких обилие этих регуляторных белков, большего числа клеток, вероятно, требуется (5 x 10 ⁵ - 5 х 10 ⁶ клеток для каждой реакции чип).

1. Подготовка яйца и Microdissection курица СНТ

Примечание: процедура microdissections технически отличается от ткани ткани и модели на животных в животной модели. В этом разделе описывается подробно рассечение протокол используется для получения плечевая СНТ секций от стадии HH19 куриных эмбрионах в качестве примера.

1. Инкубировать плодородные белый леггорн куриные яйца, полученные от местного заводчика, в горизонтальной ориентации при 37 ° C и 80% влажности для 3 дней, чтобы получить этап HH19 куриных эмбрионах.
2. Определить этапы согласно гамбургер и Гамильтон курица эмбрионального развития промежуточной системы ¹⁷.
3. Выполняют все microdissections в холодных условиях; в противном случае, может быть нарушена целостность хроматина.
4. Изолировать эмбрионов HH19.
   1. Чтобы сделать доступным эмбрионы, экстракт 3 мл альбумина с помощью 10-мл шприца с иглой (0,90 x 40 мм) для снижения бластодермы.
   2. Сделать небольшое отверстие в яйцо, с помощью тонкой ножницы и добавить 1 мл раствора Локк (см. Дополнительные материалы для рецепта) для облегчения удаления экстра зародышевых оболочек.
   3. Придать 10% индийских черные чернила/Локка раствор с помощью 1 мл шприц с иглой (² 0.55 x 25 мм) под бластодермы для облегчения визуализации эмбрионов.
   4. Отрезать экстра эмбриональных мембраны, которая окружает эмбриона, используя медицинские Ножницы хирургические штраф и пинцет.
   5. Для передачи эмбриона на 4,5 см Петри, содержащий 20 мл 1 x PBS решения используйте перфорированной ложкой.
5. Вскрыть прочь, амнион и оставшиеся части экстра эмбриональных мембраны, с помощью тонкой ножниц и щипцы под стереомикроскопом.
6. Вырезать поперечной СНТ сегмент на уровне плечевого эмбриона, расширяя каудально в область грудной клетки изолировать СНТ ( рис. 2).
7. Удаление тканей, которые окружают боково/вентрально СНТ (например, боковой пластине мезодермы, эктодермы, Хорда и аорты) с помощью щипцов ( рис. 2).
8. Погружать каждого цыпленка Анатомированное СНТ сегмента в 3,5 см Петри, содержащий 5 мл теплой (37 ° C) трипсина (трипсина/ЭДТА раствор 1: 250).
9. Остановить лечение трипсина, когда отпускать не нервных тканей вокруг СНТ обнаружено под стереомикроскопом.
   Примечание: Время trypsinization должны жестко контролироваться во избежание чрезмерной пищеварение и дисперсия нервной ткани и сохранить структурную целостность СНТ.
10. После лечения трипсина, удалите оставшиеся мезенхимальных и эктодермы ткани вручную подготовить чистый участок СНТ.
11. Секция СНТ передачи в 1,5 мл трубку и флэш замораживания ее в жидком азоте. После достаточного СНТ секции накопленные (бассейн СНТ разделы от ~ 30 куриных эмбрионах один чип реакции), хранить на -80 ° C.
    Примечание: Если достаточно эмбриональных тканей (т.е. 5 x 10 ⁵-5 х 10 ⁶ клеток) могут быть расчленены от одного или несколько куриных эмбрионах, затем замораживания не является необходимым и можно приступить непосредственно к выполнению следующих шагов. Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1.
    Примечание: осторожно! Жидкий азот имеет крайне низкие температуры, носить соответствующую защиту.

2. Сшивки белки ДНК: 1 день

Примечание: выполнить все шаги на льду, если не указано иное.

1. Добавить 500 мкл DMEM с 10% FBS и 10 мкл 1 M Na бутират непосредственно на замороженные ткани или, альтернативно, сразу к свежей Иссеченную ткань. Однородный клетки приостановив нежно заново с 1 мл пипетки.
   Примечание: Добавление Na бутират необязательно, но рекомендуется если расследование ацетилирование гистонов. Вместо того чтобы FBS DMEM - 10% образцы можно высокомобильна в однократном ПБС с 0.1% BSA. Добавление FBS или BSA является необязательным, но оно облегчает гранулирование образцы в последующих центрифугирования шаги.
2. 13,5 мкл 37% формальдегида (1% формальдегида финал) и поместите его на вращателе 15 мин при комнатной температуре.
   Примечание: осторожно! Формальдегид токсичных.
3. 25 мкл 2,5 метров глицина к трубе и поместите его на ротатор за 10 мин при комнатной температуре, чтобы утолить формальдегида.
4. Спина трубки на 850 x g 5 мин при 4 ° C в центрифуге столешницы. Отбросить супернатант.
5. Помыть лепешка однажды с 500 мкл холодной свежеприготовленные мыть буфера (см. Дополнительные материалы для рецепт), центрифуги на 850 x g и 4 ° C за 5 мин и отбросить супернатант.

3. Лизис и Sonication

1. подготовить полный лизис буфера (LB) (см. Дополнительные материалы для рецепт) и холод на льду. По 1 мл, используйте 950 мкл LB, 40 мкл концентрированного препарата ингибитор протеазы (25 x) и 10 µL 100% PMSF.
2. Ресуспензируйте гранулы в 300 мкл полного LB, закупорить и поместите его на качающейся платформе для 10 мин на 4 ° C.
3. Sonicate образцы, используя следующие параметры: Temp = 4 ° C, общее время = 7 минут, “ на ” интервал = 30 s, “ у ” интервал = 30 с, амплитуда = 25%
   Примечание: Sonication условия должны быть оптимизированы для каждой ткани и будет меняться в зависимости от используемых sonicator. Рекомендуется использовать низкие параметры sonication, которые приводят к стриженый ДНК, начиная от 200 до 600 bp в размер. Стрижка варьируется в зависимости от типа ткани, quantiты, sonication объем, сшивки условия и оборудование. Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1.
4. Спина sonicated образца на 16000 x g 10 мин при 4 ° C для пеллет сотовой мусора.
5. Передать свежие 1,5 мл lysate (супернатант).
   Примечание: Если исходный материал считается достаточным для двух экспериментов чип, затем 300 мкл полного LB могут быть добавлены к sonicated хроматина (то есть, окончательный объем: 600 мкл).
6. Добавить 30 мкл 10% octylphenol ethoxylate за каждые 300 мкл sonicated lysate (конечная концентрация: 1%) и перемешать, закупорить.
   Примечание: осторожно! Octylphenol ethoxylate острой токсичностью (устный, кожных, ингаляции).

4. Антитело инкубации

1. Алиготе 330 мкл sonicated lysate в две 1,5 мл трубы: 300 мкл для чипа и 30 мкл как элемент управления вводом (10% от исходного материала). Магазин " 30 мкл пример управления ввода " в -20 ° с.
   Примечание: Если два чипа реакции выполняются из того же образца, а затем 660 мкл sonicated lysate могут быть распределены в три пробирки 1,5 мл (300 мкл чип #1, 300 мкл чип # 2 и 60 мкл как элемент управления вводом (20% от исходного материала каждого чипа) ).
2. Добавить 3-5 мкг антитела к 300 мкл sonicated хроматина аликвота и инвертировать смешивать.
   Примечание: В этом исследовании, каждый чип реакция была выполнена с антител специфических для tri гистонов H3 метилированию на К4 (H3K4me3), гистонов H3 ди метилированию на К4 (H3K4me2), гистонов H3 tri метилированию на поезд K27 (H3K27me3) и ацетилирование гистонов H3 tri на поезд K27 (H3K27me3). Успех этого протокола полностью зависит от качества используемых антитела. Антитело должны быть конкретными и эффективными в иммунопреципитации определенного белка. Важно определить количество антител, который может использоваться для immunoprecipitate высокоструктурированные протеин дна комплекс. Кроме того специфичность антитела могут проверяться иммуноблоттинга обеспечить, что он обнаруживает правильный белка. Антитело, который обнаруживает несколько неспецифических полос не рекомендуется для чипа.
3. Место трубки на качающейся платформе при 4 ° C на ночь (12-16 h) для связывания антител к хроматина.
   Примечание: Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1.

5. Подготовка магнитной бусины: день 2

1. аликвота 50 - 100 мкл белок G/магнитный шарик навоза для каждого чипа реакции в 1,5 мл отцентрифугировать трубки на ДВС.
2. Мыть магнитные шарики три раза с холодной блок решения (см. Дополнительные материалы для рецепта) (4 ° C). Добавьте 500 мкл холодного блока раствора и перемешивают, переворачивать или стряхивая. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Слить прозрачная жидкость и повторить. После последнего вымыть, удалить все жидкие с кончиком гель загрузки.

6. Иммунопреципитации Chromatin

1. 300 мкл антител прыгните хроматина промывают бисером и инвертировать смешивать.
2. Повернуть вертикально на вращателе трубки на 4 ° C для по крайней мере 4 h для связывания антител к бисеру.

7. Вымойте, элюировать и обратить вспять сшивки

1. Chill Буфер RIPA мыть (см. Дополнительные материалы для рецепта) на льду, установить водяной бане до 65 ° C и precool центрифугирования до 4 ° C.
2. Мыть хроматина прыгните бусины четыре раза в 1 мл холодную РИПА мыть буфера и держать на льду. Чтобы сделать это, добавьте 1 mL холодной Буфер RIPA мыть и микс переворачивать или стряхивая. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Слить прозрачная жидкость и повторите.
   Примечание: Количество моек с мыть Буфер RIPA может потребоваться быть оптимизированы в зависимости от типа образца, обилие образцов и антитела используются. Увеличение количества стирок будет уменьшаться фон но также уменьшение общее количество восстановленных ДНК, которая может поставить под угрозу течению анализ ПЦР или чип след
3. Добавить 1 мл TE/50 мм NaCl в трубку и передать свежие отцентрифугировать 1,5 мл трубки хроматина прыгните бусины в TE/50 мм NaCl перед удалением жидкости с помощью магнитного держателя, как описано выше.
4. Спина бусы на 900 g x 3 мин при температуре 4 ° C, установите трубку обратно в магнитный держатель и удалить все оставшиеся TE с наконечником гель загрузки.
5. Добавить 210 мкл буфера (см. Дополнительные материалы для рецепт) при комнатной температуре и Ресуспензируйте, стряхивая.
6. Elute 15 мин при температуре 65 ° C в блоке тепла при встряхивании.
7. Спина бусы на 16000 x г за 1 мин при комнатной температуре и положите трубку в магнитный держатель.
8. Передать свежие отцентрифугировать трубки супернатант (~ 200 мкл), после того как бусы поселились.
9. Оттепель входные контрольные образцы (30 мкл) от-20 ° C до комнатной температуры (замороженная в шаге 4.1), добавить 3 тома Элюирующий буфер (90 мкл) и перемешать кратко vortexing.
10. Проинкубируйте образцы чип и контроля при 65 ° C ночь (12-16 ч) в обратном сшивки.

8. Дайджест клеточных белков и РНК: день 3

1. 8.1At комнатной температуре, добавить 1 объем буфера TE в трубку (для разбавления ИКБ) и инвертировать смешать: 120 мкл TE 120 мкл пример элемента управления и 200 мкл TE до 200 мкл пример чип.
2. Добавить РНКазы A до конечной концентрации 0,2 мг/мл и инвертировать смешать: 2.4 мкл 20 мг/мл РНКазы A до 240 мкл пример элемента управления и 4 мкл 20 мг/мл РНКазы A до 400 мкл пример чип.
3. Инкубировать трубы при 37 ° C на водяной бане 2 h переваривать РНК.
4. Добавить протеиназы K до конечной концентрации 0,2 мг/мл и инвертировать смешать: 2.4 мкл 20 mg/ml протеиназы K до 240 мкл пример элемента управления и 4 мкл 20 mg/ml протеиназы K до 400 мкл пример чип.
5. Инкубировать в 55 ° C на водяной бане 2 h переварить белок и очищают ДНК.

9. Чип ПЦР

Примечание: выполнять экстракции ДНК и очистки, как описано в Дополнительных материалах.

Примечание: Проверка эффективности sonication, как описано в Дополнительные материалы, чтобы подтвердить, что фрагменты ДНК 200-500-ВР получаются ( рис. 3).

Примечание: критический шаг заключается в определении, если чип на самом деле работали. Если известны геномные привязки сайтов для протеина интереса, грунты могут разрабатываться для количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения, если известные сайты специально обогащены в чип ДНК, по сравнению с отрицательным управления регионами не ожидается, что обязательность КандиДата белков. Например, эта работа показывает чип ПЦР результаты, полученные с чипами для H3K4me3 (активный пропагандист гистона Марк) и H3K27me3 (неактивные промоутер гистона Марк) в разделах СНТ, изолированных от HH14 куриных эмбрионов ( Рисунок 4A ).

1. Mix каждой пары праймера (вперед и назад) в том же трубку и подготовить запасов концентрация на 20 мкм каждый с использованием dH ₂ O (Таблица 2).
   Примечание: перед чип ПЦР анализа следует оценивать эффективность каждой пары праймера.
2. Использовать чип и 20% управления вводом ДНК, полученный на шаге 8.5 для оптимизации ПЦР.
   Примечание: Вход ДНК, обычно разбавляют 20 x (до 1% от исходного материала, используемых в реакциях чип) для анализа ПЦР.
3. Для каждого 10 мкл PCR, смесь следующие компоненты в ПЦР-пробирку: для ДНК mastermix, добавить 2 мкл dH2O, 2,5 мкл SYBR Зеленый микс и 1 мкл ДНК (от чип или ввода 1%); для mastermix с праймерами , 2,375 мкл dH2O, 2,5 мкл SYBR Зеленый микс и 0,125 мкл смеси прямого и обратного грунтовка.
4. Смешать образцы по vortexing для 2 s и кратко центрифуги на 900 x g за 1 мин
5. Выполнять ПЦР в реальном времени (пример грунтовки и Велоспорт условий, здесь можно найти в таблице 2 и таблице 3, соответственно).
   Примечание: Чип ПЦР анализ данных: чип сигналы рассчитываются как процент ввода. Вкратце, однажды Ct значения получаются для каждой реакции ПЦР, коэффициент разбавления 100 или 6.644 циклов (log2 100) применяется к Ct значения, полученные для ввода ДНК реакций. Затем, для данного региона интереса (то есть, грунтовка пара), чип сигналы рассчитываются следующим:
   скорректированы ввода = Ct (вход) - 6.644
   чип сигнала = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. чип seq библиотеки подготовка; Окончания ремонта: День 4

1. разбавлять до 100 нг чип-ДНК в 60 мкл буфера (см. материалы в таблице).
2. Добавить 40 мкл окончания ремонта микс и Пипетка нежно 10 раз.
3. Инкубировать на 30 ° C в течение 30 мин на тепловой cycler.
4. Вихревые магнитные бусы и добавить 160 мкл трубка, содержащая конце ремонта микс. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
5. Установите трубку в магнитный держатель и ждать бусины поселиться на стороне трубки...
6. Слейте прозрачная жидкость.
7. При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
8. Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз..
9. Держите трубку для 15 мин на магнитный держатель при комнатной температуре. После того, как гранулы сухого, снять трубку с магнитным держателем.
10. Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл буфера ресуспендирования. Аккуратно Пипетка 10 раз перемешать тщательно.
11. Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
12. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передать новой трубки 17,5 мкл супернатант.

11. Чип seq библиотеки подготовка; Adenylate 3 ' заканчивается

1. мкл добавить 12,5 A-хвостохранилища смеси к новой трубки и перемешать тщательно, нежно закупорить вверх и вниз по 10 раз. Трубку на тепловая велосипедист и инкубировать по следующей программе: 37 ° C за 30 мин., 70 ° C за 5 мин и удерживайте на 4 ° C

12. Чип seq библиотеки подготовка; Перевязать адаптеры

1. Добавить 2,5 мкл ресуспендирования буфера, 2.5 мкл лигирование смеси и 2,5 мкл соответствующего индекса адаптера РНК. Смесь тщательно, нежно закупорить вверх и вниз по 10 раз.
2. Инкубировать на тепловой cycler для 10 мин при 30 ° с.
3. Добавить 5 мкл стоп лигирование буфера и микс от тщательно закупорить 10 раз.
4. Вихревые магнитные бусы и добавить 42,5 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
5. Поместите трубку в магнитный держатель и ждать бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость
6. При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
7. Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
8. Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец просушите на 15 мин.
9. Снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 52,5 мкл буфера ресуспендирования. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин, положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передача 50 мкл ясно супернатант к новой пробке.
10. Вихревые магнитные бусы и добавьте 50 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
11. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость.
12. При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
13. Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
14. Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец воздух сухой в течение 15 мин.
15. Снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 27,5 мкл буфера ресуспендирования. Смесь тщательно по 10 раз для пипетирования.
16. Инкубировать при комнатной температуре на 2 мин, положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передать новой трубки 25 мкл ясно супернатант.

13. Чип seq библиотеки подготовка; Амплификация фрагментов ДНК

трубка

1. место 12,5 мкл шаблона в 0.2 мл ПЦР. Добавьте 2,5 мкл PCR праймер коктейль, 10 мкл расширенной ПЦР mix. смесь тщательно закупорить вверх и вниз по 10 раз. Установите трубку на тепловая велосипедист и использовать условия, описанные в таблице 4.
2. Вихревые магнитные бусы и добавить 25 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
3. Положите трубку в магнитный держатель, подождите бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость,.
4. При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH. Инкубации при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
5. Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец воздуха сухая на 15 мин снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 32,5 мкл буфера ресуспендирования. Смесь тщательно по 10 раз для пипетирования.
Инкубировать
6. ПЦР трубка/плита на 2 мин при комнатной температуре. Трубка/пластину ПЦР на магнитные стоять при комнатной температуре, ждать бусины поселиться на стороне трубки и передать новой трубки 30 мкл супернатант.

14. Чип seq библиотеки подготовка; Библиотека проверки

Примечание: Проверка библиотеки выполняется с помощью системы контроля качества ДНК и РНК. Подготовка по лестнице: аликвота 1 мкл геномной ДНК лестницы в первом трубка/Ну и 3 мкл пример буфера.

1. Подготовка образца: Смешайте 1 мкл пример библиотеки (10-100 нг/мкл) с 3 мкл пример буфера в трубку. Спин вниз, а затем вихря на максимальной скорости для 5 s. спин вниз положение образца в нижней части трубки.
2. Загрузить образцы в системе управления качеством.
3. После запуска, анализировать результаты, установив контраст максимальное значение, чтобы убедиться, не Димеры праймера присутствуют в образце ( рис. 5); Димеры праймера должно соответствовать на диапазон около 135 bp. Если присутствует даже слабые группы, перейти к второй очистки путем добавления Элюирующий буфер (см. Таблицу материалы) до 50 мкл тома и 47.5 мкл смешанных магнитной бусины. Если концентрация образца является слишком низким (< 2 Нм), перейдите к запустите ПЦР (шаг 13.1), используя 18 циклов вместо 15, с объемом 12,5 мкл пример слева от шага 12.16.
4. Количественно библиотек индивидуально по ПЦР, используя имеющиеся наборы.
   Примечание: Бассейны библиотеки можно упорядочивать с помощью программы sequencer с одного чтения 1 x 50 nt протокол, направленный на 30 М читает/образца.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать производительность нашей чип протокола, мы провели эксперименты с использованием пула СНТ разделы из HH19 куриных эмбрионах, верхнечелюстной протуберанцев HH22 куриные эмбрионы и этап HH3 куриных эмбрионах расследовать привязки профили чип seq раз...

Обсуждение

Epigenomic профилирования гистона модификации с помощью чип seq могут использоваться для улучшения функциональной заметки позвоночных геномов различных клеточных контекстах^4,5,18. Эти профили epigenomic может использоваться, среди прочего, для в?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH 8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1 Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100 - 1,000 µL Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2 - 20 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2 - 200 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10 mL)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997