Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Riepilogo

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell'istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l'annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l'applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l'analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l'embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ cellule). D'importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.

Introduzione

Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione^1,2,3. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell'istone segna, rispettivamente di^2,3. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell'istone, noto anche come epigenomic mappe, sono emersi come strumenti potenti e universali per annotare funzionalmente i genomi di vertebrati^4,5. Ad esempio, sequenze regolatrici distale come rinforzatori possono essere identificati in base la presenza di firme di cromatina specifici (ad es., esaltatori di attivo: H3K4me1 e H3K27ac), che li distinguono dalle regioni promotore prossimale (per esempio, promotori attivi: H3K4me3)^6,7,8. D'altra parte, i geni con funzioni di regolamentazione di identità delle cellule principali si trovano tipicamente con domini di cromatina ampio contrassegnati con H3K4me3 o H3K27me3, a seconda dello stato trascrizionalmente attivo o inattivo dei geni sottostanti, rispettivamente^{9 ,10}. Allo stesso modo, l'espressione di geni di identità delle cellule principali sembra essere controllato frequentemente dal multiplo e spazialmente cluster rinforzatori (cioè, Super-rinforzatori), che possono essere identificati come vasto H3K27ac-contrassegnato domini¹¹.

Attualmente, istone modifica mappe vengono generate utilizzando la tecnologia ChIP-seq, che rispetto alle precedenti approcci come ChIP-chip (ChIP accoppiato ai microarray) fornisce maggiore risoluzione, meno artefatti, meno rumore, copertura superiore e inferiore Costa¹². Tuttavia, la generazione di mappe di epigenomic utilizzando la tecnologia ChIP-seq ha i suoi limiti intrinseci, principalmente connesse con la capacità di eseguire correttamente il ChIP nei campioni di interesse. Protocolli di ChIP tradizionali in genere necessari milioni di cellule, che limitano l'applicabilità di questo metodo al cellulare in vitro linee o cellule che può essere facilmente isolato in vivo (ad esempio, cellule del sangue). Negli ultimi anni, un numero di protocolli di ChIP modificate compatibile con numeri di cellulare bassa è stati descritti^13,14,15,16. Tuttavia, questi protocolli sono progettati specificamente per essere accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) e che in genere utilizzano hoc biblioteca preparazione metodi^{13,14, 15 , 16}.

Qui, abbiamo descritto un protocollo di ChIP che può essere utilizzato per analizzare i profili di modifica dell'istone utilizzando numeri di basso a intermedio delle cellule (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ cellule) sia selezionato loci (cioè, ChIP-qPCR) o a livello globale (cioè, ChIP-seq) (Figura 1). Quando accoppiato alla tecnologia ChIP-seq, il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato insieme ai metodi di preparazione della libreria standard, rendendo così largamente accessibile a molti laboratori¹⁰. Questo protocollo è stato utilizzato per indagare parecchi contrassegni istone (ad es., H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) in tessuti embrionali di pollo diversi (ad es., tubo neurale spinale (SNT), frontonasale protuberanze ed epiblasto). Tuttavia, possiamo anticipare che dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altri organismi in cui biologicamente e/o clinicamente rilevanti campioni possono essere ottenuti solo in basse quantità.

Protocollo

secondo linee guida tedesca di cura degli animali, approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) non era necessario per eseguire gli esperimenti di embrione di pollo. Secondo le linee guida locali, solo esperimenti con embrioni di pollo HH44 (18 giorni) e più anziani richiedono approvazione IACUC. Tuttavia, gli embrioni utilizzati in questo studio erano tutti nelle prime fasi dello sviluppo embrionale (cioè, HH19 (72 h)).

Nota: lo scopo del presente protocollo è quello di fornire una descrizione dettagliata del test ChIP, quindi può essere efficacemente combinato con qPCR o sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) per studiare le modificazioni istoniche basso-abbondanza embrionali campioni (che vanno da 5 x 10 ⁴-5 x 10 ⁵ celle per ogni reazione di ChIP) e diversi tipi di tessuto ( Figura 1). Il protocollo dovrebbe essere applicabile ad investigare i profili di associazione di fattori di trascrizione e co-attivatori (ad es., p300). Tuttavia, a causa dell'abbondanza bassa di queste proteine regolatorie, grandi numeri di cell rischiano di essere richiesto (5 x 10 ⁵ - 5 x 10 ⁶ cellule per ogni reazione di ChIP).

1. preparazione di uova e Microdissection del pollo SNT

Nota: la procedura per microdissections tecnicamente varia da tessuto a tessuto e dal modello animale al modello animale. Questa sezione descrive in dettaglio il protocollo di dissezione utilizzato per ottenere brachiale SNT sezioni da fase-HH19 embrioni di pollo ad esempio.

1. Incubare le uova di gallina livornese bianco fertile, ottenute da un allevatore locale, in orientamento orizzontale a 37 ° C e 80% di umidità per 3 giorni per ottenere fase-HH19 embrioni di pollo.
2. Determinare le fasi secondo l'Hamburger e Hamilton pollo gestione temporanea dello sviluppo embrionale sistema ¹⁷.
3. Eseguire tutti i microdissections in condizioni di freddo; in caso contrario, potrebbe essere compromessa l'integrità della cromatina.
4. Isolare gli embrioni HH19.
   1. Per rendere accessibili gli embrioni, estrarre 3 mL di albumina usando una siringa da 10 mL con un ago (0,90 x 40 mm) per abbassare il blastoderm.
   2. Fare una piccola apertura nell'uovo utilizzando forbici bene e aggiungere 1 mL di soluzione di Locke (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) per facilitare la rimozione delle membrane extra-embrionali.
   3. Iniettare 10% indiano nero inchiostro/Locke soluzione utilizzando una siringa da 1 mL con ago (0,55 x 25 mm ²) sotto il blastoderm per rendere più facile la visualizzazione degli embrioni.
   4. Tagliare la membrana extra-embrionale che circonda l'embrione utilizzando forbice chirurgica medica e forcipe.
   5. Utilizzare un mestolo forato per trasferire l'embrione di Petri contenente 20 mL di soluzione di PBS 1X di 4,5 cm.
5. Distanza sezionare l'amnios e le restanti parti della membrana extra-embrionale utilizzando bene forbici e pinze sotto un microscopio stereoscopico.
6. Tagliare il segmento SNT trasversa a livello brachiale dell'embrione, che si estende caudalmente nella regione toracica per isolare il SNT ( Figura 2).
7. Rimuovere i tessuti che circondano lateralmente/ventralmente il SNT (ad es., placca laterale mesoderma, ectoderma, notocorda e aorta) usando il forcipe ( Figura 2).
8. Immergere ogni segmento SNT pollo sezionato in una capsula di Petri contenente 5 mL di tripsina tiepida (37 ° C) (tripsina/EDTA soluzione 1: 250) di 3,5 cm.
9. Interrompere il trattamento di tripsina quando allentamento dei tessuti non neurali intorno la SNT viene rilevato sotto uno stereomicroscopio.
   Nota: Il tempo di trypsinization deve essere strettamente controllato per evitare il sovra-digestione e dispersione del tessuto neurale e per mantenere l'integrità strutturale della SNT.
10. Dopo il trattamento di tripsina, rimuovere i rimanenti tessuti mesenchimali ed ectodermici manualmente per preparare la parte pulita di SNT.
11. Trasferire la sezione SNT una provetta da 1,5 mL e flash-congelamento in azoto liquido. Una volta sufficiente SNT sezioni sono accumulato (piscina la SNT sezioni da ~ 30 embrioni di pollo per una reazione di ChIP), conservare a -80 ° C.
    Nota: Se sufficiente tessuto embrionale (cioè, 5 x 10 ⁵-5 x 10 ⁶ cellule) può essere sezionata da un singolo o pochi embrioni di pollo, poi congelamento non è necessaria ed è possibile procedere direttamente alla procedura successiva. Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1.
    Nota: attenzione! Azoto liquido ha una temperatura estremamente bassa, indossare una protezione appropriata.

2. Reticolazione proteine a DNA: giorno 1

Nota: eseguire tutti i passaggi su ghiaccio, salvo diversa indicazione.

1. Aggiungere 500 µ l di DMEM con 10% FBS e 10 µ l di 1 M Na-butirrato direttamente al tessuto congelato o, in alternativa, immediatamente al tessuto appena dissecato. Omogeneizzare le cellule sospendendo ri-delicatamente con una pipetta da 1 mL.
   Nota: L'aggiunta di Na-butirrato è facoltativo, ma consigliato se indagando acetilazione dell'istone. Invece di DMEM - 10% FBS, i campioni possono essere risospesi in 1X PBS con 0,1% BSA. L'aggiunta di FBS o BSA è facoltativo, ma esso facilita i campioni nei passaggi successivi centrifugazione di cubettatura.
2. 13,5 µ l di formaldeide al 37% (1% formaldeide finale) e posizionarlo in un rotatore per 15 min a temperatura ambiente.
   Nota: attenzione! La formaldeide è tossica.
3. Aggiungere 25 µ l di 2,5 M glicina al tubo e collocarlo in un rotatore per 10 min a temperatura ambiente per placare la formaldeide.
4. Spin il tubo a 850 x g per 5 min a 4 ° C in una centrifuga di tavolo. Scartare il surnatante.
5. Lavare la pallina una volta con 500 µ l di fredda preparata wash buffer (Vedi i Materiali supplementari per la ricetta), centrifuga a 850 x g e a 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante.

3. Lisi e sonicazione

1. lisi completa preparazione buffer (LB) (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) e chill sul ghiaccio. Per 1 mL, utilizzare 950 µ l di LB, 40 µ l di concentrato dell'inibitore della proteasi (25x) e 10 µ l di 100% PMSF.
2. Risospendere il pellet in 300 µ l di LB completo pipettando e posto su una piattaforma a dondolo per 10 min a 4 ° C.
3. Trattare con ultrasuoni i campioni utilizzando le seguenti impostazioni: Temp = 4 ° C, tempo totale = 7 minuti, “ il ” intervallo = 30 s, “ i ” intervallo = 30 s, ampiezza = 25%
   Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per ogni tessuto e variano a seconda il sonicatore utilizzato. Si raccomanda di utilizzare le impostazioni di sonicazione più basse che si traducono in DNA tranciato da 200 a 600 bp in dimensione. Tosatura varia notevolmente a seconda del tipo di tessuto, quantiTy, volume di sonicazione, condizioni di reticolazione e attrezzature. Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1.
4. Spin il campione lisati mediante a 16.000 x g per 10 min a 4 ° C per appallottolare i detriti cellulari.
5. Trasferire il lisato (surnatante) in una nuova provetta da 1,5 mL.
   Nota: Se il materiale di partenza è considerato sufficiente per due esperimenti di ChIP, quindi 300 µ l di LB completo può essere aggiunto per la cromatina lisati mediante (cioè, volume finale: 600 µ l).
6. Aggiungere 30 µ l di 10% Ottilfenolo etossilato per ogni 300 µ l di sonicato lisato (concentrazione finale: 1%) e Miscelare pipettando.
   Nota: attenzione! Ottilfenolo etossilato è una tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione).

4. Incubazione dell'anticorpo

1. aliquota di 330 µ l di sonicato lisato in due provette da 1,5 mL: 300 µ l per ChIP e 30 µ l come il controllo di input (10% del materiale di partenza). Archivio la " 30 µ l di campione di controllo di input " a -20 ° C.
   Nota: Se due reazioni di ChIP vengono eseguite dallo stesso campione, allora il 660 µ l di sonicato lisato può essere distribuite in tre provette da 1,5 mL (300 µ l per ChIP n. 1, 300 µ l per ChIP #2 e 60 µ l come controllo di input (20% del materiale di partenza di ogni ChIP) ).
2. Aggiungere 3-5 µ g di anticorpo per il 300 µ l di lisati mediante cromatina aliquota e Inverti per mescolare.
   Nota: In questo studio, ogni reazione di ChIP è stato effettuato con un anticorpo specifico per tri dell'istone H3 metilato al K4 (H3K4me3), di istone H3 metilato al K4 (H3K4me2), tri dell'istone H3 metilato presso K27 (H3K27me3) e l'acetilazione dell'istone H3 tri presso K27 (H3K27me3). Il successo di questo protocollo è interamente dipendente dalla qualità dell'anticorpo utilizzato. L'anticorpo deve essere specifico ed efficiente presso l'immunoprecipitazione di una proteina specifica. È importante determinare la quantità di anticorpo che può essere utilizzato a immunoprecipitate il reticolato della proteina-DNA complesso. Inoltre, la specificità dell'anticorpo può essere controllata mediante Western blot per garantire che rileva una proteina corretta. Un anticorpo che rileva più bande non specifici non è raccomandato per ChIP.
3. Inserire il tubo su una piattaforma a dondolo a 4 ° C durante la notte (12-16 h) per legare l'anticorpo per la cromatina.
   Nota: Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1.

5. Preparazione di biglie magnetiche: giorno 2

1. Aliquot 50 - 100 µ l di proteina G/magnetico liquami perlina per ciascuna reazione di ChIP in un microfuge 1,5 mL tube sul ghiaccio.
2. Lavare i branelli magnetici tre volte con soluzione fredda blocco (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) (4 ° C). Aggiungere 500 µ l di soluzione di blocco freddo e mescolare capovolgendo o sfogliando. Mettere il tubo in un supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Versare il liquido chiaro e ripetere. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutto il liquido con una punta di gel-caricamento.

6. Immunoprecipitazione della cromatina

1. aggiungere il 300 µ l di cromatina legata all'anticorpo ai talloni lavati e invertire per mescolare.
2. Ruotare verticalmente in un rotatore tubo a 4 ° C per almeno 4 h per legare l'anticorpo ai talloni.

7. Lavare, eluire e invertire le reticolazioni

1. Chill RIPA tampone di lavaggio (Vedi i Materiali supplementari per la ricetta) sul ghiaccio, impostare il bagno di acqua a 65 ° C e preraffreddare la centrifuga a 4 ° C.
2. Lavare le perle di cromatina associato quattro volte in 1 mL di tampone di lavaggio freddo RIPA e tenere sul ghiaccio. A tale scopo, aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di RIPA freddo e mescolare capovolgendo o sfogliando. Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Versare il liquido chiaro e ripetere.
   Nota: Il numero di lavaggi con tampone di lavaggio di RIPA potrebbe essere necessario essere ottimizzato a seconda del tipo di campione, campione abbondanza e anticorpo utilizzato. Un aumento del numero di lavaggi sarà diminuire lo sfondo ma sarà anche diminuire la quantità totale di DNA recuperato, che può compromettere l'analisi a valle di qPCR o ChIP-seq.
3. Aggiungere 1 mL di TE/50 mM NaCl al tubo e trasferire le perline di cromatina associato a TE/50 mM NaCl in una provetta di fresco 1,5 mL microfuge prima di rimuovere il liquido utilizzando il supporto magnetico, come descritto in precedenza.
4. Spin le perline a 900 x g per 3 min a 4 ° C, inserire nuovamente il tubo del supporto magnetico e rimuovere tutte le restanti TE con una punta di gel-caricamento.
5. Aggiungere 210 µ l di tampone di eluizione (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) a temperatura ambiente e risospendere scorrendo.
6. Elute per 15 min a 65 ° C in un blocco di calore mentre agitando.
7. Spin le perline a 16.000 x g per 1 min a temperatura ambiente e inserire il tubo nel supporto magnetico.
8. Trasferire il surnatante (~ 200 µ l) in una provetta di microfuge fresco una volta che si sono insediati i branelli.
9. Scongelare i campioni di controllo di input (30 µ l) da-20 ° C a temperatura ambiente (congelato al punto 4.1), aggiungere 3 volumi di tampone di eluizione (90 µ l) e mescolare brevemente nel Vortex.
10. Incubare i campioni chip e controllo a 65 ° C durante la notte (12-16 h) per invertire le reticolazioni.

8. RNA e proteina cellulare digest: giorno 3

1. 8.1At temperatura ambiente, aggiungere 1 volume di buffer di TE per tubo (per diluire la SDS) e capovolgere per mescolare: aggiungere 120 µ l di TE a 120 µ l di campione di controllo e 200 µ l di TE a 200 µ l del campione ChIP.
2. Aggiungere RNasi A una concentrazione finale di 0,2 mg/mL e Inverti per mescolare: µ l 2,4 di 20 mg/mL RNasi A 240 µ l di campione di controllo e 4 µ l di 20 mg/mL RNasi A 400 µ l del campione ChIP.
3. Incubare le provette a 37 ° C in un bagno d'acqua per 2 h digerire il RNA.
4. Aggiungere proteinasi K a una concentrazione finale di 0,2 mg/mL e Inverti per mescolare: aggiungere 2,4 µ l di proteinasi K 20 mg/mL a 240 µ l di campione di controllo e 4 µ l di proteinasi K 20 mg/mL a 400 µ l del campione ChIP.
5. Incubare a 55 ° C a bagnomaria per 2 h per digerire le proteine e purificare il DNA.

9. ChIP-qPCR

Nota: eseguire DNA estrazione e purificazione, come descritto nei Materiali integrativi.

Nota: verificare l'efficienza di sonicazione come descritto nei Materiali supplementari, per confermare che i frammenti di DNA di 200-500 bp sono ottenuti ( Figura 3).

Nota: un passo fondamentale è quello di determinare se il ChIP è effettivamente lavorate. Se ci sono noti siti di genomica legame per la proteina di interesse, gli iniettori possono essere progettati per PCR quantitativa (qPCR) per determinare se i siti noti sono specificamente arricchiti nel DNA ChIP, rispetto alle regioni di controllo negativo non dovute essere vincolato il candiproteine di data. Ad esempio, questo lavoro Mostra i risultati di ChIP-qPCR ottenuti con chip eseguita per H3K4me3 (contrassegno dell'istone attivo promotore) e H3K27me3 (contrassegno dell'istone promotore inattivo) nelle sezioni SNT isolati da embrioni di pulcino HH14 ( Figura 4A ).

1. Mescolare ogni coppia di primer (avanti e indietro) nello stesso tubo e preparare una concentrazione stock a 20 µM a ogni utilizzo dH ₂ O (tabella 2).
   Nota: l'efficienza di ogni coppia di primer deve essere valutato prima analisi ChIP-qPCR.
2. Utilizzare il controllo di input ChIP e il 20% del DNA ottenuto nel passaggio 8,5 per ottimizzazione qPCR.
   Nota: Il DNA è in genere l'input diluito 20x (all'1% del materiale di partenza utilizzato nelle reazioni ChIP) per analisi qPCR.
3. Per ogni 10 µ l di PCR, miscelare i componenti seguenti in una provetta PCR: per DNA mastermix, aggiungere 2 µ l di dH2O, 2,5 µ l di miscela SYBR green e 1 µ l di DNA (da 1% ingresso o ChIP); per mastermix con primer , aggiungere 2,375 µ l di dH2O, 2,5 µ l di miscela SYBR green e 0.125 µ l di miscela primer forward e reverse.
4. Mescolare i campioni nel Vortex per 2 s e brevemente centrifuga a 900 x g per 1 min.
5. Eseguire PCR in tempo reale (un esempio di primers e ciclismo condizioni usate qui può essere trovato nella tabella 2 e tabella 3, rispettivamente).
   Nota: Analisi dei dati ChIP-qPCR: segnali di ChIP sono calcolati come percentuale dell'input. Brevemente, una volta per ogni reazione qPCR, un fattore di diluizione di 100 o 6.644 cicli vengono ottenuti i valori Ct (log2 100) viene applicato per i valori di Ct ottenuti per le reazioni di DNA inpue. Quindi, per una data regione di interesse (cioè, coppia di primer), i segnali di ChIP sono calcolati come segue:
   regolato ingresso = Ct (Input) - 6.644
   segnale di ChIP = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. chIP-seq libreria preparazione; Riparazione di fine: Giorno 4

1. diluire fino a 100 ng di DNA-ChIP in 60 µ l di tampone di eluizione (Vedi materiali tavolo).
2. Add 40 μL di fine mix di riparazione e pipettare delicatamente 10 volte.
3. Incubare a 30 ° C per 30 min in un termociclatore.
4. Vortice magnetico perline ed aggiungere 160 µ l nella provetta contenente il mix di riparazione di fine. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Posizionare il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline a stabilirsi sul lato del tubo...
6. Versare il liquido chiaro.
7. , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
8. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere una volta...
9. Tenere il tubo per 15 min sul supporto magnetico a temperatura ambiente. Una volta che la pallina è asciutta, rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
10. Risospendere il pellet in 20 μL di tampone di risospensione. Pipettare delicatamente 10 volte per mescolare.
11. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
12. Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 17,5 μL del surnatante in una nuova provetta.

11. ChIP-seq libreria preparazione; 3 dell'adenilato ' finisce

1. aggiungere 12.5 μL di miscela di A-tailing al nuovo tubo e mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù per 10 volte. Collocare la provetta su un termociclatore e incubare secondo il seguente programma: 37 ° C per 30 min, 70 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C

12. ChIP-seq libreria preparazione; Lega i adattatori

1. aggiungere 2,5 µ l di risospensione buffer, 2,5 µ l di miscela di legatura e 2,5 μL dell'indice di adattatore appropriato di RNA. Mix accuratamente pipettando delicatamente su e giù per 10 volte.
2. Incubare su un termociclatore per 10 min a 30 °.
3. Aggiungere 5 μL di buffer di legatura di fermata e mescolare accuratamente pipettando 10 volte.
4. Vortice magnetico perline e aggiungere 42,5 μL di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro
6. , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
7. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
8. Tenere il tubo sul supporto magnetico e, lasciate che il campione asciugare all'aria per 15 min.
9. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 52,5 μL di tampone di risospensione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 2 min, inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 50 μL del surnatante chiaro ad un nuovo tubo.
10. Vortice magnetico perline e aggiungere 50 µ l di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
11. Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro.
12. , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
13. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
14. Tenere il tubo su supporto magnetico e, lasciare che l'aria di campione a secco per 15 min.
15. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 27,5 μL di tampone di risospensione. Mix accuratamente pipettando 10 volte.
16. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti, inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 25 μL del surnatante chiaro ad un nuovo tubo.

13. ChIP-seq libreria preparazione; Amplificazione dei frammenti del DNA

1. posto 12,5 µ l del modello in un 0,2 mL PCR tubo. Aggiungere 2,5 µ l di primer PCR cocktail, 10 μL di avanzata PCR mix. Mix accuratamente pipettando su e giù per 10 volte. Collocare la provetta su un termociclatore e utilizzare le condizioni designate nella tabella 4.
2. Vortice magnetico perline e aggiungere 25 µ l di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Inserire il tubo nel supporto magnetico, attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro.
4. , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
5. Tenere il tubo sul supporto magnetico e, lasciate che il campione aria asciugare per 15 minuti rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 32,5 μL di tampone di risospensione. Mix accuratamente pipettando 10 volte.
6. Incubare la PCR tubo/piastra per 2 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo/piastra PCR sul cavalletto magnetica a temperatura ambiente, attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e trasferire 30 μL del surnatante in una nuova provetta.

14. ChIP-seq libreria preparazione; Convalida di biblioteca

Nota: la convalida della libreria viene eseguita utilizzando un sistema di controllo di qualità di DNA e RNA. Preparazione della scaletta: aliquota 1 µ l di genomic DNA Ladder nel primo tubo/bene e aggiungere 3 µ l di sample buffer.

1. Preparazione del campione: mescolare 1 µ l di campione biblioteca (10-100 ng / µ l) con 3 µ l di tampone del campione in una provetta. Lo spin down e poi vortice su velocità massima per 5 s. Spin giù per collocare l'esempio nella parte inferiore del tubo.
2. Caricare i campioni nel sistema di controllo di qualità.
3. Una volta che viene completata, l'esecuzione analizzare i risultati impostando il contrasto al valore massimo per assicurarsi che nessun dimeri sono presenti nel campione ( Figura 5); dimeri dell'iniettore dovrebbe corrispondere a una band intorno 135 bp. Se anche una debole banda è presente, procedere ad una seconda pulitura con l'aggiunta di tampone di eluizione (Vedi Materiali tavolo) fino a un volume di 50 µ l e µ l 47,5 dei branelli magnetici misti. Se la concentrazione del campione è troppo bassa (< 2 nM), procedere per eseguire la PCR (passo 13.1), utilizzando 18 cicli invece di 15, con il volume di 12.5-µ l di campione lasciato dal passaggio 12,16.
4. Quantificare singolarmente le librerie di qPCR usando i kit disponibili in commercio.
   Nota: Piscine di librerie possono essere sequenziate utilizzando un sequencer con una singolo-lettura del protocollo nt 1 x 50 mirando alle letture/campione di 30 M.

Risultati

Per illustrare le prestazioni del nostro protocollo di ChIP, abbiamo effettuato esperimenti utilizzando pool SNT sezioni da embrioni di pollo HH19, protuberanze maxillary della HH22 pollo embrioni ed embrioni di pollo di fase-HH3 per indagare i profili di associazione di ChIP-seq varie modifiche dell'istone (cioè, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Una volta che sono stati ottenuti ChIP "DNAS", l'efficienza di sonicazione è stata valutata tramite l'elettroforesi del gel del...

Discussione

Epigenomic profilatura di modifica dell'istone utilizzando ChIP-seq può essere utilizzato per migliorare l'annotazione funzionale dei genomi di vertebrati in diversi contesti cellulari^4,5,18. Questi profili di epigenomic possono essere utilizzati, tra le altre cose, per identificare gli elementi enhancer, per definire lo stato normativo di esaltatori di (cioè, attivo, innescato, o in bilico) e per definire regolatori ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH 8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1 Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100 - 1,000 µL Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2 - 20 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2 - 200 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10 mL)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997