Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Zusammenfassung

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Technik zur Kartierung der Lokalisierung von posttranslational modifizierte Histone, Histon-Varianten, Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-modifizierende Enzyme, die an einen bestimmten Ort oder auf einer genomweiten Skala. Die Kombination von ChIP-Assays mit Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz weltweit genregulatorischer Netzwerke aufzudecken und die funktionale Anmerkung von Genomen, insbesondere von nicht-kodierenden regulatorischen Sequenzen zu verbessern. ChIP-Protokolle erfordern normalerweise große Mengen von Zellmaterial, damit die Anwendbarkeit dieser Methode zu untersuchen, seltene Zelltypen oder kleine Gewebebiopsien entgegensteht. Um die ChIP-Assay kompatibel mit der Menge des biologischen Materials vornehmen, die in der Regel in Vivo in der frühen Embryogenese vertebrate gewonnen werden können, beschreiben wir hier eine vereinfachte ChIP-Protokoll, in dem die Anzahl der Schritte erforderlich, um abzuschließen, die Assay wurden reduziert, um die Probenverlust zu minimieren. Dieses ChIP-Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um verschiedene Histon-Modifikationen in verschiedenen embryonalen und adulten Maus Geweben mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ Zellen) zu untersuchen. Wichtig ist, dieses Protokolls ist kompatibel mit ChIP-Seq-Technologie mit Standardbibliothek Zubereitungsmethoden, wodurch globale epigenomischen-Karten von hochaktuellen embryonalen Gewebe.

Einleitung

Post-translationalen Modifikationen der Histone sind verschiedene Chromatin-abhängige Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur^1,2,3direkt beteiligt. Darüber hinaus verschiedene Histon Änderungen zeigen positive (z. B. H3K4me3 und H3K27ac) oder negativ (z. B. H3K9me3 und H3K27me3) Korrelationen mit Genexpression und kann im großen und ganzen definiert als aktivierende oder repressive Histon markiert, bzw.^2,3. Infolgedessen sind globale Histon Änderung Karten, auch bezeichnet als epigenomischen Karten als mächtiges und universelles Werkzeug funktionell vertebrate Genom^4,5Anmerkungen zu entstanden. Z. B. distalen regulatorische Sequenzen wie Enhancer identifiziert werden können abhängig vom Vorhandensein von spezifischen Chromatin Unterschriften (z. B. aktive Enhancer: H3K4me1 und H3K27ac), die von proximalen Promoter-Regionen unterscheiden (z.B. aktive Promotoren: H3K4me3)^6,7,8. Auf der anderen Seite befinden sich Gene mit großen Zelle Identität regulatorische Funktionen in der Regel mit breiten Chromatin Domains mit H3K4me3 oder H3K27me3, abhängig vom Status der zugrunde liegenden Gene transcriptionally aktiv oder inaktiv gekennzeichnet bzw.^{9 ,10}. Ebenso scheint der Ausdruck der großen Zelle Identität Gene häufig von mehreren und räumlich gesteuert werden gruppierten Enhancer (d. h. Super-Enhancer), die als breite H3K27ac versehenen Domänen¹¹identifiziert werden können.

Derzeit entstehen Histon Änderung Karten mit ChIP-Seq-Technologie, bietet im Vergleich zu bisherigen Ansätzen wie ChIP-Chip (ChIP mit Microarrays gekoppelt) höheren Auflösung, weniger Artefakte, weniger Lärm, mehr Reichweite und geringer kostet¹². Dennoch hat die Generation der epigenomischen-Karten mit ChIP-Seq-Technologie seiner inhärenten Einschränkungen, meist verbunden mit der Fähigkeit, erfolgreich ChIP in den Proben von Interesse zu erfüllen. Traditionellen ChIP Protokolle benötigt in der Regel Millionen von Zellen, welche Grenzen der Anwendbarkeit dieser Methode zur in-vitro- Zelle Zeilen oder Zellen, die isoliert in Vivo (z. B. Blutzellen) problemlos. In den letzten Jahren wurden eine Reihe von modifizierten ChIP-Protokollen kompatibel mit niedrigen Zellzahlen beschrieben^13,14,15,16. Aber diese Protokolle sind speziell mit Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) gekoppelt werden, und in der Regel verwenden sie ad-hoc- Bibliothek Vorbereitung Methoden^{13,14, 15 , 16}.

Wir beschrieben hier ein ChIP-Protokoll, das verwendet werden kann, zu untersuchen, Histon-Änderung-Profile mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ Zellen) an beiden ausgewählten Loci (z.B. ChIP-qPCR) oder Global (d. h. ChIP-Seq) (Abbildung 1). Wenn ChIP-Seq-Technologie gekoppelt, kann unser ChIP-Protokoll zusammen mit Standardbibliothek Zubereitungsmethoden, wodurch es allgemein zugänglich, viele Labors¹⁰verwendet werden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um mehrere Histon-Marken untersuchen (z. B. H3K4me3, H3K27me3 und H3K27ac) in verschiedenen Huhn embryonalen Geweben (z. B. spinale Neuralrohr (SNT), frontonasalen Protuberanzen und Epiblast). Allerdings erwarten wir, dass es breit anwendbar auf andere Organismen sein sollte, in denen biologisch bzw. klinisch relevante Proben nur in geringen Mengen erreicht werden können.

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Protokoll

nach den Richtlinien der deutschen Tierpflege, keine institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) Zulassung war notwendig, um das Huhn Embryo Experimente durchführen. Nach den lokalen Richtlinien genehmigungspflichtig nur Experimente mit HH44 (18 Tage) Hühnerembryos und ältere IACUC. In dieser Studie verwendeten Embryonen waren jedoch alle in früheren Stadien der embryonalen Entwicklung (d. h. HH19 (72 h)).

Hinweis: der Zweck dieses Protokolls ist eine detaillierte Beschreibung des ChIP-Tests liefern, so dass es mit qPCR oder Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) zu untersuchen, Histon Änderungen effektiv kombiniert werden kann niedrig-Fülle embryonalen Proben (von 5 x 10 ⁴-5 x 10 ⁵ Zellen für jeden ChIP-Reaktion) und verschiedenen Gewebetypen ( Abbildung 1). Das Protokoll sollte für die Untersuchung der verbindliche Profile von Transkriptionsfaktoren und Co-Aktivatoren (z. B. p300) anwendbar. Aufgrund der niedrigeren Fülle dieser regulatorischen Proteine, größere Zelle Zahlen dürften jedoch erforderlich (5 x 10 ⁵ - 5 x 10 ⁶ Zellen für jeden ChIP-Reaktion).

1. Vorbereitung von Eiern und Mikrodissektion Huhn SNT

Hinweis: das Verfahren für die Microdissections technisch unterscheidet sich von Gewebe zu Gewebe und Tiermodell zu Tiermodell. Dieser Abschnitt beschreibt im Detail die Dissektion Protokoll verwendet, brachial SNT Abschnitte von Bühne HH19 Hühnerembryos als Beispiel zu erhalten.

1. Brüten Hühnereier fruchtbaren weiße Leghorn, erhielt von einem lokalen Züchter in horizontaler Ausrichtung bei 37 ° C und 80 % Luftfeuchtigkeit für 3 Tage, um Bühne HH19 Hühnerembryos.
2. Bestimmen die Stufen nach dem Hamburger und Hamilton Huhn embryonale Entwicklungsstörung staging System ¹⁷.
3. Alle Microdissections unter kalten Bedingungen ausführen; andernfalls Chromatin Integrität gefährdet werden könnte.
4. Die HH19 Embryonen zu isolieren.
   1. Um die Embryonen zugänglich zu machen, zu extrahieren 3 mL Albumin mit einer 10 mL Spritze mit einer Nadel (0,90 x 40 mm), um das Blastoderm zu senken.
   2. Eine kleine Öffnung in das Ei mit einer feinen Schere und fügen Sie 1 mL der Lösung Locke (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept), die Entfernung von extraembryonalen Membranen zu erleichtern.
   3. 10 % indischen schwarze Tinte/Locke Lösung zu injizieren, mithilfe einer 1-mL-Spritze mit einer Nadel (0,55 x 25 mm ²) unter den Blastoderm, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern.
   4. Schneiden Sie die extraembryonalen Membran, die den Embryo mit medizinische chirurgische feine Scheren und Pinzetten umgibt.
   5. Einen perforierten Löffel verwenden, um den Embryotransfer 4,5 cm Petrischale mit 20 mL 1 x PBS-Lösung.
5. Sezieren entfernt das Amnion und die übrigen Teile des extraembryonalen Membran mit feinen Scheren und Pinzetten unter einem Stereomikroskop.
6. Schneiden die transversale SNT-Segment brachial Ebene des Embryos, kaudal erstreckt sich in der Brustwirbelsäule zu isolieren, die SNT ( Abbildung 2).
7. Entfernen von Gewebe, die seitlich/ventral SNT (z. B. seitliches Platte Mesoderm, Ektoderm Chorda und Aorta) umgeben mit Pinzette ( Abbildung 2).
8. Tauchen jedes seziert Huhn SNT Segment in eine 3,5 cm Petrischale mit 5 mL Warm (37 ° C) Trypsin (Trypsin/EDTA Lösung 1: 250).
9. Die Trypsin Behandlung abbrechen, wenn der nicht-neuronale Gewebe um die SNT Lockerung unter einem Stereomikroskop erkannt wird.
   Hinweis: Die Trypsinization Zeit muss werden streng kontrolliert, die übermäßige Verdauung und Dispersion von Nervengewebe zu vermeiden und die strukturelle Integrität der SNT behalten.
10. Nachbehandlung Trypsin, entfernen Sie das übrige mesenchymale und ektodermalen Gewebe manuell um saubere SNT Abschnitt vorzubereiten.
11. Übertragen die SNT-Abschnitt auf einer 1,5 mL-Tube und Blitz-Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Einmal ausreichend SNT-Abschnitte sind kumulierte (Pool der SNT von ~ 30 Hühnerembryos für eine ChIP-Reaktion Abschnitte), Lagerung bei-80 ° c
    Hinweis: Wenn genügend embryonalem Gewebe (z.B. 5 x 10 ⁵-5 x 10 ⁶ Zellen) können von einem oder wenigen Hühnerembryos seziert werden dann einfrieren ist nicht notwendig und es ist möglich, direkt mit den nächsten Schritten fortfahren. Entnehmen Sie bitte der Anleitung zur Fehlerbehebung in Tabelle 1.
    Hinweis: Vorsicht! Flüssiger Stickstoff hat eine extrem niedrige Temperatur, geeignete Verschleißschutz.

2. Vernetzung-Proteine, DNA: Tag1

Hinweis: führen Sie alle Schritte auf dem Eis, sofern nicht anders angegeben.

1. Hinzufügen 500 µL DMEM mit 10 % FBS und 10 µL 1 M Na-Butyrat direkt an tiefgefrorenem Gewebe oder alternativ sofort auf das frisch seziert Gewebe. Die Zellen durch die Aussetzung wieder sanft mit einer 1-mL-Pipette zu homogenisieren.
   Hinweis: Die Zugabe von Na-Butyrat ist optional aber empfohlen wenn Histon Acetylierung zu untersuchen. Anstelle von DMEM - 10 % FBS können Proben mit 1 X PBS-Puffer mit 0,1 % BSA Nukleinsäuretablette. Die Zugabe von FBS oder BSA ist optional, aber es erleichtert die Pelletierung Proben in die anschließende Zentrifugation Schritte.
2. 13,5 µL 37 % Formaldehyd (1 % Formaldehyd Final) hinzufügen und platzieren Sie es auf ein Rotator für 15 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Vorsicht! Formaldehyd ist giftig.
3. Das Rohr 25 µL 2,5 M Glycin hinzu und legen Sie es auf einem Rotator für 10 min bei Raumtemperatur das Formaldehyd zu stillen.
4. Drehen Sie das Rohr auf 850 X g für 5 min bei 4 ° C in einer Tischplatte Zentrifuge. Den Überstand verwerfen.
5. Waschen die Tablette einmal mit 500 µL des kalten frisch zubereitete waschen Puffer (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept), Zentrifuge bei 850 x g und 4 ° C für 5 min, und den Überstand verwerfen.

3. Lyse und Beschallung

1. bereiten Sie komplette Lyse Puffer (LB) (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept) und chill auf dem Eis. Verwenden Sie für 1 mL, 950 µL LB, 40 µL Protease-Inhibitor-Konzentrat (25 X) und 10 µL 100 % PMSF.
2. Aufschwemmen das Pellet in 300 µL kompletten LB durch pipettieren und legen Sie es auf eine rockende Plattform für 10 min bei 4 ° c
3. Beschallen die Proben unter Verwendung der folgenden Einstellungen: Temp = 4 ° C, Gesamtzeit = 7 Minuten “ auf ” Intervall = 30 s, “ aus ” Intervall = 30 s, Amplitude = 25 %
   Hinweis: Beschallung Bedingungen müssen für jedes Gewebe optimiert werden und ist abhängig von der Sonikator verwendet. Es wird empfohlen, die niedrigsten Beschallung-Einstellungen verwenden, die geschoren DNA von 200 bis 600 führen bp in der Größe. Scherung variiert stark je nach Gewebetyp, quantiTy, Beschallung Volumen Vernetzung Bedingungen und Ausrüstung. Entnehmen Sie bitte der Anleitung zur Fehlerbehebung in Tabelle 1.
4. Spin die beschallte Probe bei 16.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die Zelltrümmer pellet.
5. Übertragen die lysate (überstand) auf eine frische 1,5-mL-Tube.
   Hinweis: Wenn das Ausgangsmaterial für zwei ChIP-Experimente ausreichend erachtet wird, dann 300 µL kompletten LB kann hinzugefügt werden das beschallte Chromatin (d. h. Endvolumen: 600 µL).
6. Hinzufügen 30 µL 10 % Octylphenol für jeden 300 µL Nonylphenolethoxylat sonorisiert lysate (Endkonzentration: 1 %) und Mischen von pipettieren.
   Hinweis: Vorsicht! Octylphenol Nonylphenolethoxylat ist akut toxisch (oral, dermal, Inhalation).

4. Antikörper-Inkubation

1. Aliquot der 330 µL sonorisiert lysate in zwei 1,5-mL-Röhrchen: 300 µL für ChIP und 30 µL als input-Regler (10 % des Ausgangsmaterials). Speichern der " 30 µL Eingabesteuerelement Probe " bei-20 ° c
   Hinweis: Wenn zwei ChIP-Reaktionen aus der gleichen Probe durchgeführt werden, dann die 660 µL lysate sonorisiert kann in drei 1,5 mL Röhrchen (300 µL für ChIP #1, 300 µL für ChIP #2 und 60 µL als input-Regler (20 % des Ausgangsmaterials pro ChIP) verteilt werden ).
2. 3-5 µg des Antikörpers hinzufügen die 300 µL aliquoten beschallten Chromatin und Invert mischen.
   Hinweis: In dieser Studie jeder ChIP Reaktion erfolgte mit einem Antikörper, der spezifisch für Histon H3 Tri methyliert im K4 (H3K4me3), im K4 methyliert Histon H3-di (H3K4me2), bei K27 methyliert Histon H3-Tri (H3K27me3), und Histon H3 Tri Acetylierung auf K27 (H3K27me3). Der Erfolg dieses Protokolls ist völlig abhängig von der Qualität des Antikörpers verwendet. Der Antikörper sollte gezielt und effizient auf die Immunopräzipitation eines spezifischen Proteins. Es ist wichtig, die Höhe der Antikörper bestimmen, die Immunoprecipitate vernetzt Protein-DNA-Komplex verwendet werden können. Darüber hinaus kann die Spezifität des Antikörpers durch Western-Blot, sicherzustellen, dass es das richtige Protein erkennt überprüft werden. Ein Antikörper, der mehrere unspezifische Bänder erkennt wird nicht empfohlen für ChIP.
3. Legen Sie das Rohr auf einer rockigen Plattform bei 4 ° C über Nacht (12-16 h), die Antikörper binden an das Chromatin.
   Hinweis: Lesen Sie bitte die Anleitung zur Fehlerbehebung in Tabelle 1.

5. Vorbereitung der magnetischen Beads: Tag2

1. aliquoten 50 - 100 µL Protein G/magnetischer Wulst Gülle für jeden ChIP-Reaktion in einem 1,5 mL Microfuge Rohr auf Eis.
2. Waschen die magnetische Beads dreimal mit kalten Block-Lösung (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept) (4 ° C). Fügen Sie 500 µL kalter Block-Lösung und Mischung von invertierenden oder streichen hinzu. Habe das Rohr in einem Magnethalter und warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen. Die klare Flüssigkeit abgießen und wiederholen. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie alle Flüssigkeit mit einer Gel-Loading Spitze.

6. Immunopräzipitation des Chromatins

1. die gewaschenen Perlen der 300 µL Antikörper gebundene Chromatin hinzu und mischen invertieren.
2. Drehen vertikal auf ein Rohr Rotator bei 4 ° C für mindestens 4 h die Antikörper binden an die Perlen.

7. Waschen und eluieren umkehren die Querverbindungen

1. Chill RIPA Waschpuffer (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept) auf dem Eis, das Wasserbad auf 65 ° C und precool die Zentrifuge auf 4 ° c
2. Waschen die Chromatin-gebundenen Perlen viermal in 1 mL kalte RIPA Waschpuffer und halten Sie auf dem Eis. Dazu fügen Sie 1 mL kalte RIPA Waschpuffer und Mischung von invertierenden oder streichen hinzu. Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und warten Sie, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen. Die klare Flüssigkeit abgießen und wiederholen Sie.
   Hinweis: Die Anzahl der Wäschen mit Waschpuffer RIPA müssen optimiert werden je nach Probentyp, Probe Fülle und Antikörper verwendet wird. Eine erhöhte Anzahl an Wäschen wird vermindern den Hintergrund sondern auch Abnahme den Gesamtbetrag der wiederhergestellten DNA, die nachgelagerte Analyse von qPCR oder ChIP-SEQ gefährden kann
3. Der Röhre 1 mL TE/50 mM NaCl hinzu und übertragen die Chromatin-gebundenen Perlen in TE/50 mM NaCl zu einem frischen 1,5 mL Microfuge Schlauch vor dem Entfernen der Flüssigkeit mithilfe den Magnethalter, wie oben beschrieben.
4. Drehen die Perlen bei 900 X g für 3 min bei 4 ° C, setzen Sie den Schlauch wieder in den Magnet Holder und entfernen Sie alle verbleibenden TE mit einer Gel-Loading Spitze.
5. Fügen Sie 210 µL Elution Puffer (siehe Ergänzende Materialien für das Rezept) bei Raumtemperatur und Aufschwemmen von flicking.
6. Elute für 15 min bei 65 ° C in einem Heizblock unter schütteln.
7. Drehen die Perlen bei 16.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und legen Sie das Rohr in den Magnethalter.
8. Den überstand (~ 200 µL) auf ein frisches Microfuge Rohr übertragen, sobald die Perlen niedergelassen haben.
9. Tauen die Eingabe Kontrollproben (30 µL) von-20 ° C auf Raumtemperatur (in Schritt 4.1 eingefroren), 3 Bände der Elution Buffer (90 µL) hinzufügen und mischen, indem Sie kurz aufschütteln.
10. Brüten die Chip und Kontrolle Proben bei 65 ° C über Nacht (12-16 h), die Querverbindungen umzukehren.

8. Digest zelluläre Proteine und RNA: Tag3

1. 8.1At Raumtemperatur, fügen Sie 1 Volumen von TE-Puffer pro Röhre (um die SDS verdünnen) und kehren Sie um zu mischen: hinzu kommen 120 µL der Kontrollprobe und 200 µL TE zu 200 µL der Probe ChIP 120 µL TE.
2. Hinzufügen RNase A zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/mL und umkehren zu mischen: 240 µL der Kontrollprobe und 4 µL von 20 mg/mL RNase A bis 400 µL der Probe ChIP 2,4 µL von 20 mg/mL RNase A hinzufügen.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 2 h, die RNA zu verdauen.
4. Hinzufügen Proteinase K, eine Endkonzentration von 0,2 mg/mL und umkehren zu mischen: 240 µL der Kontrollprobe und 4 µL von 20 mg/mL Proteinase K, 400 µL der Probe ChIP 2,4 µL von 20 mg/mL Proteinase K hinzufügen.
5. Inkubation bei 55 ° C in einem Wasserbad für 2 h, das Protein zu verdauen und Reinigen der DNA.

9. ChIP-qPCR

Hinweis: DNA-Extraktion und Reinigung, durchführen, wie beschrieben in den Zusatzmaterialien.

Hinweis: Beschallung Effizienz zu überprüfen, wie beschrieben in den Zusatzmaterialien, zu bestätigen, dass 200-500 bp DNA-Fragmente ( Abbildung 3) erzielt werden.

Hinweis: ein wichtiger Schritt ist, um festzustellen, ob der ChIP tatsächlich geleisteten Arbeitsstunden. Wenn es genomische Bindungsstellen für das Protein des Interesses bekannt sind, ist Primer gestaltbar für quantitative PCR (qPCR) um festzustellen, ob der bekannte Websites, speziell in der DNA-ChIP angereichert werden im Vergleich zu negativ-Kontrolle Regionen voraussichtlich nicht gebunden werden die TempelanlageDatum Proteine. Als ein Beispiel dieser Arbeit zeigt die ChIP-qPCR-Ergebnisse mit ChIPs für H3K4me3 durchgeführt (aktiver Förderer Histon Mark) und H3K27me3 (inaktiver Förderer Histon Mark) in SNT Abschnitte von HH14 Küken Embryos isoliert ( Abbildung 4A ).

1. Mischen jede Primerpaar (vorwärts und rückwärts) im gleichen Rohr und bereiten einer Lager Konzentration bei 20 µM jeden mit dH ₂ O (Tabelle 2).
   Hinweis: die Effizienz der einzelnen Primerpaar vor der ChIP-qPCR Analyse ausgewertet werden sollen.
2. Verwenden Sie das ChIP und 20 % Eingabesteuerelement DNA im Schritt 8,5 für qPCR-Optimierung erhalten.
   Hinweis: Die Eingabe DNA in der Regel ist verdünnt 20 X (bis zu 1 % des Ausgangsmaterials verwendet in den ChIP-Reaktionen) für qPCR Analyse.
3. Für jeweils 10 µL des PCR, mischen Sie die folgenden Komponenten in einem PCR-Röhrchen: für DNA Mastermix, fügen Sie 2 µL dH2O, 2,5 µL SYBR grün-Mix und 1 µL DNA (aus ChIP oder 1 % Eingabe); für Mastermix mit Primer , fügen 2.375 µL dH2O, 2,5 µL SYBR grün-Mix und 0,125 µL vorwärts- und Grundierung Mix.
4. Mischen der Proben durch Vortexen für 2 s und kurz Zentrifuge bei 900 X g für 1 min.
5. Führen Sie Echtzeit-PCR (ein Beispiel von Primern und Radsport Bedingungen verwendet, hier finden Sie in Tabelle 2 und Tabelle 3, beziehungsweise).
   Hinweis: ChIP-qPCR Datenanalyse: ChIP Signale sind als Prozent der Eingabe berechnet. Kurz, einmal Ct-Werte ergeben sich für jede qPCR-Reaktion, ein Verdünnungsfaktor von 100 oder 6.644 Zyklen (log2 100) gilt für die Ct-Werte, die für die Eingabe DNA-Reaktionen. Dann für eine bestimmte Region von Interesse (z.B. Primerpaar), die ChIP-Signale werden wie folgt berechnet:
   Eingabe angepasst = Ct (Input) - 6,644
   ChIP Signal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10. ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung; Ende Reparatur: Tag 4

1. verdünnen bis zu 100 ng der ChIP-DNA in 60 µL Elution Puffer (siehe Materialien Tisch).
2. Hinzufügen 40 μL des Endes Mischung zu reparieren und pipette vorsichtig 10mal.
3. Inkubation bei 30 ° C für 30 min in einem Thermocycler.
4. Wirbel des magnetischen Perlen und das Röhrchen mit der Ende-Reparatur-Mix 160 μl hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren 10 mal gründlich. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Legen Sie das Rohr in die magnetische Halterung und warten, bis die Perlen sich auf der Seite der Röhre...
6. Die klare Flüssigkeit abgießen.
7. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder, fügen Sie 200 μL der frisch zubereiteten 80 % EtOH.
8. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und der Überstand verwerfen. Wiederholen Sie einmal...
9. Das Rohr für 15 min auf den Magnet Holder bei Zimmertemperatur aufbewahren. Sobald die Pellets trocken ist, entfernen Sie den Schlauch aus der Magnethalter.
10. Aufschwemmen der Pellets in 20 μL der Wiederfreisetzung Puffer. Pipette vorsichtig 10 mal gründlich zu mischen.
11. Für 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen. Einen neuen Schlauch 17,5 μl des Überstands übermitteln.

11. ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung; Adenylat 3 ' endet

1. hinzufügen 12,5 μl A-Tailing-Mix zum neuen Schlauch und Mischung gründlich durch sanft nach oben und unten 10 Mal pipettieren. Legen Sie das Rohr auf einem Thermocycler und inkubieren Sie nach dem folgenden Programm: 37 ° C für 30 min, 70 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C

12. ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung; Adapter verbinden

1. Add 2,5 μL der Wiederfreisetzung Puffer, 2,5 μL Ligatur-Mix und 2,5 μL des entsprechenden RNA Adapter Index. Mischung gründlich durch sanft nach oben und unten 10 Mal pipettieren.
2. Inkubation in einem Thermocycler für 10 min bei 30°.
3. Hinzufügen 5 μL Stop Ligatur Puffer und Mischung gründlich durch Pipettieren 10mal.
4. Wirbel des magnetischen Perlen und 42,5 μl der Probe hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren 10 mal gründlich. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Legen Sie das Rohr in die magnetische Halterung und warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen und die klare Flüssigkeit abgießen
6. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder, fügen Sie 200 μL der frisch zubereiteten 80 % EtOH.
7. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und der Überstand verwerfen. Einmal zu wiederholen.
8. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder und auch das Muster an der Luft trocknen für mind. 15.
9. Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnethalter und das Pellet in 52,5 μL der Wiederfreisetzung Puffer Aufschwemmen. Mischen Sie durch Pipettieren 10 mal gründlich. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren, legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und warten auf die Perlen auf der Seite der Röhre zu begleichen. Eine neue Tube 50 μL des klaren Überstands übermitteln.
10. Wirbel des magnetischen Perlen und die Probe 50 μL hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren 10 mal gründlich. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen und die klare Flüssigkeit abgießen.
12. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder, fügen Sie 200 μL der frisch zubereiteten 80 % EtOH.
13. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und der Überstand verwerfen. Einmal zu wiederholen.
14. Halten Sie den Schlauch auf den Magnet Holder und die der Probenluft für 15 min. trocknen lassen
15. Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnethalter und das Pellet in 27,5 μL der Wiederfreisetzung Puffer Aufschwemmen. Mischung gründlich durch Pipettieren 10mal.
16. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min, legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen. 25 μl des Überstands klar auf einen neuen Schlauch übertragen.

13. ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung; Verstärkung von DNA-Fragmenten

1. Ort 12,5 µL der Vorlage in ein 0,2 mL PCR-Röhrchen. Fügen Sie 2,5 μl des PCR-Primer cocktail, 10 μL der verbesserten PCR Mix. Mix gründlich von oben und unten 10 Mal pipettieren. Legen Sie das Rohr auf einem Thermocycler und Nutzungsbedingungen beschrieben in Tabelle 4.
2. Wirbel des magnetischen Perlen und 25 μl der Probe hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren 10 mal gründlich. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Legen Sie das Rohr in den Magnethalter, warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen und die klare Flüssigkeit abgießen.
4. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder, fügen Sie 200 μL der frisch zubereiteten 80 % EtOH. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und der Überstand verwerfen. Einmal zu wiederholen.
5. Halten Sie das Rohr auf den Magnet Holder und ließ die Probenluft trocken für 15 min. Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnethalter und Aufschwemmen das Pellet in 32.5 μl Wiederfreisetzung Puffer. Mischung gründlich durch Pipettieren 10mal.
6. Inkubieren die PCR/Rohrboden für 2 min bei Raumtemperatur. Magnetstativ bei Raumtemperatur die PCR/Rohrboden auflegen, warten, bis die Perlen an der Seite der Röhre zu begleichen und 30 μl des Überstands auf einen neuen Schlauch übertragen.

14. ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung; Validierung der Bibliothek

Hinweis: die Validierung der Bibliothek erfolgt über eine DNA- und RNA-Qualitätskontrolle System. Vorbereitung der Leiter: aliquoten 1 µL der genomischen DNA-Leiter in die erste Röhre/gut und fügen 3 µL Probenpuffer.

1. Vorbereitung der Probe: Mischen Sie 1 µL der Probe Bibliothek (10-100 ng/µL) mit 3 µL Probenpuffer in einem Rohr. Spin-down und dann Wirbel auf maximale Geschwindigkeit für 5 S. Spin down, positionieren Sie die Probe an der Unterseite des Rohrs.
2. Laden Sie die Proben in das Qualitätssicherungssystem.
3. Nach Abschluss des Laufs, analysieren Sie die Ergebnisse durch Einstellen des Kontrasts auf den Höchstwert um sicherzustellen, dass keine Grundierung Dimere sind in der Probe ( Abbildung 5), Grundierung Dimere sollte auf ein Band rund 135 entsprechen bp. Wenn sogar eine schwache Band vorhanden ist, fahren Sie mit einer zweiten Sanierung durch Zugabe von Elution Puffer (siehe Materialtabelle) bis zu einem Volumen von 50 µL und 47,5 µL der gemischten magnetische Beads hinzufügen. Wenn die Konzentration der Probe zu niedrig ist (< 2 nM), fahren Sie mit die PCR (Schritt 13.1) laufen, mit 18 Zyklen statt 15, mit 12,5 µL Volumen der Probe links vom Schritt 12.16.
4. Quantifizieren die Bibliotheken individuell durch qPCR mit handelsüblichen Kits.
   Hinweis: Pools von Bibliotheken können sequenziert werden mit einem Sequenzer mit einer Single-1 x 50 nt-Protokoll mit dem Ziel 30 M mal gelesen/Probe.

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Ergebnisse

Um die Leistung unserer ChIP-Protokoll zu veranschaulichen, haben wir ChIP-Seq-Experimente mit gepoolten SNT Abschnitte von HH19 Hühnerembryos, maxillaris Protuberanzen HH22 Embryonen, und Bühne-HH3 Hühnerembryos zu untersuchen, die verbindliche Profile von Huhn verschiedenen Histon-Modifikationen (z. B. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 und H3K27me3). Das gewonnene ChIP DNAs waren wurde die Beschallung Effizienz durch Agarose-Gelelektrophorese der entsprechenden Eingabe DNAs (

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Diskussion

Epigenomischen Profilierung der Histon-Modifikation mit ChIP-Seq kann verwendet werden, zur Verbesserung der funktionellen Annotations vertebrate Genom in verschiedenen zellulären Kontexten^4,5,18. Diese epigenomischen-Profile eingesetzt werden, unter anderem um zu identifizieren, Enhancer-Elemente, um die rechtliche Definition des Enhancer (d. h. aktiv, grundiert, oder bereit) und großen Zelle Identität Regulierungsb...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH 8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1 Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100 - 1,000 µL Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2 - 20 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2 - 200 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10 mL)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997