הפיכה Deactivations קירור-induced ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול זיכרון של החתול הליכה

Summary

ומכניקה מורכבות בסביבות נטורליסטי הדורשים תיאום זהיר של הגפיים כולל אזורים של קליפת הקודקוד. הפרוטוקול הבא המתאר את השימוש הפיך קירור-induced הביטול כדי להדגים את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים של החתול הליכה.

Abstract

על שטח מורכבות, נטורליסטי, מידע חושי על מכשול סביבתי יכול לשמש כדי להתאים במהירות את תנועות גינקולוגיות על הימנעות. לדוגמה, אצל חתולים, מידע חזותי של מכשול הממשמש ובא יכול לווסת לדרוך על הימנעות. הסתגלות גינקולוגיות יכולות להתרחש גם עצמאית של חזון, כפי פתאומי תשומות מישוש ברגל על ידי מכשול הצפוי יכול לשנות הצעידה של כל ארבע רגליים על הימנעות. תאום גינקולוגיות מורכב כרוך מבנים supraspinal, כגון קליפת הקודקוד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש הפיך, קירור-induced קורטיקלית שחרור משרות כדי להעריך את קליפת הקודקוד תרומות מכשול מונחה זיכרון ומכניקה של החתול. לולאות קירור קטנים, המכונה cryoloops, עוצבו במיוחד כדי לבטל אזורים נפרדים עניין כדי להעריך את תרומתה התנהגות גלויה. שיטות כאלה שימשו התירי את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים של החתול.

Introduction

על פני השטח נטורליסטי, לא אחיד, מידע חושי על מכשול, אשר ניתן לרכוש דרך החזון או מגע, באפשרותך לשנות במהירות ומכניקה של הימנעות. תיאום זהיר של תנועות דריכה כולל אזורים קורטיקליים מספר^1,2. לדוגמה, אזורי קורטקס מוטורי^3,4 ו קליפת הקודקוד^5,6,7 היו מעורבים במהלך משימות מורכבות גינקולוגיות כגון ממכשולים. ב quadrupedal בעלי חיים, האפנון הצעד הנדרש ממכשולים חייב להרחיב את הרגליים הקדמיות ואת hindlegs. אם ומכניקה קדימה מתעכב בין סיווג מכשול וריסקה ו- hindleg (אשר ייתכן מתעוררות כאשר חיה דורכת בזהירות דרך טרף לעקוב אחרי סביבה מורכבות, נטורליסטי), מידע אודות המכשול נשמר בזיכרון משמש כדי להנחות hindleg חוצה המכשול פעם הליכה קורות חיים.

טכניקות ניסויית שמטרתה לבטל אזורים קורטיקליים דיסקרטית ניתן ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול מונחה זיכרון ומכניקה. קירור-induced לנטרול קורטיקלית מספק הפיך, אמינים ובעלי לשחזור שיטה להערכת התרומה. התנהגות גלויה⁸קורטיקלית. Cryoloops עשוי נירוסטה צינורות הם בצורת ספציפי לאזור בקליפת המוח של עניין, הבטחת מאוד סלקטיבי ודיסקרטי שחרור משרות של לוקוסים. מהרגע בו הוקנו, מתנול צוננת דרך לומן של cryoloop מתקררת האזור של הקורטקס ישירות מתחת לתמונה כדי < 20 º C. מתחת לטמפרטורה זו קריטית, הסינאפסית מעוכבת באזור של קליפת ישירות מתחת לתמונה. יכול להיות הפוך כזה הביטול פשוט על ידי הפסקת הזרימה של מתנול. בשיטה זו נעשה שימוש כדי ללמוד תרומות קורטיקלית עיבוד חושי והתנהגויות^{9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17}, כמו גם שליטה מוטורית של תנועות העין saccadic¹⁸ ומכשול מונחה זיכרון ומכניקה¹⁹.

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש deactivations קירור-induced הפיך כדי להעריך את מעורבותם של אזורים קורטיקליים הקודקוד לתיאום גינקולוגיות של החתול. באופן ספציפי, גפיים מכשול מונחה זיכרון נבדק עם או בלי קליפת הקודקוד פעיל. שיטות אלה שימשו להפגין בהצלחה את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים החתול הליכה¹⁹.

Protocol

כל ההליכים נערכו בהתאם המדריך של המועצה הלאומית למחקר על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (המהדורה השמינית; 2011), המועצה הקנדית על בעלי חיים טיפול של מדריך טיפול, שימוש של חיות ניסוי (1993), היו אושרה על ידי הוועדה שימוש בבעלי חיים מאוניברסיטת מערב אונטריו של מועצת האוניברסיטה על טיפול בעלי חיים.

ההליך הבא ניתן ליישם ניסויים לומד תרומות קורטיקלית גינקולוגיות שליטה ברכב ההליכה.

1. מכשיר

1. לבנות מנגנון להערכת מכשול זיכרון.
   הערה: המנגנון מורכב של 2.43 מ' ארוך, 29 ס רחב שביל מוקף חומות ברור אקריליק גבוהה 18 ס"מ (איור 1). חריץ צר לאורך המנגנון מאפשר 25.8 ס"מ רוחב x 3 מ מ עבה מכשול על גבי או להסיר מן השביל באמצעות מנוף רכוב מתחת לפני השטח הליכה.
2. כדי להבטיח כי תשומת הלב של החיה נשמר על אכילה, הימנע משימוש ביד כדי להגביה או להנמיך את המכשול. במקום זאת, המכשול יכול יגודל או מורד באמצעות הרגל של הנסיין כדי להזיז את הידית מתחת השביל, ומאפשר הנסיין להמשיך להאכיל את בעל החיים.
3. כמו שצריך לשמור על מערכת הידית כדי להבטיח כי המכשול יכול להגביה או הסירה ללא קול.
4. להשתמש פלטפורמה מוגבהת קטן (23 ס מ זמן x ס מ 23 ס"מ x 16 רחב) בעת מזון רך מושם, להנחות את התנועות של החיה.
5. לתעד את כל המבחנים באמצעות מצלמת רשת ethernet (מסגרות לשנייה 54) רכוב על גבי חצובה 1.85 מ' האמצע של השביל.

2. אימון נהלים

הערה: עבור ייבוא נתונים מוצלחת, תקופה של אימון מקדים בדיקה התנהגותית מבטיחה כי כל בעל חיים כהלכה שאמבטיה חדר ו מכשירי הבדיקה. חשיפה חוזרת ונשנית סביבה הרומן יסייע להפחית התנהגויות מלחיץ מבהילה או אחרים.  להתאקלמות עשויים להשתנות בין חיות, עשויים לדרוש 1-2 חודשים של אימון. הפעלות להתאקלמות הראשוני עשוי להיות עד 5 דקות אורך בהתאם המיקוד ואת המוטיבציה של החיה לאכול. הפעלות עוקבות צריך שואפים להגדיל את משך זמן זה בעל מוטיבציה גבוהה לעבודה (בדרך כלל בסביבות 20-25 דקות).

1. לרכוש בוגרת (> בגיל 6 חודשים) חתולי שיער קצר במשקי בית תרבית המעבדה מסחרי של משקל או סקס.
   הערה: מוטיבציה לעבודה אופי שיתופי ומזון מהווים הקריטריונים לבחירת כאשר בוחנים אילו חיות צריך להיכלל במחקר.
2. להתאקלם כל חיה לרתמה שאליו מחוברת רצועה ארוכה 1 מ'. לעגן את הרצועה על מדף מעל השביל מעל נקודת האמצע של השביל.
   הערה: פעולה זו מאפשרת את החיה לאורך החלק המרכזי של מנגנון ללא מתח, ובכך מעודד את החיה להישאר בתוך החלק הזה של המנגנון. קביעת גבולות כזה שימושי לעבודה עם נושא הבדיקה בתנועה.
3. מקם את החיה אל השביל, ומאפשר לה לאכול מן הרציף שעליו מונחת מזון רך.
   הערה: מטרה אחת של הכשרה ראשונית זו היא להבטיח כי החיה מלווה ברצון פלטפורמת מזון כאשר עברה קדימה, יכולים ללכת בנוחות עם רתמה ורצועה. השימוש במזון רך כמו חיזוק חיובי מעודדת את החיה להישאר ממוקד לאורך כל מפגש הדרכה או בדיקה, ומעודדת סביבת עבודה נוחה.
4. ודא כי החיה נוח עם טיפול, כולל מופעים איפה החיה חייבים להעביר את האזור התחלה של השביל.

3. התנהגות הדרכה ובדיקות פרוטוקול

הערה: הזיכרון מכשול מוערך בשתי פרדיגמות: משימה זיכרון חזותי תלויי-מכשול ולאחר פעילות זיכרון תלוי-מישוש מכשול. שתי פרדיגמות אמור לשמש במהלך ההכשרה הראשונית, בדיקות עוקבות.

1. זיכרון חזותי מכשול
   1. כדי להעריך את הזיכרון החזותי מכשול, להעלות את המכשול על השביל (איור 2 א). מקם את הפלטפורמה בצד הרחוק של המכשול. מקם את החיה באזור התחלה של השביל.
   2. לאפשר החיה להתקרב האוכל, דריכה המכשול עם רק את הקדמיות שלו כדי לאכול מן הרציף.
   3. כמו החיה ממשיך לאכול, הנמך את המכשול כזה כי זה הופך להיות מיושר עם השביל כדי למנוע כל כניסות נוספות חזותי או המישוש.
   4. בעקבות תקופת עיכוב משתנה, להזיז את העברות אוכל שוב כדי לעודד את החיה כדי לחדש ללכת; עיכוב זה יכול להיות פחות מ- 1 s כדי למעלה מ- 2 דקות.
   5. חשוב, לבצע ניסויים איפה המכשול נעדר כדי למנוע habituation מכשול, התפתחות תגובה הימנעות המלומד. בניסויים כאלה חזותי מכשול-נעדר, ודא כי המכשול לא מופעל על גבי השביל לפני הצבת החיה באזור התחלה של השביל.
   6. שימו לב hindleg צועד בניסויים מכשול-נוכח ומבנית מכשול כדי לוודא התנהגויות גינקולוגיות טיפוסי וזיכרון מכשול חזותית שלמים לפני קירור. ודא כי החיה ניתן לנקות את המכשול ללא מגע, זה צעד של ארבע הוא גבוה באופן משמעותי בניסויים מכשול-נוכחים.
      הערה: צפייה בסרטונים של הכשרה הניסויים עשויים לסייע אימות זה.
2. מכשול מישוש זיכרון
   1. כדי להעריך את הזיכרון מכשול מישוש, ודא כי המכשול לא מופעל על גבי השביל לפני הצבת החיה באזור התחלה של השביל (איור 2B).
   2. לאפשר לחיה ללכת לעבר הרציף אוכל להציב בצד הרחוק של חריץ מכשול.
   3. כמו החיה אוכלת, להעלות את המכשול על גבי השביל מתחת המנה המזון, מניעת כל קלט חזותי של המכשול.
   4. כמו האוכל מועבר קדימה, שימו לב כי החיה, יפנה את המכשול עם הרגליים הקדמיות שלהם לפני לדרוך על זה.
   5. לאפשר את החיה להמשיך לאכול בזמן בפישוק על המכשול בין קידמה - לבין hindlegs. במהלך תקופה זו, הורד את המכשול כך שהוא הופך מיושר עם השביל כדי למנוע כל כניסות נוספות חזותי או חוש המישוש.
   6. בעקבות עיכוב משתנה התקופה, להעביר את העברות מזון פעם נוספת כדי לעודד את החיה כדי לחדש הליכה.
   7. חשוב, לבצע ניסויים שבהם נעדר המכשול, בלי קשר וריסקה מתרחשת למניעת habituation מכשול, התפתחות תגובה הימנעות המלומד.
      1. בניסויים אלה מישוש מכשול-נעדר, יש את הגישה בעלי חיים, לאכול מן הרציף מזון, כפי שמתואר בשלב 3.2.1. עם זאת, מעלים ומורידים את המכשול (שלב 3.2.2) לפני העברת המזון קדימה בשלב 3.2.3. ודא כי תקופת עיכוב דומה שבו החיה מותר להמשיך לאכול (שלב 3.2.4) הסכם מקדים ההמשך הסופי של גפיים (שלב 3.2.5).
   8. לבחון את hindleg נכנס הניסויים מכשול-נוכח ומבנית מכשול כדי לוודא התנהגויות גינקולוגיות רגילה וזיכרון מכשול חזותית שלמים לפני קירור.

4. וידאו ניתוחים

הערה: כדי להעריך מכשול זיכרון, ניתוחים במהלך ההכשרה הראשונית, בדיקות עוקבות אחרי קירור לולאה ההשתלה כרוכה לכימות שיא הגובה שלב שלב אישור, את המרחק האופקי בין הבוהן לבין מכשול בשיאו של כל שלב עבור גם ויזואלית וגם חוש המישוש פרדיגמות (איור 2C).

1. לנתח קטעי וידאו באמצעות קבצי script מותאמים אישית בכתב.
2. עבור כל משפט, לעקוב אחר כל רגל על ידי סימון המיקום של הבוהן הקרוב ביותר למצלמה בכל שלב.
3. למדוד את גובהם של שלב שיא כמרחק בניצב בין האצבע הקטנה לבין פני השטח של השביל לנקודה הגבוהה ביותר בכל מסלול שלב (איור 2C).
4. בניסויים מכשול-נוכח, למדוד את האישור בצעד בתור שלב גובה ישירות מעל החריץ מכשול המופחת על-ידי הגובה של המכשול.
5. בנוסף, למדוד את המרחק האופקי בין הבוהן המכשול בשיאו של הניסויים מכשול-נוכח בכל שלב ושלב.
6. לאשר כי יכולות הזיכרון מכשול שלמים לפני ההשתלה לולאה קירור על-ידי אימות כי הגובה שלב השיא הוא גבוה ב הניסויים מכשול-נוכח בהשוואה נכנס הניסויים מכשול-נעדר.

5. קירור לולאה (Cryoloop) השרשה

1. שתל cryoloops דו צדדיים על אזורים 5 ו- 7 על פי שדווחה בעבר ניתוחים⁸ (איור 3).
2. בקצרה, על האונה כל, לבצע ואז durotomy Horsley-קלארק קואורדינטות²⁰ A15 A25 לחשוף את צומת sulci ansate ולא לרוחב.
3. מיקום הפרט קירור לולאות בצורת בלבד הצנרור hypodermic 23-מד נירוסטה עם הלולאה במגע ישיר עם השטח קורטיקלית של אזור הקודקוד 5 או 7.
4. אבטח את הבסיס של כל cryoloop בגולגולת עם שיניים אקריליק מעוגן למדחף פלדת אל-חלד.
5. לסגור את גולגולת עם אקריליק שיניים נוספים; לצייר את השוליים העור קצוות אקריליק ואל תפר יחד.

6. פרוטוקול קירור בקליפת המוח

1. הגדרת הניסוי
   הערה: לפני הבאת החיה לחדר בדיקות, מעגל הקירור הוא מוכן ונבדק. המעגל קירור כולל מאגר מתנול עם צינור היניקה (3.2 מ מ יתר, 1.6 מ מ ז), reciprocating משאבת בוכנה, אמבטיית קרח יבש מחובר דרך טפלון אבובים (1.6 מ מ יתר, 0.5 מ מ ז; איור 4). בנוסף, מד חום דיגיטלי נדרש.
   1. להוסיף 500 קרח יבש cc ל- 200 מ של מתנול באמבט קרח. מתאים לצנרת מסתיים בנוחות על כניסת ועל עודפים של cryoloop דמה כדי להשלים את המעגל קירור.
   2. לצרף את התקע צמד תרמי מד חום דיגיטלי עבור ניטור באמצעות כבל מורכב של שני מחברים זכר צמד תרמי חוט צמד תרמי טמפרטורה רציפה. ודא כי אורך הכבל הזה מספיקה להגיע לראש של החיה כאשר קצה אחד מחובר את המדחום.
   3. הפעל את משאבת בוכנה באמצעות המתג.
      הערה: מתנול צריכה להיות מקופלות מן המאגר, עברו את המשאבה לאמבטיה קרח יבש שם מתנול זורם בתוך הצנרת להיות מקורר ל-75 מעלות צלזיוס. מתנול צוננת לאחר מכן יציאה לאמבט קרח, להריץ את cryoloop המצורפת לפני שחזר המאגר מתנול.
   4. להבטיח משאבת הגדרת אורך צינורות בתוך האמבטיה קרח, אורך צינורות מהאמבטיה קרח כדי לולאות דמה אופטימלית כך הטמפרטורה cryoloop דמה יכול להגיע למצב יציב בסביבות-5.0 מעלות צלזיוס.
      הערה: כזה הטמפרטורות במהלך ההגדרה הראשונית זו לעיתים קרובות מספיק להשגת מבחן טמפרטורות של 3.0 ± 1.0 ° C, כאשר נעשה שימוש באותה המערכת להתקרר cryoloop מושתל. הקושי להשיג מספיק קירור יכולה להיפתר על ידי התאמת המהירות של המשאבה, הגדלת אורך צינורות המשוקע בתוך האמבטיה קרח, ו/או צמצום אורך צינורות מהאמבטיה קרח כדי cryoloop.
   5. במידת הצורך, להאריך את מקטע של אבובים על ידי שרשור בסוף הצינור דרך למדוד קצה צינור ווהסתיר את קצה הצינורית עם כלי flanging. צרף צינורות באורך הרצוי עם קצה אוגן באופן דומה באמצעות מחבר.
   6. ודא כי כל החיבורים הם צמודים, אין דליפות נוכחים. ברגע מרוצה ההגדרה הראשונית, כבה את המשאבה, ולהסיר את cryoloop דמה; המעגל הוא מוכן כעת חיה הבדיקה.
2. בדיקה התנהגותית
   1. במקום החיה על מנגנון בדיקה. להחליק את הרתמה על הראש ולאבטח את מתכרבלת רצועה מסביב החיה. לצרף את הרצועה.
   2. הסר את המכסה המגן של cryoloop מושתל לחשוף את צינורות כניסת ולשקע. אבובים בכושר מסתיים בנוחות על כניסת ועל עודפים שפופרות cryoloop. חבר את תקע צמד תרמי המדחום הדיגיטלי.
   3. להתחיל את הפעלת בדיקה ויזואלית (שלב 3.1) או חוש המישוש (שלב 3.2) מכשול זיכרון למשפט. לעקוב אחר עם ניסויים נוספים מכל הסוגים ארבע (חזותי מכשול-נוכח, חזותי מכשול-נעדר, מישוש מכשול-נוכח, מישוש מכשול-נעדר) באופן אקראי.
      הערה: הפעלת בדיקות טיפוסי מורכב בלוק 'חמים' של ניסויים, היכן מונחות זיכרון ממכשולים נצפית בהיעדר קירור להקים אמצעי בסיסית.
   4. . הפעילי את משאבת בוכנה, והמתן cryoloop להגיע לטמפרטורה של ± 3.0 מעלות 1.0 (1-2 דקות). לאחר מכן, להפעיל בלוק 'מגניב' של ניסויים לאחר משאבת בוכנה הוחלפה. במהלך זה בלוק של ניסויים, במידת הצורך, להעריך תרומות של האזור מקורר כדי מונחה זיכרון. ודא כי הטמפרטורה של cryoloop נשמרת ב- 3.0 ± 1.0 מעלות צלזיוס לאורך הרחוב כולו.
      הערה: כל ארבעה סוגי המשפט צריך להיות אקראי וביניהם לאורך הרחוב.
   5. הפעלת בלוק "לחמם" הסופי של ניסויים לאחר הוחלפה משאבת בוכנה, cryoloop חזר לטמפרטורה המקורי שלה.
      הערה: התנהגות דריכה בסיסית היא הוקמה מחדש במהלך בשכונה הזאת. שוב, כל ארבע סוגי המשפט צריך וביניהם באקראי לאורך הרחוב.
3. ניקיון
   1. בעת בדיקה התנהגותית הוא סיכם, הסר את הצנרור צינורות כניסת ולשקע. להיות מודע מתנול שיורית עשויים לטפטף מן הקצוות אבובים, עלול לגרות את החיה.
   2. ודא כי המכסה המגן מוחלף. הסר את הרצועה ואת לרתום לפני שחזר החיה למושבה. לקצץ את הקצוות אבובים (3-4 מ מ) שימוש בחותך אבובים כדי למנוע חיבורים דולפים למחרת הבדיקה.

7. אימות היקף קירור

1. בסוף בדיקה התנהגותית, לאשר מידת הביטול הוא מוגבל לאזור של הקורטקס ישירות מתחת לכל cryoloop באמצעות טכניקות שדווחה בעבר⁸.
   הערה: ניתן לוודא זאת עם מיפוי תרמוקלינה¹² או תרמית הדמיה המצלמה^13,14,19.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבחון תרומות קליפת הקודקוד מכשול בזיכרון החתול הליכה¹⁹. במחקר זה, cryoloops שהיו מושתלים דו צדדיים מעל הקודקוד אזורים 5 ו 7 מתוך שלושה מבוגרים (> בגיל 6 חודשים) חתולות (איור 5A). בעלי חיים היו העריך בהדפוס זיכרון מכשול מישוש בהיע...

Discussion

הפרדיגמה שתואר מעסיקה קירור-induced deactivations של אזורים קורטיקליים נפרדים באמצעות את cryoloop על מנת ללמוד מכשול מונחה זיכרון ומכניקה של החתול. הפארדיגמות זיכרון חזותי של חוש המישוש מכשול פשוטים למדי לבעלי לביצוע כפי שהם לנצל נטורליסטי התנהגויות גינקולוגיות מתרחשות במינימום מאמץ, כאשר חיים הוא מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a