Réversible par refroidissement désactivations pour étudier les Contributions corticales à Obstacle mémoire chez le chat marche

Résumé

Locomotion complexe en milieux naturalistes nécessitant une étroite coordination des membres concerne les régions du cortex pariétal. Le protocole suivant décrit l’utilisation de réversible désactivation par refroidissement à démontrer le rôle de région pariétale 5 en évitement d’obstacles guidée par mémoire chez le chat marche.

Résumé

Sur un terrain complex, naturaliste, informations sensorielles sur un obstacle environnementale permet d’ajuster rapidement les mouvements locomoteurs pour éviter. Par exemple, chez le chat, des informations visuelles sur un obstacle imminent peuvent moduler stepping pour évasion. Locomotrice adaptation peuvent également être indépendante de la vision, comme des entrées tactiles soudaines à la jambe par un obstacle prévu peuvent modifier l’approfondissement de ses quatre jambes pour éviter. Cette coordination locomotrice complexe implique des structures supraspinales, telles que le cortex pariétal. Ce protocole décrit l’utilisation de désactivation corticale réversible, par refroidissement à évaluer les contributions de cortex pariétal à la locomotion obstacle guidée par mémoire chez le chat. Petites boucles de refroidissement, connus comme cryoloops, sont spécialement formés pour désactiver des régions discrètes d’intérêt afin d’évaluer leur contribution à un comportement manifeste. Ces méthodes ont été utilisées pour élucider le rôle de zone pariétale 5 en évitement d’obstacles guidée par mémoire chez le chat.

Introduction

Sur terrain naturaliste, inégal, informations sensorielles sur un obstacle, ce qui peut être acquise par vision ou touch, peuvent rapidement modifier locomotion pour éviter. Cette étroite coordination de mouvements de progression implique plusieurs régions corticales^1,2. Par exemple, les zones du cortex moteur^3,4 et cortex pariétal^5,6,7 ont été impliqués lors des tâches locomoteurs complexes comme l’évitement d’obstacles. Chez les animaux quadrupèdes, modulations étape requises pour l’évitement d’obstacles doivent s’étendre aux membres antérieurs et postérieurs. Si la locomotion avant est retardée entre le franchissement de la patte avant et hindleg (qui peut-être apparaître comme un animal marches soigneusement à travers une proie traque environnement complexe et naturaliste), informations sur l’obstacle maintenu dans la mémoire sont utilisées pour guider le hindleg enjambant l’obstacle une fois marche reprend.

Techniques expérimentales visant à désactiver les zones corticales distinctes peuvent servir à étudier les contributions corticales à la locomotion obstacle guidée par mémoire. Désactivation corticale par refroidissement fournit une méthode réversible, de fiable et reproductible pour évaluer les contributions corticales à un comportement manifeste⁸. Cryoloops faites de tubes en acier inoxydable sont en forme spécifiques à la zone corticale d’intérêt, assurant la désactivation hautement sélective et discrete de loci. Une fois implanté, méthanol réfrigéré pompé par la lumière d’un cryoloop refroidit la région du cortex directement sous la boucle à < 20 ° C. Au-dessous de cette température critique, la transmission synaptique est inhibée dans la région du cortex directement sous la boucle. Cette désactivation peut être inversée simplement en cessant de l’écoulement du méthanol. Cette méthode a été utilisée pour étudier la corticales contributions au traitement sensoriel et comportements^{9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17}, ainsi que la commande de moteur de mouvements par saccades des yeux¹⁸ et guidée par mémoire obstacle locomotion¹⁹.

Le but du présent protocole est d’utiliser des désactivations réversibles par refroidissement afin d’évaluer l’implication des secteurs corticaux pariétales de coordination locomotrice chez le chat. Plus précisément, locomotion guidée par mémoire obstacle a été examinée avec ou sans cortex pariétal active. Ces méthodes ont été utilisées pour démontrer avec succès le rôle de région pariétale 5 en évitement d’obstacles mémoire guidée dans la marche du chat¹⁹.

Protocole

Toutes les procédures ont été menées en conformité avec Guide du Conseil National de recherches pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (huitième édition ; 2011) et le Canadian Council on Animal Care Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (1993) et ont été approuvées par le sous-comité d’utilisation animale de l’Université de Western Ontario du Conseil universitaire sur la protection des animaux.

La procédure suivante peut être appliquée à des expériences étudiant corticales contributions au contrôle locomotrice chez le chat marche.

1. les appareils

1. Construire l’appareil utilisé pour évaluer la mémoire de l’obstacle.
   Remarque : L’appareil est constitué d’un 2,43 m long, 29 cm large sentier entouré de hauts murs acrylique transparent de 18 cm (Figure 1). Une fente étroite à mi-chemin le long de l’appareil permet un obstacle épais 25,8 cm du 3 mm largeur x être soulevées sur ou retirés de la passerelle à l’aide d’un levier monté sous la surface de marche.
2. Pour assurer le maintien de l’attention de l’animal sur l’alimentation, évitez d’utiliser la main pour soulever ou abaisser l’obstacle. Au lieu de cela, l’obstacle peut être montée ou descendue pour déplacer le levier situé sous la passerelle, permettant à l’expérimentateur de continuer à nourrir l’animal à l’aide de la jambe de l’expérimentateur.
3. Bien entretenir le système de levier pour s’assurer que l’obstacle peut être montée ou descendue soundlessly.
4. Utiliser une plateforme de petits élevée (23 cm long x 23 cm large x 16 cm de hauteur) sur lequel des aliments mous sont placée, afin de guider les mouvements de l’animal.
5. Enregistrer tous les essais utilisant une caméra ethernet (54 images/s), montée sur un trépied 1,85 m de la ligne médiane de la passerelle.

2. procédures de formation

Remarque : Pour l’acquisition de données avec succès, une période de formation qui précède des tests comportementaux s’assure que chaque animal est correctement acclimaté à la salle de test et les appareils. Une exposition répétée à un nouvel environnement aidera à réduire surprenantes ou autres comportements stressants.  Acclimatation peut varier entre les animaux et peut nécessiter 1 à 2 mois de formation. Séances d’acclimatation initiale peuvent être jusqu'à 5 min en longueur selon la mise au point et la motivation de l’animal de manger. Les sessions suivantes devraient viser à augmenter la durée pendant laquelle l’animal est motivé pour travailler (généralement autour de 20-25 min).

1. Acquérir matures (> 6 mois d’âge) chats domestique à poils courts chez un éleveur de laboratoire commercial de n’importe quel poids ou le sexe.
   NOTE : Motivation au travail pour l’alimentation et une disposition coopérative constituent les critères de sélection lors de l’examen des animaux qui devraient être inclus dans l’étude.
2. Acclimater chaque animal à porter un harnais auquel est attachée une longue laisse de 1 m. Ancrer la laisse à une étagère au-dessus de la passerelle sur le milieu de l’allée.
   Remarque : Ceci permet à l’animal de marcher le long de la partie centrale de l’appareil sans tension, ce qui encourage l’animal de rester dans cette partie de l’appareil. Établissant des limites est utile pour travailler avec une matière mouvante de test.
3. Placez l’animal sur la passerelle, ce qui lui permet de manger de la plate-forme sur laquelle sont posée des aliments mous.
   Remarque : Le but de cette formation initiale est de s’assurer que l’animal suit aisément la plateforme alimentaire lorsque déplacés vers l’avant et peut marcher confortablement avec le harnais et une laisse. L’utilisation des aliments mous comme renforcement positif encourage l’animal à rester concentré tout au long de chaque session de formation ou d’essai et favorise un environnement de travail confortable.
4. S’assurer que l’animal est à l’aise avec le traitement, y compris les cas où l’animal doit être déplacée vers l’aire de départ de la promenade.

3. comportement de formation et de protocole d’essai

Remarque : La mémoire de l’obstacle est évaluée à deux paradigmes : une tâche de mémoire obstacle visuellement-dépendante et une tâche de mémoire tactile dépendant obstacle. Les deux paradigmes doivent être utilisés au cours de la formation initiale et le contrôle ultérieur.

1. Mémoire d’obstacle visuel
   1. Pour évaluer la mémoire visuelle obstacle, lever l’obstacle sur la passerelle (Figure 2 a). Placez la plateforme sur la face cachée de l’obstacle. Placer l’animal dans la zone de départ de la promenade.
   2. Laisser l’animal s’approcher de la nourriture, enjambant l’obstacle avec seulement ses pattes avant afin de manger de la plate-forme.
   3. Comme l’animal continue à manger, abaisser l’obstacle tel qu’il devient affleure la passerelle pour empêcher n’importe quelles entrées plus visuelles ou tactiles.
   4. Après un délai variable, avancer les aliments nouveau pour encourager l’animal à reprendre la marche ; ce délai peut être inférieur à 1 s à plus de 2 min.
   5. Ce qui est important, effectuer des essais où l’obstacle est absent afin d’empêcher l’accoutumance à l’obstacle et le développement d’une réaction d’évitement savant. Dans ces essais visuels sans obstacle, veiller à ce que l’obstacle n’est pas déclenché sur la passerelle avant de placer l’animal dans la zone de départ de la promenade.
   6. Observer hindleg marcher en obstacle à ce jour et sans obstacle des essais pour vérifier les comportements locomoteurs typiques et mémoire intacte obstacle visuel avant le refroidissement. S’assurer que l’animal peut franchir l’obstacle sans contact, et cette progression de quatre pattes est significativement élevée dans les essais d’obstacle à ce jour.
      Remarque : Regarder des vidéos d’essais de formation peut aider à cette vérification.
2. Mémoire d’obstacle tactiles
   1. Pour évaluer la mémoire tactile obstacle, veiller à ce que l’obstacle n’est pas déclenché sur la passerelle avant de placer l’animal dans la zone de départ de la promenade (Figure 2 b).
   2. Permettre à l’animal de marcher vers la plate-forme de la nourriture placée sur la face cachée de la fente de l’obstacle.
   3. Comme l’animal mange, lever l’obstacle sur le trottoir sous le bol à nourriture, empêchant toute entrée visuelle de l’obstacle.
   4. Que la nourriture est déplacée vers l’avant, Notez que l’animal prenne contact avec l’obstacle avec leurs pattes avant de monter dessus.
   5. Laisser l’animal à continuer à manger tout en chevauchant l’obstacle entre leurs fore - et postérieurs. Pendant ce temps, abaissez l’obstacle pour qu’il devienne affleure la passerelle pour empêcher n’importe quelles entrées plus visuelles ou tactiles.
   6. Après un délai variable, avancer les aliments une fois de plus pour encourager l’animal à reprendre pied.
   7. Ce qui est important, effectuer les essais où l’obstacle est absent et qu’aucun contact de la patte antérieure se produit pour éviter l’accoutumance à l’obstacle et le développement d’une réaction d’évitement savant.
      1. Dans ces essais tactiles sans obstacle, ont l’approche animale et mangent de la plate-forme de la nourriture, comme indiqué au point 3.2.1. Cependant, élever et abaisser l’obstacle (étape 3.2.2) avant de déplacer la nourriture vers l’avant à l’étape 3.2.3. Vous assurer qu’un délai similaire où l’animal est autorisé à continuer à manger (étape 3.2.4) précède la poursuite finale de locomotion (étape 3.2.5).
   8. Observer la hindleg marcher dans les essais d’obstacle à ce jour et sans obstacle pour vérifier les comportements locomoteurs normales et mémoire intacte obstacle visuel avant le refroidissement.

4. vidéo Analyses

NOTE : Afin d’évaluer la mémoire de l’obstacle, analyses au cours de la formation initiale et le contrôle ultérieur après implantation de la boucle de refroidissement impliquent à quantifier la hauteur étape, étape de dégagement et la distance horizontale entre l’orteil et l’obstacle au sommet de chaque étape pour paradigmes visuels et tactiles (Figure 2).

1. Analyser les vidéos à l’aide de scripts écrits personnalisés.
2. Pour chaque piste du procès, chaque pied en marquant la position de l’orteil le plus proche de la caméra tout au long de chaque étape.
3. Mesurer la hauteur d’étape de pointe comme la distance perpendiculaire entre l’orteil et la surface de l’allée au point culminant de chaque trajectoire étape (Figure 2).
4. Dans les essais d’obstacle à ce jour, mesurer le jeu d’étape comme la hauteur de marche directement au-dessus de l’emplacement de l’obstacle soustrait de la hauteur de l’obstacle.
5. En outre, mesurer la distance horizontale entre l’orteil et l’obstacle au sommet de chaque étape dans les essais d’obstacle à ce jour.
6. Confirmer que les capacités de mémoire d’obstacle sont intactes avant l’implantation de boucle refroidissement, en vérifiant que la hauteur du pic étape est élevée dans les essais d’obstacle à ce jour par rapport à marcher dans les essais sans obstacle.

5. refroidissement Implantation de boucle (Cryoloop)

1. Implant cryoloops bilatéralement sur les zones 5 et 7 selon les procédures chirurgicales rapportées antérieurement⁸ (Figure 3).
2. En bref, pour chaque hémisphère, effectuer une craniotomie et durotomy de Horsley-Clarke coordonnées²⁰ A15 à A25 pour exposer la jonction de la sulci ansate et latéraux.
3. Position des boucles en forme de tubes hypodermiques en acier inoxydable de calibre 23 avec la boucle en contact direct avec la surface corticale de zone pariétale 5 ou 7 de refroidissement.
4. Fixer la base de chaque cryoloop sur le crâne avec de l’acrylique dentaire ancré aux vis en acier inoxydable.
5. Fermer les craniotomies avec acrylique dentaire supplémentaire ; établit les marges de la peau jusqu’au bords acryliques et suture ensemble.

6. Protocole de refroidissement corticale

1. Montage expérimental
   Remarque : Avant de mettre l’animal dans la salle d’examen, le circuit de refroidissement est préparé et testé. Le circuit de refroidissement se compose d’un réservoir de méthanol avec un tuyau d’aspiration (3,2 mm O.D., 1,6 mm D.I.), une pompe à piston à mouvement alternatif et bain de glace carbonique connecté via polytétrafluoroéthylène tuyau (1,6 mm O.D., 0,5 mm D.I. ; La figure 4). En outre, un thermomètre numérique est nécessaire.
   1. Ajouter la glace sèche 500 cc à 200 mL de méthanol dans le bain de glace. Forme tube se termine bien ajusté sur l’entrée et la sortie d’une cryoloop factice pour compléter le circuit de refroidissement.
   2. Joindre la fiche de thermocouple à un thermomètre digital pour la température en continu de surveillance à l’aide d’un câble composé de deux connecteurs thermocouple mâle et un fil de thermocouple. Assurez-vous que la longueur de ce câble est suffisante pour atteindre la tête de l’animal lors d’une des extrémités sont branchée sur le thermomètre.
   3. Tourner sur la pompe à piston à l’aide de l’interrupteur.
      NOTE : Méthanol doit être établie par le réservoir, transmis par l’intermédiaire de la pompe pour le bain de glace sèche où le méthanol qui coule dans les tuyaux sera refroidi à-75 ° C. Le méthanol réfrigéré alors sortir du bain de glace et traversent la cryoloop jointe avant de retourner vers le réservoir de méthanol.
   4. S’assurer que le réglage de la pompe, longueur de tube dans le bain de glace et longueur de tuyauterie de la baignoire de glace aux boucles factices sont optimales telles que la température de cryoloop factice peut atteindre un état stable autour de-5,00 ° C.
      Remarque : Ces températures obtenus lors de cette première installation sont souvent suffisantes pour atteindre des températures d’essai de 3,0 ± 1,0 ° C lorsque le même système est utilisé pour refroidir un cryoloop implanté. Difficulté à atteindre un refroidissement suffisant peut être résolue en réglant la vitesse de la pompe, en augmentant la longueur du tube immergé dans le bain de glace, et/ou minimiser la longueur des tubes du bain de glace à la cryoloop.
   5. Si nécessaire, allonger une section de tube en enfilant l’extrémité du tube grâce à un embout de tube et l’extrémité du tube avec un épanouis à bride. Raccorder le tube d’une longueur désirée avec une extrémité de même bridée à l’aide d’un connecteur.
   6. Vérifiez que toutes les connexions sont bien ajustées et aucuns fuites ne sont présents. Une fois satisfait de l’installation initiale, arrêtez la pompe et enlever le cryoloop factice ; le circuit est maintenant prêt pour un animal de test.
2. Tests comportementaux
   1. Placez l’animal sur l’appareil d’essai. Glisser le harnais sur la tête et fixer le snuggly courroie autour de l’animal. Attacher le leash.
   2. Retirez le capuchon protecteur de la cryoloop implanté à exposer les tubes d’entrée et de sortie. Monter le tube se termine bien ajusté sur les tuyaux d’entrée et de sortie de la cryoloop. Branchez le thermocouple pour le thermomètre numérique.
   3. Commencer la séance de test avec un visuel (étape 3.1) ou la mémoire d’obstacle tactiles (étape 3.2) du procès. Suivre avec des essais supplémentaires de l’ensemble des quatre types (visual obstacle-aujourd ' hui, visual-absence d’obstacle, tactile obstacle-aujourd ' hui, tactile obstacle-absent) de façon aléatoire.
      NOTE : Une session de test typique se compose d’un bloc « chaud » des procès, où évitement d’obstacles guidée par mémoire est observée en l’absence de refroidissement afin d’établir des mesures de référence.
   4. Mettre en marche la pompe à piston et attendre le cryoloop atteindre une température de 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Ensuite, exécutez un bloc « cool » d’essais après que la pompe à piston a été activée. Au cours de ce bloc d’essais, le cas échéant, évaluer les contributions de la zone refroidie à mémoire-guidé. Veiller à ce que la température de la cryoloop est maintenue à 3,0 ± 1,0 ° C tout au long de la rame complète.
      Remarque : Tous les quatre types d’essais devraient être intercalés dans tout le bloc.
   5. Exécuter un bloc de « réchauffer » final des essais après que la pompe à piston a été coupée, et le cryoloop a renvoyé à sa température initiale.
      NOTE : Comportement stepping Baseline est rétablie au cours de ce bloc. Encore une fois, tous les quatre types d’essais devraient être aléatoirement intercalées dans le bloc.
3. Nettoyage
   1. Lorsque les tests comportementaux sont terminée, retirez la tubulure de tubes d’entrée et de sortie. Être conscient du méthanol résiduel qui peut s’écouler de l’extrémité de la tubulure et peut-être irriter l’animal.
   2. Veiller à ce que le capuchon de protection est remplacé. Enlever la laisse et le harnais avant de retourner l’animal à la colonie. Coupez les extrémités de tube (3-4 mm) à l’aide d’un coupe-tube pour empêcher les connexions qui fuites le lendemain test.

7. vérifier la mesure du refroidissement

1. À la fin des tests comportementaux, confirment que la mesure de neutralisation est restreinte à la région du cortex directement sous chaque cryoloop à l’aide de techniques déjà déclarés⁸.
   Remarque : Ceci peut être vérifié avec la thermocline cartographie¹² ou avec un thermique d’imagerie caméra^13,14,19.

Résultats

Ce protocole a été utilisé avec succès pour examiner les contributions de cortex pariétal au mémoire d’obstacle à la marche de chat¹⁹. Dans cette étude, les cryoloops ont été implantés bilatéralement sur les zones pariétales 5 et 7 sur trois adultes (> 6 mois d’âge) femelles chats (Figure 5 a). Animaux ont été évaluées dans le paradigme de mémoire tactile obstacle en l’absence de refroidissement (chaud, conditi...

Discussion

Le paradigme décrit emploie désactivations par refroidissement des zones corticales distinctes à l’aide de la cryoloop afin d’étudier la locomotion obstacle guidée par mémoire chez le chat. Les paradigmes de mémoire visuelle et tactile obstacle sont assez simples pour les animaux d’exécuter qu’ils exploitent des comportements locomoteurs naturalistes qui se produisent avec un minimum d’effort quand un animal est motivé à suivre une mouvement source de nourriture. Ainsi, la majorité de la période de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a