Kortikal katkıları engel bellek yürüyen kedi içinde çalışmaya geri dönüşümlü soğutma kaynaklı deaktivasyon

Özet

Doğal ortamlarda ekstremitelerin dikkatli koordinasyon gerektiren karmaşık hareket parietal korteks bölgelerinde içerir. Aşağıdaki iletişim kuralı parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma içinde yürüyen kedi rolünü göstermek için ters çevrilebilir soğutma kaynaklı devre dışı bırakmayı açıklar.

Özet

Karmaşık, doğal arazi üzerinde bir çevre engel ilgili duyusal bilgileri hızla kaçınma için Lokomotor hareketlerini ayarlamak için kullanılabilir. Örneğin, kedi, yaklaşan bir engel hakkında görsel bilgi kaçınma için adım modüle. Bacak tarafından beklenen bir engel ani dokunsal girdileri kaçınma için tüm dört ayak adım değiştirebilirsiniz gibi Lokomotor adaptasyon da vizyon, bağımsız ortaya çıkabilir. Bu tür karmaşık Lokomotor koordinasyon parietal korteks gibi supraspinal yapıların içerir. Bu iletişim kuralı bellek destekli engel gezisidir Cat parietal korteks katkıları değerlendirmek için ters çevrilebilir, soğutma kaynaklı kortikal etkinliğini kaldırmayı kullanımını açıklar. Cryoloops bilinen küçük soğutma döngüler aleni bir davranış onların katkıları değerlendirmek ilgi ayrı bölgeler devre dışı bırakmak için özel olarak şekillenir. Tür yöntemler parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma Cat rolünü aydınlatmak için kullanılmaktadır.

Giriş

Doğal, engebeli arazi üzerinde görme ve dokunma elde edilebilir, bir engel ilgili duyusal bilgileri hızla hareket kaçınma için değişiklik yapabilirsiniz. Sıçrama hareketleri bu dikkatli koordinasyon birden çok kortikal bölgelerde^1,2içerir. Örneğin, alan-in motor korteks^3,4 ve parietal korteks^5,6,7 engel kaçınma gibi karmaşık Lokomotor görevleri sırasında karıştığı olmuştur. Dört ayaklı hayvanlar, ayaklarından ve hindlegs engel kaçınma için gerekli adım modülasyon genişletmeniz gerekir. (Bir hayvan dikkatle karmaşık, doğal ortamda takip av izleri olarak ortaya çıkabilecek) ineklerde ve hindleg engel izni arasında ileriye doğru hareket geciktiğinde, bellekte tutulan engel hakkında bilgi Kılavuzu için kullanılır bir kez yürüyüş engel adım hindleg devam eder.

Ayrık kortikal alanlarda devre dışı bırakmak için amaçlayan deneysel teknikler bellek destekli engel gezisidir kortikal katkıları eğitim için kullanılabilir. Kortikal deaktivasyon soğutma kaynaklı bir açık davranış⁸kortikal katkıları değerlendirmek için bir tersinir, güvenilir ve tekrarlanabilir yöntem sağlar. Paslanmaz çelik boru üzerinden yapılan Cryoloops ilgi, kortikal alanı için belirli loci, son derece seçici ve ayrık etkinliğini sağlamak şekillenir. İmplante sonra soğutulmuş metanol bir cryoloop Lümen ile pompalanır korteksin hemen altındaki döngü için bölge soğur < 20 ° c Bu kritik sıcaklık altında sinaptik iletimi hemen altındaki döngü korteks bölgesinde engellenir. Böyle devre dışı bırakma sadece metanol akışının durdurması tarafından geri alınabilir. Bu yöntem duyusal işleme ve davranışları^{9,10,11,12,13,14,15} kortikal katkıları eğitim için kullanılan ^{, 16 , 17}yanı sıra sakkadik göz hareketleri¹⁸ ve bellek destekli engel gezisidir¹⁹motor kontrolü.

Bu iletişim kuralının amacını parietal kortikal alanlarda Cat Lokomotor koordinasyon için katılımı değerlendirmek için ters çevrilebilir soğutma kaynaklı deaktivasyon kullanmaktır. Özellikle, bellek destekli engel hareket veya etkin parietal korteks olmadan incelenmiştir. Bu yöntemler başarıyla parietal bölgede 5 bellek destekli engel kaçınma yürüyen kedi¹⁹rolü göstermek için kullanılmıştır.

Protokol

Tüm yordamları Ulusal Araştırma Konseyi Rehberi uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır (sekizinci baskı; 2011) ve Kanada Konseyi hayvan bakım kılavuzu bakım ve deney hayvanları kullanım (1993)'ve vardı University of Western Ontario'dan hayvan kullanım alt Komitesi hayvan bakımı üzerinde Üniversitesi Konseyi tarafından onaylanmış.

Aşağıdaki yordamı yürüyen kedi Lokomotor denetiminde kortikal katkıları eğitim deneyler için uygulanabilir.

1. cihazı

1. Engel bellek değerlendirmek için kullanılan cihazlar oluşturmak.
   Not: 18 cm yüksek açık akrilik surları tarafından (şekil 1) bir 2.43 m uzunluğunda, 29 cm geniş geçit aparatı oluşur. Dar yuvasına aparatı yarıya kadar yanında üzerine kaldırdı ya yürüme yüzey altında monte bir kolu kullanarak geçit üzerinden bir 25,8 cm geniş x 3 mm kalınlığında engel sağlar.
2. Dikkat hayvan yemek korunur emin olmak için el yükseltmek veya düşürmek engel kullanmaktan kaçının. Bunun yerine, engel yükseltilebilir veya deneyci'nın bacak deneyci hayvan besleme devam etmek izin geçit altında mandalını kullanarak indirdi.
3. Düzgün engel ortaya çıkar veya sessizce indirdi sağlamak için kolu sistemi korumak.
4. Bir küçük yükseltilmiş platform kullanın (23 cm uzun x 23 cm geniş x 16 cm yüksekliğinde) hayvan hareketlerinin yol hangi yumuşak gıda yerleştirilir üzerine.
5. Tüm denemeler geçit 1.85 m orta hat uzak üçayağa monte bir ethernet kamera (54 kare/sn) kullanarak kaydedin.

2. eğitim yordamları

Not: her hayvan düzgün test Oda ve cihazlar için acclimated davranış test önceki eğitim döneminde başarılı veri toplama için sağlar. Yeni bir ortama tekrarlanan maruz kalma şaşırtıcı veya diğer stresli davranışları azaltmada yardımcı olacak.  Calıştıkları hayvanlar arasında değişiklik gösterebilir ve eğitim 1-2 ay gerektirebilir. İlk calıştıkları oturumları 5 dakikaya kadar uzunluğu odak ve motivasyon hayvan yiyecek bağlı olabilir. Sonraki oturumlarda hayvandır (tipik olarak yaklaşık 20-25 dk) çalışmaya motive süreyi artırmak için amacı olmalıdır.

1. Olgun elde (> 6 ay-in yaş) ev ile ilgili kısa kıl cats--dan a ticari laboratuvar doğurmak herhangi bir ağırlık veya seks.
   Not: gıda ve kooperatif bir kullanım için çalışmak için motivasyon oluşturan seçim kriterleri zaman hangi hayvanlar çalışmaya dahil düşünüyor.
2. Her hayvan için 1 m uzun kira kontratı bağlı bir emniyet kemeri takıyor alışmana. Kaldırım üstünde bir rafta için belgili tanımlık kira kontratı geçit orta nokta üzerinde demir.
   Not: Bu hayvan böylece hayvan aparatı bu bölümü içinde kalmak için teşvik herhangi bir gerginlik olmadan aparatı orta kısmı boyunca yürümeyi sağlar. Böyle sınırları kurulması hareketli bir denek ile çalışmak için yararlıdır.
3. Hayvan yumuşak gıda yerleştirildiği platformdan yemek izin geçit üzerine yerleştirin.
   Not: Bu ilk eğitim bir amacı hayvan kolayca ne zaman ileriye taşındı gıda platformu izler sağlamaktır ve koşum takımı ve kira kontratı ile rahatça yürüyebilirsiniz. Pozitif takviye olarak yumuşak gıda kullanımı her eğitim veya sınama oturumu boyunca yoğunlaşmamız hayvan teşvik eder ve rahat bir çalışma ortamı destekler.
4. Hayvan nerede hayvan geçit başlangıç alanına taşınması gerekir örnekleri de dahil olmak üzere işleme, rahat olduğundan emin olun.

3. davranışsal eğitim ve iletişim kuralı sınama

Not: Engel bellek iki paradigmalar değerlendirilir: bir görsel olarak bağımlı engel bellek görev ve dokunsal bağımlı engel bellek görev. Her iki paradigmalar ilk eğitim ve sonraki sınama sırasında kullanılmalıdır.

1. Görsel engel bellek
   1. Görsel engel bellek değerlendirmek için engel geçit (şekil 2A) üzerine kaldır. Platform engel kadar yanına koyun. Hayvan geçit başlangıç alanına yerleştirmek.
   2. Hayvan platformdan yemek için sadece onun ayaklarından ile engel üzerinden adım gıda, yaklaşım sağlar.
   3. Hayvan yemeye devam ederken, herhangi bir daha fazla görsel veya dokunsal girişleri engellemek için geçit ile aynı hizada olur öyle ki engel indirin.
   4. Bir değişken gecikme süre sonrasında, tekrar yürümeye devam etmek için hayvan teşvik etmek için gıda ileriye taşımak; Bu gecikme 1'den olabilir 2 dk dan fazla s.
   5. Önemlisi, denemeler nerede engel habituation engel ve öğrenilen kaçınma yanıt gelişimi önlemek için yoktur gerçekleştirin. Böyle görsel engel yok denemeler, engel geçit hayvan geçit start alanında yerleştirmeden önce harekete geçirilen değil emin olun.
   6. Engel yok engel-günümüz ve çalışmalarda tipik Lokomotor davranışları ve soğutma önce sağlam görsel engel bellek doğrulamak için adım hindleg gözlemlemek. Hayvan temas olmadan engel temizleyebilirsiniz ve tüm dört ayak adım önemli ölçüde engel-günümüz çalışmalarda yüksek emin olun.
      Not: eğitim deneme videoları izlerken bu doğrulama yardımcı olabilir.
2. Dokunsal engel bellek
   1. Dokunsal engel bellek değerlendirmek için engel geçit hayvan geçit (2B rakam) start alanında yerleştirmeden önce harekete geçirilen değil emin olun.
   2. Hayvan engel yuvası tarafta yerleştirilmiş gıda platformu doğru yürümek izin.
   3. Hayvan yiyor gibi engel engel herhangi bir görsel giriş önleme geçit yiyecek çanak altında üzerine kaldır.
   4. Gıda ileriye taşınırken üzerine adım önce hayvan ile onların ayaklarından engel başvurmanız gerekir unutmayın.
   5. Hayvan engel kendi ön ve hindlegs arasında yayılan yeme devam etmek izin verir. Herhangi bir daha fazla görsel veya dokunsal girişleri engellemek için geçit ile aynı hizada olur, böylece bu süre boyunca, engel indirin.
   6. Bir değişken gecikme süresi bir kez daha hayvan yürümeye devam etmek için teşvik etmek için gıda ileriye taşımak.
   7. Önemlisi, nerede engel yoktur ve hiçbir ümmetlerle ilgili kişi oluşur denemeler habituation engel ve öğrenilen kaçınma yanıt gelişimi önlemek için gerçekleştirin.
      1. Çalışmalarda bu dokunsal engel yok, hayvan yaklaşım var ve gıda platformdan 3.2.1. adımda açıklandığı gibi yemek. Ancak, yükseltmek ve gıda ileri adım 3.2.3 taşımadan önce engel (Adım 3.2.2) daha düşük. Burada hayvan (Adım 3.2.4) yemeye devam izin benzer bir gecikme süresi hareket (Adım 3.2.5) son devamı önce gelir emin olun.
   8. Normal Lokomotor davranışları ve soğutma önce sağlam görsel engel bellek doğrulamak için engel yok engel-günümüz ve çalışmalarda adım hindleg gözlemlemek.

4. video analizleri

Not: engel bellek değerlendirmek için ilk eğitim ve sonraki döngü implantasyon soğutma sonra test sırasında analizleri en yüksek adım yüksekliği, adım Gümrükleme ve ayak ve her adım için doruğuna engel arasındaki yatay mesafe miktarının dahil görsel ve dokunsal paradigmalar (şekil 2C).

1. Videoları özel yazılmış komut dosyalarını kullanarak analiz.
2. Her deneme için her ayak ayak parmağı konumunu her adım boyunca kameraya en yakın işaretleyerek izlemek.
3. Ayak parmağı ve patika en yüksek noktasında her adım yörünge (şekil 2C) yüzeyine arasındaki dikey mesafe olarak zirveye adım yükseklik ölçmek.
4. Engel-günümüz çalışmalarda adım izni doğrudan engel yüksekliği tarafından düşülen engel yuvası üzerindeki adım yükseklik olarak ölçmek.
5. Ayrıca, ayak parmağı ve engel-günümüz denemeler her adımda doruğuna engel arasındaki yatay mesafe ölçmek.
6. En yüksek adım yüksekliği ile karşılaştırıldığında engel yok çalışmalarda adım engel-günümüz çalışmalarda yüksek doğrulayarak engel bellek yetenekleri soğutma döngüsü implantasyon öncesinde sağlam olduğundan emin olun.

5. soğutma döngüsü (Cryoloop) implantasyon

1. Cryoloops çift taraflı alanları 5 ve 7 daha önce raporlanmış cerrahi işlemler⁸ (şekil 3) göre üzerinde implant.
2. Kısacası, her hemisphere bir kranyotomi ve durotomy ansate ve yan sulci dönemde ortaya çıkarmak için A25 Horsley-Clarke koordinatları²⁰ A15 gerçekleştirin.
3. 23'lik paslanmaz çelik Hipodermik boru döngünün parietal alan 5 ya da 7 kortikal yüzeyi ile doğrudan temas ile gelen şeklinde döngüler soğutma bireysel konumu.
4. Her cryoloop kafatası tabanı paslanmaz çelik vida bağlantılı diş akrilik ile güvenli.
5. Ek diş akrilik ile bilgisayarçıktısı kapatır; Cilt Kenar boşlukları akrilik kenarları ve dikiş kadar birlikte çizin.

6. kortikal soğutma Protokolü

1. Deneysel Kur
   Not: test odasına hayvan getirmeden önce soğutma devresi hazır ve test. Metanol rezervuar bir Emme tüpü (3.2 mm doz, 1.6 mm kimlik), pistonlu pistonlu pompa ve politetrafloroetilen (1.6 mm doz, 0,5 mm kimlik; boru üzerinden bağlı kuru buz banyosu ile soğutma devre oluşur Şekil 4). Ayrıca, bir dijital termometre gereklidir.
   1. 200 mL metanol içinde buz banyosu 500 cc kuru buz ekleyin. Boru uçları rahatça giriş ve çıkış, bir kukla cryoloop üzerinde soğutma devreyi tamamlamak için uygun.
   2. Dijital termometre sürekli derece iki erkek ısıl konektör ve bir ısıl tel oluşan bir kablo kullanarak izleme için ısıl tak iliştirin. Bu kablo uzunluğu bir ucunu termometre takılı hayvan başkanı ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun.
   3. Anahtarını kullanarak pistonlu pompa çevirmek.
      Not: Metanol nerede boru içinde akan metanol-75 ° C'ye soğutmalı kuru buz banyosu için pompa ile geçti rezervuar çizileceğini Soğutulmuş metanol sonra buz banyosu çıkın ve metanol havzanın dönmeden önce ekli cryoloop çalıştırın.
   4. Öyle ki kukla cryoloop sıcaklık kararlı bir duruma civarında-5.0 ° C. ulaşabilirsiniz pompa ayar, buz banyosu içinde boru uzunluğu ve kukla döngüler için buz banyosu üzerinden boru uzunluğu en uygun olduğundan emin olun
      Not: Bu ilk kurulum sırasında elde böyle sıcaklıklar çoğu kez aynı sistemin bir implant cryoloop soğutmak için kullanıldığında test 3.0 ± 1.0 ° C sıcaklığa ulaşmak için yeterli. Yeterli soğutma ulaşmada zorluk içinde buz banyosu batık boru ve/veya cryoloop için buz banyosu üzerinden boru uzunluğu en aza indirme uzunluk artan pompa hızını ayarlayarak çözülebilir.
   5. Gerekirse, bir bölümü hortumunun sonuna tüp sonunda uygun bir tüpten iş parçacığı tarafından uzatmak ve tüp flanging aracıyla sonu flanş. İstenilen uzunlukta tüp ile bir benzer şekilde Flanşlı ucunu bir bağlayıcı kullanarak takın.
   6. Tüm bağlantıları rahat olduğunu ve hiçbir sızıntı bulunduğunu doğrulayın. Bir kez belgili tanımlık ilk tertibat ile razı, pompa kapatmak ve kukla cryoloop kaldırın; devre şimdi test hayvan için hazırlanmıştır.
2. Davranışsal test
   1. Hayvan test cihazları üzerinde yerleştirin. Koşum kafasına slayt ve kayış kuytu hayvan güvenli. Tasma takın.
   2. Giriş ve çıkış boruları ortaya çıkarmak için implante cryoloop koruyucu başlığını çıkarın. Biter rahatça cryoloop giriş ve çıkış boruları üzerinde boru uygun. Isıl fişi için dijital termometre takın.
   3. Görsel (Adım 3.1) ile test oturumu veya dokunsal (Adım 3.2) engel bellek deneme başlar. Tüm dört türleri ek çalışmaların takip (görsel engel-hediye, görsel engel yok, dokunsal engel-hediye, dokunsal engel-yok) bir rasgele moda.
      Not: Bellek destekli engel kaçınma temel önlemler kurmak için soğutma yokluğunda nerede görülmektedir denemelerin 'sıcak' bloğunun tipik test oturumu oluşur.
   4. Pistonlu pompa geçiş yapın ve bir sıcaklık 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 dk) ulaşmak cryoloop için bekleyin. Pistonlu pompa geçildi sonra sonra 'cool' bir blok denemeleri çalıştırın. Denemeler, bu blok sırasında gerekirse, bellek güdümlü için soğutmalı bölgenin katkıları değerlendirmek. Cryoloop sıcaklığı korunur, 3.0 ± 1.0 ° C tüm blok boyunca olun.
      Not: Tüm dört deneme türü rastgele blok serpiştirilmiş.
   5. Son 'ısıt' blok denemelerin pistonlu pompa kapalı ve cryoloop tekrar orijinal sýcaklýðýna döndü sonra çalıştırın.
      Not: Temel adım bu blok sırasında yeniden kurulan bir davranıştır. Tekrar, tüm dört deneme türü rastgele blok serpiştirilmiş.
3. Temizlik
   1. Davranışsal test sonucuna sonra tüp giriş ve çıkış boruları kaldırın. Boru uçları damla ve hayvan tahriş edebilir artık metanol bilinçli olun.
   2. Koruyucu başlığı değiştirilir emin olun. Koşum takımı ve kira kontratı hayvan koloniye dönmeden önce kaldırın. Sonraki test gününde sızan bağlantıları önlemek için bir boru kesici kullanarak boru biter (3-4 mm) kırpın.

7. soğutma ölçüde doğrulanıyor

1. Davranışsal test sonunda, devre dışı bırakma ölçüde doğrudan her cryoloop kullanarak daha önce bildirilen teknikleri⁸altında korteksin bölgesine sınırlı olduğunu doğrulayın.
   Not: Bu thermocline eşleme¹² veya bir termal görüntüleme kamera^13,14,19ile doğrulanabilir.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı başarıyla yürüyen kedi¹⁹bellekte engel parietal korteks katkıları incelemek için kullanılmıştır. Bu çalışmada, cryoloops çift taraflı parietal alanlarda 5 ve 7 üç yetişkin üzerinde implante edildi (> 6 ay-in yaş) dişi kediler (şekil 5A). Hayvanlar soğutma (sıcak, denetim durumu), ya da ne zaman alan 5 ya da 7 çift taraflı devre dışı bırakılan dokunsal engel bellek paradigmada değerl...

Tartışmalar

Açıklanan paradigma soğutma kaynaklı deaktivasyon bellek destekli engel gezisidir Cat çalışma için cryoloop kullanarak ayrı kortikal alanlarda istihdam etmektedir. Görsel ve dokunsal engel bellek paradigmalar hayvanlar için hayvan hareketli bir besin kaynağı takip için motive olduğunda, en az çaba ile oluşan doğal Lokomotor davranışları yararlanma gibi yürütmek oldukça basittir. Böylece, eğitim dönemi çoğunluğu Oda test ve Soğutma Ekipmanları hayvan acclimating için ayrılmıştır. En ha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a