Disattivazioni reversibile indotta da raffreddamento per studiare corticali contributi alla memoria di ostacolo nel gatto a piedi

Riepilogo

Locomozione complesse in ambienti naturalistici che richiedono attento coordinamento degli arti coinvolge regioni della corteccia parietale. Il seguente protocollo descrive l'uso di disattivazione reversibile indotta da raffreddamento per dimostrare il ruolo di zona parietale 5 a evitare di memoria-guida ostacolo nel gatto a piedi.

Abstract

Su un terreno complesso, naturalistico, informazioni sensoriali di un ostacolo ambientale consente di regolare rapidamente i movimenti dell'apparato locomotore per evitare. Ad esempio, nel gatto, informazioni visive su un imminente ostacolo possono modulare un passo per evitare. Adattamento dell'apparato locomotore può verificarsi anche indipendente della visione, come ingressi improvvisi tattili alla gamba da un ostacolo previsto possono modificare il rafforzamento di tutte e quattro le gambe per evitare. Tale coordinamento motorio complesso coinvolge strutture sopraspinali, come la corteccia parietale. Questo protocollo descrive l'uso di disattivazione corticale reversibile, indotta da raffreddamento per valutare i contributi di corteccia parietale alla locomozione memoria-guida ostacolo nel gatto. Piccoli anelli di raffreddamento, noti come cryoloops, sono appositamente sagomati per disattivare discrete regioni di interesse per valutare loro contributi per un comportamento evidente. Tali metodi sono stati utilizzati per delucidare il ruolo di zona parietale 5 a evitare di memoria-guida ostacolo nel gatto.

Introduzione

Su terreni irregolari, naturalistico, informazioni sensoriali di un ostacolo, che può essere acquisito tramite visione o tocco, possono rapidamente modificare locomozione per evitare. Questo attento coordinamento dei movimenti passo-passo coinvolge più regioni corticali^1,2. Ad esempio, aree della corteccia motoria^3,4 e corteccia parietale^5,6,7 sono stati implicati nel corso di attività complesse dell'apparato locomotore come evitare ostacoli. Negli animali quadrupede, modulazioni di passaggio necessari per evitare ostacoli devono estendersi a sia le zampe anteriori e posteriori. Se avanti locomozione è in ritardo tra la zampa anteriore e hindleg dagli ostacoli (che possono manifestarsi come un animale gradini attentamente attraverso una preda d'inseguimento di ambiente complesso naturalistico), informazioni sull'ostacolo mantenuto nella memoria sono usati per guidare riprende il hindleg scavalcando l'ostacolo una volta a piedi.

Tecniche sperimentali volute a disattivare aree corticali distinte utilizzabile per studiare corticali contributi alla locomozione memoria-guida ostacolo. Disattivazione corticale indotta da raffreddamento fornisce un metodo di affidabile e riproducibile di reversibile, per stabilire i contributi corticali di un comportamento evidente⁸. Cryoloops formato da un tubo in acciaio inox sono a forma di specifiche per l'area corticale di interesse, assicurando disattivazione altamente selettivo e discreti di loci. Una volta impiantato, metanolo refrigerata pompata attraverso il lume di un cryoloop si raffredda la regione della corteccia direttamente sotto il loop a < 20 ° C. Sotto questa temperatura critica, trasmissione sinaptica è inibita nella regione della corteccia direttamente sotto il ciclo. Tale disattivazione può essere invertito semplicemente smettendo il flusso del metanolo. Questo metodo è stato utilizzato per studiare la corticali contributi all'elaborazione sensoriale e comportamenti^{9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17}, così come il controllo del motore di di movimenti oculari saccadici¹⁸ e memoria-guida ostacolo locomozione¹⁹.

Lo scopo del presente protocollo è utilizzare reversibile indotta da raffreddamento disattivazioni per valutare il coinvolgimento delle aree corticali parietale per coordinamento motorio nel gatto. In particolare, locomozione memoria-guida ostacolo è stato esaminato con o senza corteccia parietale attiva. Questi metodi sono stati utilizzati per dimostrare con successo il ruolo di zona parietale 5 a evitare ostacoli memoria-guidato a piedi gatto¹⁹.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la guida del Consiglio nazionale delle ricerche per la cura e l'uso di animali da laboratorio (ottava edizione; 2011) e il Consiglio canadese su Animal Care di guida per la cura e l'uso di animali da esperimento (1993) e sono stati approvato dalla University of Western Ontario animale uso sottocommissione del Consiglio universitario sulla cura degli animali.

La procedura seguente può essere applicata agli esperimenti studiando corticali contributi al controllo motorio nel gatto a piedi.

1. gli apparecchi

1. Costruire l'apparecchio utilizzato per valutare la memoria di ostacolo.
   Nota: L'apparecchio è composto di una 2,43 m lunga, passerella larghezza 29cm racchiusa da pareti di acrilico trasparente alta 18 cm (Figura 1). Una sottile fessura a metà strada lungo l'apparato permette un ostacolo di spessore di 25,8 cm larghezza x 3 mm essere generato sul o rimosso dalla strada pedonale tramite una leva montata sotto il piano di calpestio.
2. Per garantire che l'attenzione dell'animale è mantenuto sul mangiare, evitare di utilizzare la mano per alzare o abbassare l'ostacolo. Invece, l'ostacolo può essere sollevato o abbassato usando gamba dello sperimentatore per spostare la leva sotto la passerella, permettendo lo sperimentatore continuare ad alimentare l'animale.
3. Effettuare correttamente il sistema di leva per assicurare che l'ostacolo può essere sollevato o abbassato senza rumore.
4. Utilizzare una piattaforma piccola elevata (23 cm lunghezza x 23 cm larghezza x 16 cm di altezza) su quale cibo morbido viene inserito, per guidare i movimenti dell'animale.
5. Registrare tutte le prove utilizzando una telecamera ethernet (54 fotogrammi/s) montata su un treppiede 1,85 mt dalla linea mediana della passerella.

2. procedure di formazione

Nota: Per l'acquisizione di dati di successo, un periodo di formazione precedente test comportamentali assicura che ogni animale è correttamente acclimatati alla sala prove e apparato. L'esposizione ripetuta a un ambiente novello sarà di aiuto nella riduzione di sorprendenti o altri comportamenti stressanti.  Acclimatazione può variare tra gli animali e può richiedere 1-2 mesi di allenamento. Sessioni di acclimatazione iniziale possono essere fino a 5 min in lunghezza a seconda della messa a fuoco e la motivazione dell'animale a mangiare. Le sessioni successive dovrebbero mirare ad aumentare la durata di tempo che l'animale è motivato a lavorare (in genere circa 20-25 min).

1. Acquisire maturo (> 6 mesi di età) gatti a pelo corto domestico da un allevatore di laboratorio commerciale di qualsiasi peso o di sesso.
   Nota: Motivazione a lavorare per il cibo e una disposizione cooperativa comprendono i criteri di selezione quando si considera che gli animali dovrebbero essere inclusi nello studio.
2. Acclimatare ogni animale a indossare un'imbracatura a cui è attaccato un guinzaglio lungo 1 m. Ancorare il guinzaglio per una mensola sopra la passerella sopra il punto medio della passerella.
   Nota: Questo permette all'animale di camminare lungo la parte centrale dell'apparato senza alcuna tensione, incoraggiando così l'animale a rimanere all'interno di questa porzione dell'apparato. Che istituisce tali delimitazioni è utile per lavorare con un soggetto prova in movimento.
3. Metti l'animale sul passaggio, permettendo così di mangiare dalla piattaforma su cui è posto il cibo morbido.
   Nota: Uno degli obiettivi di questa formazione iniziale è quello di garantire che l'animale segue prontamente la piattaforma di cibo quando spostata in avanti e cammina comodamente con il cablaggio e il guinzaglio. L'uso di cibi morbidi come rinforzo positivo incoraggia l'animale a rimanere concentrati durante ogni sessione di allenamento o test e promuove un ambiente di lavoro confortevole.
4. Assicurarsi che l'animale è confortevole con manipolazione, compresi i casi dove l'animale deve essere spostata in zona partenza della passerella.

3. behavioral Training e protocollo di Testing

Nota: La memoria di ostacolo è valutata in due paradigmi: un compito di memoria di ostacolo visivamente-dipendente e un compito di memoria tattile-dipendente ostacolo. Entrambi i paradigmi devono essere usati durante la formazione iniziale e successivo collaudo.

1. Memoria visiva ostacolo
   1. Per valutare la memoria visiva ostacolo, sollevare l'ostacolo sul passaggio (Figura 2A). Collocare la piattaforma sul lato estremo dell'ostacolo. Metti l'animale nella zona di partenza della passerella.
   2. Permettere all'animale di avvicinarsi al cibo, scavalcando l'ostacolo con solo le zampe anteriori per poter mangiare dalla piattaforma.
   3. Come l'animale continua a mangiare, abbassare l'ostacolo tale che diventa a filo con la passerella per prevenire eventuali ingressi ulteriormente visiva o tattile.
   4. Dopo un periodo di ritardo variabile, spostare il cibo in avanti ancora una volta a incoraggiare l'animale a riprendere a camminare; Questo ritardo può essere meno di 1 s per più di 2 min.
   5. Cosa importante, eseguire prove dove è assente al fine di evitare assuefazione l'ostacolo e lo sviluppo di una risposta di imparato evitare l'ostacolo. In tali prove di ostacolo-assente visual, assicurarsi che l'ostacolo non viene generato sul passaggio prima di mettere l'animale in zona partenza della passerella.
   6. Osservare hindleg stepping in ostacolo-assente e ostacolo presente prove per verificare i comportamenti tipici dell'apparato locomotore e memoria intatta ostacolo visivo prima del raffreddamento. Assicurarsi che l'animale può eliminare l'ostacolo senza contatto, e che un passo di tutti e quattro i piedini è elevato significativamente nelle prove di ostacolo-presente.
      Nota: Guardando i video delle prove di formazione può assistere a questa verifica.
2. Memoria tattile ostacolo
   1. Per valutare la memoria tattile ostacolo, garantire che l'ostacolo non viene generato sul passaggio prima di mettere l'animale in zona partenza della passerella (Figura 2B).
   2. Permettere all'animale di camminare verso la piattaforma di cibo posizionata sul lato opposto dello slot ostacolo.
   3. Come l'animale mangia, sollevare l'ostacolo sul passaggio sotto il piatto di cibo, impedendo qualsiasi input visivo dell'ostacolo.
   4. Come il cibo viene spostato in avanti, si noti che l'animale dovrebbe contattare l'ostacolo con le loro zampe anteriori prima di salirvi sopra esso.
   5. Permettere all'animale di continuare a mangiare mentre a cavallo tra l'ostacolo tra loro anteriori e posteriori. Durante questo tempo, abbassare l'ostacolo in modo che diventa a filo con la passerella per prevenire eventuali ingressi ulteriormente visiva o tattile.
   6. Dopo un periodo di ritardo variabile, spostare il cibo in avanti ancora una volta a incoraggiare l'animale a riprendere a camminare.
   7. Cosa importante, eseguire prove dove l'ostacolo è assente e nessun contatto di zampa anteriore si verifica per evitare assuefazione all'ostacolo e lo sviluppo di una risposta di evitare apprese.
      1. In queste prove di ostacolo-assente tattile, hanno l'approccio degli animali e mangiare tra la piattaforma di cibo, come descritto al punto 3.2.1. Tuttavia, alzare e abbassare l'ostacolo (punto 3.2.2) prima di spostare in avanti il cibo al punto 3.2.3. Garantire che un simile periodo di ritardo dove l'animale è consentito di continuare a mangiare (punto 3.2.4) precede la continuazione finale di locomozione (punto 3.2.5).
   8. Osservare la hindleg un passo nelle prove ostacolo-assente e ostacolo presente per verificare comportamenti motorio normali e memoria intatta ostacolo visivo prima del raffreddamento.

4. video analisi

Nota: Per valutare la memoria di ostacolo, analisi durante la formazione iniziale e successivo collaudo dopo il raffreddamento l'impianto ciclo comportano quantificare l'altezza di passaggio di picco, gioco di passo e la distanza orizzontale tra la punta e l'ostacolo all'apice di ogni passaggio per sia visivi che tattili paradigmi (Figura 2).

1. Analizzare i video utilizzando script personalizzati scritti.
2. Per ogni prova, è possibile verificare ogni piede contrassegnandone la posizione della punta piu vicino alla webcam durante ogni passaggio.
3. Misurare l'altezza di passaggio di picco come la distanza perpendicolare tra la punta e la superficie della passerella nel punto più alto in ogni traiettoria di passaggio (Figura 2).
4. Nelle prove ostacolo-presente, misurare il gioco di passaggio come l'altezza di passaggio direttamente sopra la fessura di ostacolo sottratta dall'altezza dell'ostacolo.
5. Inoltre, misurare la distanza orizzontale tra la punta e l'ostacolo all'apice di ogni passo nelle prove ostacolo-presente.
6. Confermare che le capacità di memoria di ostacolo sono intatte prima del raffreddamento dell'impianto ciclo verificando che l'altezza di passaggio di picco è elevata nelle prove ostacolo-presente in confronto ad un passo nelle prove ostacolo-assente.

5. Loop (Cryoloop) l'impianto di raffreddamento

1. Impianto cryoloops bilateralmente nelle aree di 5 e 7 secondo procedure chirurgiche precedentemente segnalati⁸ (Figura 3).
2. In breve, per ogni emisfero, eseguire una craniotomia e durotomy da Horsley-Clarke coordinate²⁰ A15 a A25 per esporre all'intersezione con i solchi ansati e laterali.
3. Posizione individuale a forma da 23 gauge acciaio tubazione ipodermico con il ciclo a diretto contatto con la superficie corticale della zona parietale 5 o 7 cicli di raffreddamento.
4. Fissare la base di ogni cryoloop al cranio con dentale acrilico ancorato alle viti in acciaio inox.
5. Chiudere le craniotomie con ulteriore acrilico dentale; redigere i margini di pelle fino ai bordi acrilici e suturare insieme.

6. protocollo di raffreddamento corticale

1. Messa a punto sperimentale
   Nota: Prima di portare l'animale in sala prove, il circuito di raffreddamento è preparato e testato. Il circuito di raffreddamento è costituito da un serbatoio di metanolo con un tubo di aspirazione (3,2 mm O.D., 1,6 mm di diametro), una pompa a pistone scambiantesi e ghiaccio secco bagno collegato tramite tubazione del politetrafluoroetilene (1,6 mm O.D., 0,5 mm di diametro; Figura 4). È inoltre richiesto un termometro digitale.
   1. Aggiungere 500 cc a secco ghiaccio per 200 mL di metanolo in bagno di ghiaccio. Tubi forma termina comodamente sopra l'entrata e l'uscita di un fittizio cryoloop per completare il circuito di raffreddamento.
   2. Collegare il connettore termocoppia ad un termometro digitale per temperatura continuo monitoraggio utilizzando un cavo composto da due connettori per termocoppie maschio e un cavo di termocoppia. Assicurarsi che la lunghezza di questo cavo è sufficiente per raggiungere la testa dell'animale quando un'estremità è collegata il termometro.
   3. Accendere la pompa a pistone con l'interruttore.
      Nota: Metanolo dovrebbe essere redatto dal serbatoio, passato attraverso la pompa per il bagno di ghiaccio secco dove il metanolo che scorre nel tubo sarà raffreddato a-75 ° C. Il metanolo ghiacciato sarà quindi uscire il bagno di ghiaccio ed eseguire attraverso l'allegato cryoloop prima di ritornare al serbatoio del metanolo.
   4. Assicurarsi che l'impostazione della pompa, lunghezza della tubazione all'interno del bagno di ghiaccio e lunghezza di tubo dal bagno di ghiaccio per i loop fittizi sono ottimali, tali che la temperatura di cryoloop fittizio può raggiungere uno stato di costante intorno a-5,00 gradi.
      Nota: Tali temperature raggiunta durante questa configurazione iniziale sono spesso sufficienti a raggiungere temperature di prova di 3,0 ± 1,0 ° C, quando lo stesso sistema è utilizzato per raffreddare un cryoloop impiantato. Difficoltà nel raggiungere un raffreddamento sufficiente può essere risolto regolando la velocità della pompa, aumentando la lunghezza del tubo sommerso all'interno del bagno di ghiaccio, e/o riducendo al minimo la lunghezza del tubo dal bagno di ghiaccio per il cryoloop.
   5. Se necessario, allungare una sezione della tubazione infilandone l'estremità del tubo attraverso un montaggio di estremità del tubo e flangia all'estremità del tubo con un cartellatore. Collegare il tubo della lunghezza desiderata con un similmente flangiate fine utilizzando un connettore.
   6. Verificare che tutte le connessioni sono aderente e perdite non sono presente. Una volta soddisfatti con la configurazione iniziale, spegnere la pompa e rimuovere la cryoloop fittizio; il circuito è ora pronto per un animale di prova.
2. Test comportamentali
   1. Metti l'animale sull'apparecchiatura di collaudo. Far scorrere la cintura sopra la testa e fissare il cinturino snuggly intorno l'animale. Collegare il cordino.
   2. Rimuovere il cappuccio protettivo del cryoloop impiantato per esporre i tubi di entrata e di uscita. Montare la tubazione estremità comodamente sopra i tubi di entrata e di uscita della cryoloop. Collegare la spina di termocoppia per il termometro digitale.
   3. Iniziare la sessione di test con una visuale (punto 3.1) o tattile (punto 3.2) ostacolo memoria prova. Seguire con ulteriori prove di tutti i quattro tipi (visual ostacolo-presente, visual ostacolo-assente, tattile ostacolo-presente, tattile ostacolo-assente) in modo casuale.
      Nota: Una tipica sessione di test è costituito da un blocco 'caldo' di prove, dove evitare ostacoli memoria-guida è osservato in assenza di raffreddamento per stabilire misure della linea di base.
   4. Accendere la pompa a pistone e attendere per la cryoloop di raggiungere una temperatura di 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Quindi, eseguire un blocco 'cool' di prove dopo aver acceso la pompa a pistone. Durante questo blocco delle prove, se necessario, valutare il contributo dell'area raffreddato a memoria-guida. Assicurarsi che la temperatura della cryoloop è mantenuta a 3,0 ± 1,0 ° C durante tutto l'intero blocco.
      Nota: Tutti i quattro tipi di prova dovrebbero essere sparpagliati in modo casuale in tutto il blocco.
   5. Eseguire un blocco 'riscaldare' finale delle prove dopo la pompa a pistone è stato spento, e il cryoloop ha restituito alla sua temperatura originale.
      Nota: La linea di base passo-passo comportamento è ristabilita durante questo blocco. Ancora una volta, tutti i quattro tipi di prova dovrebbero essere sparpagliati in modo casuale in tutto il blocco.
3. Pulizia
   1. Quando il test comportamentali sia completato, è possibile rimuovere il tubo dalla tubi di entrata e di uscita. Essere cosciente di metanolo residuo che può gocciolare dalle estremità della tubazione e può irritare l'animale.
   2. Assicurarsi che il cappuccio protettivo viene sostituito. Rimuovere il guinzaglio e imbracatura prima di restituire l'animale alla Colonia. Tagliare le estremità di tubi (3-4 mm) utilizzando un tagliatubi per impedire connessioni che perde il giorno successivo collaudo.

7. verificare l'entità del raffreddamento

1. Alla fine dei test comportamentali, confermare che la portata di disattivazione è limitata alla regione della corteccia direttamente sotto ogni cryoloop utilizzando tecniche precedentemente segnalati⁸.
   Nota: Questo può essere verificato con termoclino mappatura¹² o con un thermal imaging fotocamera^13,14,19.

Risultati

Questo protocollo è stato usato con successo per esaminare i contributi di corteccia parietale alla memoria di ostacolo a piedi gatto¹⁹. In questo studio, cryoloops sono stati impiantati bilateralmente sopra aree parietali 5 e 7 in tre adulti (> 6 mesi di età) gatti femminili (Figura 5A). Gli animali sono stati valutati nel paradigma della memoria tattile ostacolo in assenza di raffreddamento (caldo, condizione di controllo), o quand...

Discussione

Il paradigma descritto impiega indotta da raffreddamento disattivazioni delle aree corticali discrete utilizzando il cryoloop al fine di studiare la locomozione memoria-guida ostacolo nel gatto. I paradigmi di memoria visiva e tattile ostacolo sono abbastanza semplici per gli animali da eseguire come sfruttano naturalistici locomotore comportamenti che si verificano con il minimo sforzo, quando un animale è motivato a seguire una movimento fonte di cibo. Così, la maggior parte del periodo di addestramento è dedicata a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a