JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Abstract

הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג'ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג'ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.

Introduction

Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג'ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.

השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילויות פנאי דיג בארצות הברית. יש צורך להגדיל ללמוד גנומיקה תפקודית ב ערוץ שפמנון ומגביר את רצף הגנום המלא של ערוץ שפמנון השירות של התפתחויות אחרונות הגנום-6,כלים-עריכה-7. להבנת תפקוד הגן לא רק להעשיר את המחקר מתנהל על שפמנון, אך גם להוביל תוכניות שיפור גנטי יעיל יותר כדי לשפר את תעשיית שפמנון. ברגע גנים קריטי עבור תכונה נתונה עניין מזוהים, הם יכולים לשמש לשיפור גנטית שפמנון ייצור באמצעות הגנום עריכה כדי להפיק תועלת אללים, הבחירה עבור אלה אללים, דיכוי של אללים מזיקה, העברת אללים מועיל דרך transgenesis, או שילוב של אפשרויות אלה. שילוב של הגנים הטובים ביותר עבור תכונות מועילות מסחרית שונים מ מינים שונים של דגים אחד לשפר במידה רבה פריון ורווחיות של דגים הפקה פעילות8.

נוקאאוט גנטי היא שיטה ישירה ללמוד ג'ין פונקציות בתוך vivo. מוטציות סמני דנ א תעבור בירושה לדורות אשר יקל את חקר ההשפעות שלהם בדורות שונים. כלי עריכה הגנום שונים יש כבר מפותחת כולל אבץ אצבע nucleases (ZFNs), תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs), מקובצים באופן קבוע interspaced קצר palindromic חזרה/CRISPR-הקשורים חלבון 9 (CRISPR/Cas9 ) מערכת9,10,11,12.

מערכת CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה, יעיל ששימש לעריכת רצפי דנ א גנומי כולל נוקאאוט גנטי בדגים עד מונחה RNA ספציפי לאתר ה-DNA המחשוף5,13. המערכת מורכבת RNA מדריך (gRNA), אשר קובע את רצף יישוב הגנום, אנזים endonuclease דנ א, Cas9. ניתן לעצב את מערכת CRISPR/Cas9 היעד כל רצף הגנום עם מספר יתרונות על ZFNs ועל TALENs: נמוך (1) עלות (2) קל הנדסה קשירה (3) יותר ספציפי של מדריך RNA רצף המטרה, צמצמה את המטרה מוטציות (4) ניתן לפלח רצפים מרובים עם gRNA שונים באותו זמן (5) מוטגנזה מכוונת גבוה קצב גנים יכול לא להיות מוטציה על ידי TALENs, (6) קצב השידור germline משופרת של מוטציות עבור עד 6-fold בהשוואה ZFNs, TALENs14, 15,16,17,18.

שיטת אלטרנטיבית הראשי עבור microinjection היא אלקטרופורציה, שבו מוחלות דחפים חשמליים העוברים או לתאים להגברת חדירות הממברנה ואת ספיגת של מולקולות ביולוגיות19,20. מספר דגים הטרנסגניים נוצרו באמצעות אלקטרופורציה כגון ערוץ שפמנון, שישן (Sparus sarba), סלמון צ'ינוק (Oncorhynchus tshawytscha), דג זברה (רזבורה rerio), medaka (Oryzias latipes), נפוץ קרפיון (קרפיון carpio)21,22,23,24,25,26.

אלקטרופורציה שימש כדי לספק חלבון ה-DNA, RNA ו- Cas9 פלסמיד עבור נוקאאוט גנטי. בתרבית של תאים, Cas9/gRNA פלסמיד ה-DNA, Cas9 mRNA/gRNA, Cas9 חלבון/gRNA מתחמי נשלחו באמצעות אלקטרופורציה, תעריפי מוטגנזה מכוונת הגבוהה ביותר באמצעות קומפלקסים של חלבונים/gRNA Cas9 עבור אלקטרופורציה רוב התנאים נבדקו27. Ascidian מיתרניים (Ciona intestinalis), היו TALENs המבטאת מבנים electroporated לתוך הביצים לזירוז נוקאאוט של גנים מרובים28. ZFNs לבטא פלסמיד בונה היו electroporated לדפוק את הורמון מחלמן שפמנון ערוץ29. עם זאת, ברגע הציג לתוך התא, בונה פלסמיד יהיה עליך להיות עיבד את ה-RNA, תרגם חלבונים פונקציונליים לפני בהם ניתן לסמן את רצף ה-DNA הרצוי, אשר סביר להניח יעכב את הזמן של מוטגנזה מכוונת לעומת microinjection של RNA / חלבון. כאשר העובר מתפתח, מוטגנזה מכוונת מושהית מגביר את פסיפס של מייסדי מוזרק. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים סביר להשגת רמת ביטוי אפשרי עם microinjection, מוריד את היעילות מוטגנזה מכוונת.

כאמצעי ידביקו כלי עריכה הגנום בתאים, microinjection יש כמה יתרונות על פני אלקטרופורציה. הגנום עריכה מולקולות שיוכל אמינה להיכנס לתוך התאים או עוברי דרך microinjection30. חומר ההזרקה פחות נחוץ. . זה קל לקבוע את הכמויות של חומר מוזרק... מוטציה גבוהה המחירים עם פסיפס נמוך ב הדג מייסד יכולה להיות מושגת אשר תשפר germline שידור של מוטציות F1. דגים מייסד פחות צריך להיות מנותח כדי לייצר את הדור הראשון, עקב קצב מוטציה גבוהה יותר. אלקטרופורציה, עוד דגים מייסד צריך להיות מנותח אשר יגדיל עלויות. עם זאת, ההישרדות של ערוץ שפמנון microinjected עוברי הוא נמוך יותר electroporated אלה, אבל זה ניתן להתגבר על ידי הזרקת העוברים עוד31,32. ערוץ שפמנון, ההישרדות של microinjected-חלמון עוברי נע בין 16 ל- 55%, בהתאם הגנים מהווים מטרה, את המינון של חלבון gRNA/Cas932.

Microinjection קבוע של שפמנון העוברים הוא תובעני מבחינה טכנית, זמן רב, עם זאת, פרוטוקול microinjection חלבון CRISPR/Cas9 מהיר ויעיל מוצג עבור ערוץ שפמנון עוברי. פרוטוקול זה דורש פחות זמן ומומחיות מאז הפתרון חלבון CRISPR/Cas9 מוזרק לתוך החלמון של עוברי לתא אחד. יכול להיות מוזרק מאות הביצים ב h 1 (כ הזמן הדרוש עבור ליגה תא להתרחש). כדי לאמת את הפרוטוקול, שני גנים למחלות הקשורות הרגישות קיבלת מכה שפמנון ערוץ, את האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, הגן לקטין (RBL) מחייב rhamnose. 1 טיקם מעורב מסלול איתות שיזם קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3. ערוץ שפמנון, טיקם 1 היה דרמטי upregulated בעקבות האתגר חיידקי עם Edwardsiella ictaluri, עוד הייתה downregulated ב כחול שפמנון, עמיד ictaluri ה33מינים. RBL ממלא תפקיד חשוב ב זיהום מוקדם עם Flavobacterium columnare, סוכן סיבתי של מחלת columnaris, שבו חריפה, קולטנים upregulation חזקים נרשמה זן שפמנון ערוץ columnaris, רגישים בהשוואה זן עמיד columnaris34.

Protocol

ניסוי זה נערך היחידה לחקר הגנטיקה של דגים, אי מעטפת וו הדיג מרכז מחקר, אוניברסיטת אובורן, AL. כל הפרוטוקולים ניסיוני השתמשו בניסוי זה אושרו על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (AU-IACUC) לפני הניסוי היה יזם. רשימה של ציוד ואספקה השתמשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת חומרים. להלן הצעדים ואת הנהלים והכנה microinjection של שפמנון ערוץ אחד-תא עוברי כמופיע באיור1.

1. בחירת מניות והובילו להרהר

  1. לבחור בריא שפמנון ערוץ המניות שבוחרים זן או קו הגנטית של עניין. ערוץ שפמנון זכרים ונקבות צריך להציג מאפייני המין המשניים טוב.
  2. בחר גברים שיש להם ראש שרירים רחבה רחבה יותר שאר גופם מפותח papilla באברי המין. צבע כהה, צלקות, פצעים מן הלחימה טריטוריאלית הינם סימנים של המוכנות המינית. בחר לנקבות יש ראשים כי הם צרים יותר שאר הגופות שלהם, ויש על הבטן רכה, מוחשי, ואמיתיות. דיוק וכדי להימנע והדגיש את הדגים במהלך הטיפול הראשוני, תפסיקי להאכיל הנקבות 2-3 ימים לפני שבחן את המוכנות שלהן כדי להשריץ.
  3. מבצע דגים טיפול מהר, אבל בזהירות. כדי להפחית את הלחץ של הטיפול, לבצע כל ההליכים המחייבים טיפול הנקבות תוך החזקת דגים ההשרצה שקיות (רשת שינוי של גודל 32 מ מ).
  4. לפני הזרקת הורמון לזירוז ביוץ, מודדים את משקל הגוף של הנקבות.
  5. לתלות את השקיות ההשרצה עם נקבות בתוך זרם דרך טנק עם זרימת מים רציפה, אוורור נאותים.
  6. גילוח ורחיצה כירורגית, טען את implanter בעל מחט 14 G עם µg 85/kg של הורמון מחלמן משחרר הורמון אנלוגי השתל (LHRHa). לשטוף ההזרקה (השרירים הגבי) עם תמיסת מלח סטרילית 0.9% לפני הזריקה. הכנס את implanter בזווית של 45° ולשחרר את השתל. לשלוף את המחט ואת נשמטים ההזרקה עם כדור צמר גפן טבול בעבר ב- 70% אתנול.
  7. המקום השקית ההשרצה של המיכל כך הדג לגמרי שקוע בתוך מים 15-20 ס מ מתחת לפני המים. אוורור נאותים (מעל 5 ppm התפרקה חמצן) ואיכות מים טובים חשובים עבור ביוץ של ביצים באיכות גבוהה.
  8. לחזות את זמן הביוץ בהתבסס על טמפרטורת המים באמצעות היחסים מעלות שעות ביממה (h)35. זמן התגובה מעלות-h = זמן בין הזרקת הורמון הביוץ (h) * מים בטמפרטורה (° C). לדוגמה, עבור זמן תגובה מעלות-h של 900-1, 000, נקבה צפוי כדי להשריץ ב 36-40 שעות מעת הזרקת הורמון ב 25 º C. בדרך כלל, הבדיקה הראשונה של ביצים נעשה בערך 36 שעות לאחר הזרקת הורמון ולאחר מכן במרווח 4 שעות.
  9. כדי לבדוק אם הביוץ, הרם בעדינות את השקית ההשרצה מעל פני המים בזמן שאתה מחפש את הביצים המצורפים בתוך השקית ההשרצה. לראות לפחות 10 ביצים מציין שהנקבה הזו היא הביוץ ומוכן יד בנוכחות אחר.

2. זרע הכנה

הערה: זרע ניתן להכין כמה שעות לפני מועד הביוץ הצפוי.

  1. המתת חסד זכרים ע י מכה בראש ללא הרדמה, כאלו מאז הרדמה עלולה להיות בעלת השפעה שלילית על תנועתיות הזרע.
  2. לאסוף את האשכים במחבת קטנה במשקל, להסיר כל רקמות, ולשטוף אותם עם 50-מ ל תמיסת 0.9% כדי להסיר דם, במידת הצורך. האשכים מפותחת הם לבן עם תחזיות villiform רבים ( איור 2).
  3. לקבוע את המשקל של האשכים.
  4. כדי להכין את הפתרון הזרע להפריה ביצה, להעביר את האשכים המרכז של 100 ס מ2 100 מיקרומטר רשת שינוי באמצעות מלקחיים. מקפלים רשת השינוי עם האשכים בפנים, למחוץ את האשכים ולסנן את הזרע לתוך צינור אוסף 50 מ. ניתן לבצע זאת על ידי הפעלת לחץ על האשכים בתוך רשת השינוי נגד בקצה הצינור אוסף באמצעות האגודל. השתמש 0.9% תמיסת לשטוף את הזרע של רשת השינוי לתוך הצינור אוסף. תמיסת ניתן להוסיף עד 10 מ"ל/g של האשכים.
  5. קביעת ריכוז הזרע, בדוק את תנועתיות ואת הכדאיות.
    הערה: ריכוז יכול להיקבע על ידי ספירת תאי הזרע באמצעי אחסון מדולל הידוע של מילט באמצעות של hemocytometer. לחלופין, צפיפות הזרע יכול להיות מוערך על-ידי הערכת הצפיפות האופטית של מילט באמצעות ספקטרופוטומטרים. בשיטה זו, הספיגה-גל nm 505 מושווה תרשים בקרה הוכן קודם לכן על קליטתם של ריכוזים שונים של זרע36. תנועתיות הזרע ניתן לבדוק תחת המיקרוסקופ כמו הפעם מהפעלה של הזרע עד הפסקת זרע תנועה (נקרא תנועתיות משך)37. הכדאיות של זרע יכול להיקבע על ידי מכתימה את הזרע עם צבע בררני כגון trypan blue, אשר יהיה כתם תאי זרע רק כלכלית, ואילו זרעים יישאר וללא רבב. עם זאת, עבור הניתוחים microinjection, זה לא נחוץ אם האשכים מפותחים היטב.
  6. לאחסן זרע ב- saline 0.9% משלב 2.5-4 ° C ולהשתמש בתוך 24 שעות לאחר ההכנה.

3. ביצה אוסף, הפריה

  1. למרוח שכבה דקה מאוד של צמחי עד קוטר 20 ס מ נקי. יבש ההשרצה פאן.
  2. למקם את הנקבה הפתרון הרדמה המכיל 100 ppm של tricaine במאגר מתאן סולפונאט עם סודיום ביקרבונט (ה-pH של הפתרון הסופי צריך להיות 7.0) עד הדג הוא מורדם לחלוטין38.
    התראה: Tricaine מתאן סולפונאט עלול להיות מעצבן אם נשאף, בלע או נספג דרך העור.
  3. . בזהירות, להסיר את הדג מן השקית ההשרצה וטובל ב- saline 0.9% לשטוף את הפתרון הרדמה. לייבש את הדגים לחלוטין בעזרת מגבת נקייה, הימנעות ההסרה של השכבה ריר על פני גוף הדג.
  4. החל לינוק ירקות לאיזור סביב האוורור, כולל את הסנפירים האגן, כדי למנוע החזקה של הביצים במהלך היד בנוכחות אחר.
  5. יד להפשיט את הביצים לתוך התבנית המשומנת ההשרצה על ידי הפעלת לחץ עדין השחלות. ביצים טוב צריך לזרום בחופשיות, מצהוב-זהוב בצבע ויש מינימלי אין גושים או קרישי דם (איור 2). יש למנוע מגע בין ביצים ומים לפני ההפריה, כמו מים יכול לעורר micropyle הסגר.
  6. כדי להפרות את הביצים עבור microinjection, להעביר 200 – 300 ביצים משומנת ההשרצה. מפעל פלסטיק שמנונית תוויות יכול לשמש כמו כפית כדי להעביר ביצים התבנית המשומנת ההשרצה. מוסיפים 1-2 מ של הפתרון זרע (מתוך שלב 2.5) הביצים ומערבבים בעדינות. היחס של הזרע אל הביצית צריכה להיות כ זרע/ביצה 11,000.
  7. להוסיף מים מתוקים על הביצים כדי להפעיל את הזרע ואת הביצים. מוסיפים מים לכיסוי מעט את הביצים. מערבולת בעדינות את הביצים עבור הפריה ס' 30 צריכה להתרחש ב- 1-2 דקות. חשוב לדשן ביצים אשר מסודרים בשכבה אחת בלבד. שפמנון ביצים לדבוק אחד את השני ומקשה על microinject שכבות מרובות של העוברים.
  8. להוסיף יותר מים מתוקים על הביצים ולאפשר את הביצים להקשיח למשך 10-15 דקות.
  9. מכסים את התבנית ההשרצה המכילה את הביצים הנותרות מופרית על-ידי מגבת רטובה כדי למנוע ייבוש, לדשן במשך כמה שעות. הפריה יכול להיעשות באופן רציף, לדוגמה, אצווה אחת של 200 – 300 ביצים יכולה להיות מופרית כל 30-60 דקות להבטחת אספקה רציפה של העוברים בשלב תא אחד עבור microinjection ושליטה ללא הזרקת עוברי. יש למנוע מגע בין מגבת רטובה את הביצים כמו הביצים עשויים לדבוק מגבת רטובה ולכן קשה להסיר אותם. פרוטוקול זה, ביצים מופרית תוך 2-3 h אחרי ששללו היו microinjected ביעילות, היה להצלחה דומה ביצים מופרית מיד לאחר בנוכחות אחר.

4. המחט משיכת וטעינה

  1. משוך על נימי זכוכית בורוסיליקט OD 1.0 מ מ לתוך 2 מחטים (איור 3). אחסן את המחטים בתוך קופסה נייר עם חתיכת ספוג שבו נעשו מספר חתכים. כדי למנוע את שבירת המחט, הקוטר של הספוג צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הגבעול מחט.
  2. פתח את מחט על ידי שבירת חלק קטן הדק באזור של המחט באמצעות חפץ חד. לחלופין, פתח את המחט על ידי צובט את האזור הדק של הקצה עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ.
  3. הכן את הפתרון הזרקת על ידי ערבוב gRNA(s) עם חלבון Cas9. סוגים אחרים של RNA או החלבון גם יכול להיות מוזרק עם ההליך אותו. ב פרוטוקול זה, gRNAs היו נועדה מטרה שתיים של ערוץ שפמנון המערכת החיסונית קשורים גנים, אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) מחייב rhamnose, המוכנים לפי שאה ואח. עם השימוש דיוק גבוה Taq פולימראז32,39. המטרות גנומית עבור gRNAs היו 5' לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה GGT גה GCA מס רווחי הון CGA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה 3' עבור טיקם 1 ג'ין (איור 4) ו- 5' לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה CTT TGA GTC לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה גה חברתנו G 3' עבור אקסון 1 לייעו RBL עם מוטיב סמוך protospacer (פאם) רצף בקו תחתון (איור 6).
    1. הפיצוץ מטרות מדריך RNA כנגד הגנום ערוץ שפמנון רצף ובחר אלה עם אין אתרי חופש-יעד פוטנציאליים.
    2. להוסיף פנול אדום צבע החלבון gRNA/Cas9 לערבב כדי שליש מהנפח הכולל.
    3. להתאים את הריכוז הסופי של החלבון gRNA/Cas9 לערבב עם מים חינם נוקלאז כך כל העובר מוזרק עם 50 nL המכיל כ 2.5 ng gRNA וחלבון ng Cas9 7.5. דגירה את התערובת למשך 10 דקות על הקרח לפני השימוש.
  4. כאשר microloader, טען µL 5 – 10 של תערובת gRNA/Cas9 לתוך המחט הזרקת על-ידי הוספת את microloader לתוך הגבעול מחט וגירשו את התערובת באיטיות תוך פותחים את הטיפ microloader (איור 3). למנוע השמנה בועות אוויר בתוך.
  5. לצרף את המחט בעל micropipette להבטיח חיבור חזק, ואז לצרף המחזיק micromanipulator. ודא לחופש תנועה יציבה. הפעילו לחץ על microinjection על-ידי פתיחת הגליל חנקן והזזת את וסת הלחץ.
    הערה: עוצמת הזריקה יכולה להיות מושפעת הלחץ, קוטר הצמצם המחט ומשך ההזרקה. כדי לקבוע את עוצמת הקול כדי להזריק, מזריקים לתוך טיפה של שמן מינרלי מונחת על hemocytometer. אם יש צורך, הלחץ, משך הזרקה, ואת קוטר המחט יכול להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את עוצמת הזריקה. מזריקים מספר פעמים לתוך שמן מינרלי כדי להבטיח נפח עקבית.

5. microinjection של העוברים שפמנון

  1. למרוח שכבה דקה מאוד של צמחי על צלחת פטרי נקי 100 מ מ.
  2. באמצעות תווית שמנונית מפעל פלסטיק, להעביר 50 – 100 ביצים למחבת הפריה הפטרי, לכסות אותם עם הפתרון של Holtfreter (חומרים טבלה). יישר את הביצים אחד נגד השני בשכבה אחת בלבד. יישור זה אמור להחזיק את הביצים במקום במהלך תהליך microinjection.
  3. מניחים על צלחת פטרי עם הביצים על השלב של המיקרוסקופ והחזק אותו עם יד אחת. להנמיך את המחט ביד האחרת (איור 3) עד זה מפלח את chorion ואת החלמון בתנועה אחת חלקה. קצה המחט צריך להיות הכי קרוב ככל האפשר כדי blastodisc לפני מסירת החומר הזרקה.
    1. לדכא את דוושת ולהעביר את החומר הזרקה לתוך החלמון. אם blastodisc לא נראה בבירור, הזרקת החומר יכול להיות להתפשט לתוך במקומות שונים בהחלמון. כדי לעשות זאת, המחט מוחדרת לקצה הרחוק של החלמון, ולאחר מכן מדכא את דוושת וחוזר חלילה את המחט נעשים בו זמנית כדי להפיץ את החומר הזרקה דרך אזורים שונים של החלמון. עד 50 nanoliters יכול להיות מוזרק לתוך החלמון של ערוץ שפמנון עוברי, עם זאת, כמות החלבון gRNA/Cas9 צריך להיות מותאם עבור כל ג'ין להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור מוטציה קצב ואת העובר הישרדות32.
  4. . משכי את המחט בצורה חלקה כדי לא לגרום נזק הביצה. הזז את צלחת פטרי להחדיר ביצה נוספת לאותו התהליך. הימנע תנועת הפטרי בעת תהליך ההזרקה כמו זה עלול לגרום נזק הביצה או תשבור את המחט. הסר ביצים קרוע או ניזוק עקב microinjection. הזרקת ניתן להתחיל 15-20 דקות לאחר ההפריה ולהמשיך כל עוד העוברים נמצאים עדיין בשלב תא אחד (עד בערך 60-90 דקות לאחר ההפריה).
  5. מקום עוברי מוזרקים חזרה הפתרון של Holtfreter עם 10 עמודים לדקה של דוקסיציקלין ו לערבב בעדינות רציפה במשך 6-7 ימים עד הבקיעה40. לשנות את הפתרון מדי יום ולהסיר את העוברים מת.

6. זיהוי המוטציה

  1. באופן אקראי, לאסוף את מספר העוברים מוזרק ב 72 h שלאחר ההפריה, להסיר את החלמון ולחלץ הדנ א. כוללות 3-5 ללא הזרקת עוברי פקד.
    הערה: הדנ א הגנומי יכול להיות מופק העוברים לאחר הסרת קליפות ביצה, חלמון חומר באמצעות עיכול proteinase K ואתנול משקעים32.
  2. להגביר את מקטע ה-DNA איגוף המטרות גנומית עבור gRNA של כל גן, שבו מוטציות צפויים להופיע, שימוש של דיוק גבוה Taq פולימראז32. עבור טיקם 1, תחל 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (קדימה) 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (הפוכה) שימשו כדי להגביר את 750 bp בזמן RBL, תחל 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (קדימה) ו 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (הפוכה) היו רגילים להגביר את קטע bp 375 מן הגן RBL.
    1. השתמש התגובה PCR הבאים: עד 20 µL PCR כיתה מים; דיוק גבוה x 1 מאגר תגובת האנזים Taq עם MgCl2, מ מ 0.2 dNTP לערבב, מיקרומטר 0.4 לכל אחד הראשיים ואחורה. של אותה קבוצה, 100-300 ng הדנ א ויחידות 1.25 מתערובת אנזים Taq דיוק גבוה. לבצע PCR תנאי הרכיבה: דנטורציה הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורי דנטורציה ב 94 ° C ל 30 s, חישול ב 60 מעלות צלזיוס במשך 55 s עבור טיקם, ו- 40 s עבור RBL, סיומת ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה/kb; והסיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות.
  3. לזהות את העוברים מוטציה באמצעות שיטה לזיהוי מוטציה כגון רצף של מוצרי ה-PCR מטוהרים, מודד מוטציה זיהוי assay, heteroduplex ניידות assay, אובדן של אנזים הגבלה זיהוי האתר, או כל מוטציה זיהוי שיטה אחרת זה מתאים למטרה. ב פרוטוקול זה, לזהות מוטציות עוברי שימוש assay זיהוי המוטציה מודד טיקם 1, אובדן של אנזים הגבלה ש-sapi לחתוך באתר, כמו גם רצף של מוצרי ה-PCR מטוהרים RBL ג'ין.
  4. כדי לזהות אללים mutant, לשכפל PCR מוצרים ווקטורים רצף של מושבות בודדות. אללים mutant המוצגים באיור 4 ו- 6 איור בא מן העוברים מוזרק. מוצרי ה-PCR 6-microinjected, העוברים בקרה 3 עבור כל ג'ין היו איחדו שני צינורות נפרדים, אחד עבור עוברי microinjected, השני עבור עוברי שליטה במהירות משובטים ווקטורים 86 עבור 1 טיקם ווקטורים 48 עבור RBL ג'ין וסודרו, כולל 8 קביעת רצף תגובות 3 שליטה ללא הזרקת העוברים על כל הגן.
  5. כדי לזהות אללים mutant שונים, להשוות את רצפי מעוברים מוטציה רצף פראי סוג באמצעות כל כלי היישור של רצף DNA כמו הפיצוץ או T-קפה.

תוצאות

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected.

טיקם 1
רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרי?...

Discussion

הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג'ין עם דגים 30 ,

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג'ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reproboost implantCenter of Marine BiotechnologyLuteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-SWestern Chemical. Inc.For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol redSigma-AldrichP02900.5%, sterile filtered
Stereo microscopeOlympus213709For visualizing the eggs during microinjection
MicroinjectorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MPPI-3For the delivery of the injection material into the embryos
MicromanipulatorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MM33 For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956.003For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle pullerDavid Kopf InstrumentsModel 720For pulling microinjection needles
Cas9 proteinPNA Bio Inc. CP01Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System Roche Diagnostics, USAFor PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillariesFisher Scientific1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dishVWR25384-302For holding the embryos during the microinjection.
CriscoThe J.M. Smucker CompanyVegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solutionHome Made59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)Letco Medical690904Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131CRISPR Cas9microinjectionindels

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved