JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

Özet

Kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, Komple genom, kanal yayın balığı gen işlev eğitim için daha büyük fırsatlar için önde gelen Sıralı. Gene nakavt bu gen fonksiyonları içinde vivoçalışmada kullanılmaya başlanmıştır. Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced güçlü bir araç genomik DNA dizileri gene işlevi değiştirmek için düzenlemek için kullanılan bir sistemdir. Geleneksel bir yaklaşım içine tek hücreli embriyo mikroenjeksiyon ile CRISPR/Cas9 mRNA tanıtmak olmuştur iken, bu yayın balığı yavaş ve verimsiz bir işlemde olabilir. Burada, mikroenjeksiyon kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 protein ile detaylı bir protokol açıklanmıştır. Kısaca, yumurta ve sperm toplanan ve daha sonra suni döllenme gerçekleştirilen vardı. Döllenmiş yumurta Holtfreter'ın solüsyon içeren bir petri için transfer edildi. Enjeksiyon hacmi kalibre edilmiş ve daha sonra geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM 1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen tek hücreli embriyo sarısı microinjected RNA'ların / Cas9 hedefleme rehberlik. Gen nakavt başarılı olduğu indels DNA sıralama tarafından teyit edildi. Tahmin edilen protein sıra değişiklikler nedeniyle bu mutasyonlar frameshift dahil ve protein erken kodon nedeniyle kesildi.

Giriş

Mikroenjeksiyon, DNA, RNA, protein ve oluştururlar gibi bir madde küçük bir miktar hücreler veya embriyo ile cam kapiller1teslim etmek için kullanılan ortak bir laboratuvar tekniktir. Mikroenjeksiyon bir microinjector, micromanipulator ve mikroskop2de dahil olmak üzere özel ekipman Kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir. Teknik genetik transgenics, gen Renkleri çakıştırmama ve gen terapisi, nesil hücre içi bileşenleri3,4 dinamiklerini anlamak amacıyla aracılığıyla birçok organizmalar değiştirmek için araştırmacılar tarafından kullanılan , 5.

Kanal yayın balığı (Ictalurus punctatus) su ürünleri en popüler yayın balığı türler ve eğlence balıkçılık faaliyetleri Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. İşlevsel genomik kanal yayın balığı eğitim için artan bir ihtiyaç ve kanal yayın balığı tam genomunun sıralama genom düzenleme araçları6,7son gelişmeler yarar artırır. Gen işlevini anlama sadece yayın balığı üzerinde yürütülen araştırma zenginleştirmek istiyorsunuz değil, ama aynı zamanda daha etkili genetik geliştirme programları için yayın balığı sanayi geliştirmek için neden olabilir. İlgi belirli bir özellik için kritik gen tanımlandıktan sonra onlar genetik olarak yararlı allelleri oluşturmak için genom düzenlemeyi kullanarak yayın balığı üretimi seçimi için zararlı gen aktarımı, bastırmak bu gen artırmak için kullanılabilir transgenesis veya bu seçeneklerin bir bileşimini yararlı gen. Bir balık farklı türlerden farklı ticari olarak yararlı özellikleri için en iyi genler birleştirerek büyük ölçüde verimlilik ve karlılık balık üretim işlemleri8artıracak.

Gene nakavt gen fonksiyonları içinde vivoçalışmaya doğrudan bir yöntemdir. Mutasyonlar DNA düzeyinde etkileri çalışmanın farklı generations kolaylaştıracaktır gelecek nesiller tarafından devralınır. Farklı genom düzenleme araçları gelişmiş dahil olmak üzere çinko parmak enzimler (ZFNs), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) edilmiş ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar/CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9 kümelenmiş ) sistem9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 sistem genomik DNA dizileri gene nakavt balık RNA güdümlü siteye özgü DNA bölünme5,13arası da dahil olmak üzere düzenlemek için kullanılan güçlü ve etkili bir araçtır. Genom ve bir DNA endonükleaz enzimi, Cas9 hedeflenen sırayla belirleyen bir Kılavuzu RNA (gRNA), sistem oluşur. CRISPR/Cas9 sistem genom herhangi bir sırayla ZFNs ve TALENs çeşitli avantajlar ile hedef için tasarlanmış olması: (1) daha düşük (2) kolay (3) daha özel bağlayıcı Guide RNA hedef sıra için mühendislik maliyet ve hedef kapalı mutasyonlar (4) azaltılmış birden çok dizileri aynı time (5) yüksek mutagenesis oranda TALENs ve (6) geliştirilmiş germline iletim hızıyla mutasyonlar için ilâ 6-fold ZFNs TALENs ve14içinkarşılaştırıldığında mutasyona uğramış değil genlerdeki farklı gRNA ile hedef alınabilmesi, 15,16,17,18.

Ana alternatif mikroenjeksiyon için çoğalmasıyla, elektrik darbeleri embriyo veya hücre membran geçirgenliği ve biyolojik moleküllerin19,20alımını artırmak için uygulanan bir yöntemdir. Birkaç transgenik balık çoğalmasıyla medaka (Oryzias latipes), Zebra balığı (Danio rerio), chinook somon (Oncorhynchus tshawytscha), kanal yayın balığı, çipura (Sparus sarba) gibi kullanarak oluşturulan ve ortak sazan (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporasyon plazmid DNA, RNA ve Cas9 protein gen nakavt için teslim etmek için kullanılmıştır. Memeli hücrelerinde, Cas9/gRNA plazmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA ve Cas9 protein/gRNA kompleksleri elektroporasyon kullanarak teslim edildi ve mutagenesis gore Cas9 protein/gRNA kompleksleri çoğu elektroporasyon test koşulları27için kullanarak en yüksek. Ascidian Kordalılar (Ciona intestinalis), electroporated birden çok gen28nakavt ikna etmek için döllenmiş yumurta içine TALENs yapıları ifade edildi. Plazmid yapıları ifade ZFNs electroporated Lüteinizan kanal yayın balığı29nakavt olduğunu. Ancak, bir kez hücre içine tanıttı, plazmid yapıları için RNA transkripsiyonu ve büyük olasılıkla için RNA'ın mikroenjeksiyon göre mutagenesis zaman erteleyecek istenen DNA dizisi hedefleyebilirsiniz önce işlevsel proteinler için tercüme gerekir / protein. Bir embriyo geliştiriyor, gecikmeli mutagenesis enjekte kurucuları mozaizm artar. Buna ek olarak, transgenik ifade mutagenesis verimliliği düşürücü mikroenjeksiyon ile mümkün ifade seviyesine ulaşmak mümkün değildir.

Hücrelere genom düzenleme araçları tanıtmak için bir araç olarak mikroenjeksiyon çoğalmasıyla birçok avantajı vardır. Molekülleri düzenleme genom güvenilir bir şekilde hücreleri veya mikroenjeksiyon30ile embriyo içine tanıttı olabilir. Daha az enjeksiyon malzeme gereklidir. Enjekte malzeme miktarlarını belirlemek kolaydır. Daha yüksek mutasyon oranları düşük mozaizm kurucusu balık ile olabilir hangi-cekti geliştirmek germline iletim F1mutasyonların elde. Daha az kurucusu balık daha yüksek mutasyon oranı nedeniyle ilk nesil üretmek için çözümlenmesi gerekir. Elektroporasyon içinde daha fazla kurucusu balık analiz edilecek olan maliyeti artacak gerekir. Ancak, bu daha fazla embriyo31,32enjekte edilerek üstesinden gelebilir rağmen kanal yayın balığı microinjected embriyo yaşama electroporated olanlar, düşüktür. Kanal yayın balığı, yumurta sarısı microinjected embriyo 16'dan bağlı olarak hedef genlerin % 55 arasında değişiyordu yaşama ve gRNA/Cas9 protein32doz.

Yayın balığı embriyo düzenli mikroenjeksiyon teknik olarak talep ediyor ve zaman alıcı ancak, hızlı ve verimli CRISPR/Cas9 protein mikroenjeksiyon protokolü için kanal yayın balığı embriyo sunulur. CRISPR/Cas9 protein çözüm bir hücre embriyo sarısı enjekte edilir beri bu iletişim kuralı daha az zaman ve uzmanlık gerektirir. Döllenmiş yumurta yüzlerce 1 h (yaklaşık zaman gerçekleşmesi ilk hücre bölünmesi gerekli) enjekte edilir. Protokol doğrulamak için iki hastalığı duyarlılık ile ilgili gen kanal yayın balığı, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen nakavt. TICAM 1 toll benzeri reseptör (TLR) 3 tarafından başlatılan sinyal yolu ilgilenmektedir. Kanal catfish TICAM 1 önemli ölçüde downregulated mavi kedi balığı, bir tür dirençli E. ictaluri33içinde iken bakteriyel meydan okuma ile Edwardsiella ictaluri, takip upregulated oldu. RBL oynar önemli bir rol ile Flavobacterium columnare, columnaris hastalığı, hastalığının erken enfeksiyon akut nerede ve sağlam upregulation göre columnaris duyarlı kanal yayın balığı gerginlik kaydedildi bir columnaris dirençli34.

Protokol

Bu yapılan balık genetik araştırma birimi, E. W. kabuk balıkçılık Araştırma Merkezi, Auburn Üniversitesi, AL. Deneme başlatılmadan önceki bu deneyde kullanılan tüm deneysel protokoller Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (AU-IACUC) tarafından kabul edildi. Bir liste bu deneyde kullanılan malzemeleri ve Ekipmanları Malzemeleri tablosunda bulunabilir. Aşağıdaki adımlar ve yordamlar için hazırlık ve mikroenjeksiyon kanal yayın balığı tek hücreli embriyo şekil 1' de gösterildiği gibi vardır.

1. kara kara hisse senedi seçimi ve yumurtlama

  1. Sağlıklı kanal yayın balığı damızlık stok zorlanma veya ilgi genetik satır'ı seçin. Kanal yayın balığı ve erkeklerde iyi ikincil cinsiyet özellikleri göstermelidir.
  2. Bedenlerini iyi gelişmiş genital papilla ile geri kalanı daha geniş geniş bir kas kafa var erkek seçin. Koyu renk, yara izi ve bölgesel mücadele üzerinden yaralar da cinsel hazırlık belirtileridir. Vücutlarını geri kalanından daha dar kafaları kadın seçin ve yumuşak, elle tutulur, çok yönlü karın var. Doğruluk ve balık ilk işleme sırasında stres önlemek için kadın 2-3 gün önce yumurtlama için hazır inceleyerek beslemekten.
  3. Balık hızlı bir şekilde, ama dikkatli bir şekilde işleme gerçekleştirin. İşleme stresi azaltmak için işleme kadın çantaları (32 mm boyut mesh) yumurtlama içinde balık tutarken gerektiren tüm yordamları gerçekleştirin.
  4. Yumurtlama ikna etmek için sadece hormon enjeksiyonu daha önce kadın vücut ağırlığını ölçmek.
  5. Yumurtlama çanta içinde dişi tank ile sürekli su akışı ve yeterli havalandırma bir akış içinde asmak.
  6. Aseptik, 14 G iğne Lüteinizan hormon analog (LHRHa) implant bırakmadan 85 µg/kg olan implanter yükleyin. Enjeksiyon yeri (sırt kas) enjeksiyon önce % 0,9 steril serum fizyolojik solüsyonu ile yıkayın. İmplanter 45 ° açıyla yerleştirin ve implant bırakın. İğne ve kuvvetli darbe enjeksiyon yeri daha önce % 70 etanol ıslatılmış bir pamuk ile geri alıyorum.
  7. 15-20 cm su yüzeyinin altında su böylece balık tamamen içinde batık yeri tankı yumurtlama çantada. Yeterli havalandırma (yukarıda 5 ppm çözünmüş oksijen) ve iyi su kalitesi yüksek kaliteli yumurta yumurtlama için önemlidir.
  8. Derecesi-saat (h) ilişki35kullanarak su sıcaklığı dayalı yumurtlama zamanı tahmin. Derecesi-h tepki süresi hormonu enjeksiyon ve yumurtlama (h) arasındaki süre = * su sıcaklığı (° C). Örneğin, 900-1000, derece-h tepki süresi için bir erkek hormonu enjeksiyon zaman 25 ° C'de 36-40 h spawn bekleniyor Genellikle, yumurta için ilk onay 36 h hormonu enjeksiyon sonra ve daha sonra 4 h aralıklarla yapılır.
  9. Yumurtlama için kontrol etmek için yumurtlama çantanın içine eklenen yumurta için arıyoruz iken su yüzeyi üzerinde yumurtlama çanta yavaşça kaldır. En az 10 yumurta görmek bu dişinin yumurtlama ve el sıyırma için hazır olduğunu gösterir.

2. sperm hazırlama

Not: Sperm bir kaç saat önce beklenen yumurtlama zaman hazır olun.

  1. Anestezi sperm motilitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir beri anestezi, başsız bir vurmalı darbe tarafından erkekler ötenazi.
  2. Testisler küçük bir tartı tavada toplamak, herhangi bir dokuyu ve gerekirse 50-mL % 0,9 serum fizyolojik kan, kaldırmak için ile yıkayın. İyi gelişmiş testis birçok villiform projeksiyonlar ( Şekil 2) ile beyazdır.
  3. Testis ağırlığını belirlemek.
  4. Sperm çözüm yumurta döllenme için hazırlamak için testis forseps kullanarak bir 100 cm2 100 µm kafes Center'a aktarın. Testis testis içinde ezmek ile mesh katlayın ve sperm 50 mL toplama tüp içine filtre. Bu testisler başparmak ile toplama tüp kenarında karşı kafes içinde basınç uygulayarak yapılabilir. % 0,9 serum fizyolojik çözüm kafes toplama tüp içine sperm yıkama için kullanın. Tuzlu çözüm 10 mL/g testis eklenebilir.
  5. Sperm konsantrasyonu belirlemek, canlılık ve hareket kontrol et.
    Not: Bir hemasitometre kullanarak milt bilinen seyreltilmiş hacmi sperm hücrelerinde sayarak konsantrasyon belirlenebilir. Alternatif olarak, sperm yoğunluğu bir Spektrofotometre kullanarak milt optik yoğunluk değerlendirerek tahmin edilebilir. Bu yöntemde, 505 nm dalga boyu emme önceden sperm36farklı konsantrasyonlarda emilimi için hazırlanmış bir kontrol listesi karşılaştırılır. Sperm motilitesi mikroskop altında sperm aktive edilene kadar sperm hareketi (hareketliliği süresi olarak da adlandırılır)37kesilmesi zaman olarak kontrol edilebilir. Sperm canlılığı birikmiş sperm günahı kalır iken hangi tek uygun sperm hücresi, leke sperm trypan mavi, gibi seçici boyalar ile boyama tarafından belirlenebilir. Ancak, bu mikroenjeksiyon işlemleri için bu testisler iyi gelişmiştir eğer gerekli değildir.
  6. Sperm % 0,9 serum adım 2,5 4 ° C'de depolayın ve hazırlık sonra 24 saat içinde kullanın.

3. yumurta toplama ve gübreleme

  1. Sebze kısalma bir 20 cm çapında pan yumurtlama temiz kuru çok ince bir tabaka uygulayın.
  2. Arabelleğe alınan tricaine metan Sülfonat sodyum bikarbonat ile 100 ppm içeren anestezik çözüm dişi koyun (nihai çözüm pH 7,0 olmalıdır) Balık tamamen imzalat38olana.
    Uyarı: Tricaine metan Sülfonat Eğer inhale, hafızanın veya deri yoluyla emilir rahatsız edici olabilir.
  3. Dikkatle, Balık yumurtlama çantasından çıkartın ve o anestezik çözüm yıkamak için % 0,9 serum içinde eğim. Balık tamamen temiz bir havlu, Balık vücut yüzeyi mukus tabakasının kaldırılması kaçınarak kullanarak kapalı kuru.
  4. Sebze kısalma yüzgeçleri pelvik el sıyırma sırasında ek yumurta önlemek için de dahil olmak üzere havalandırma, çevresini uygulanır.
  5. El şerit yumurtaları yumurtlama yağlanmış tavaya yumurtalık için hafif basınç uygulayarak. İyi yumurta serbestçe akışı, altın sarısı renkte olmalı ve çok az var veya yok kümeleri veya kan pıhtılaşması (Şekil 2). Su micropyle kapatma teşvik ettiği gibi arasında yumurta ve gübreleme önce su temasından kaçının.
  6. Mikroenjeksiyon için yumurtaları döllemek için yumurtlama pan yağlanmış bir 200 – 300 yumurta aktarın. Yağlanmış plastik bitki Etiketler bir kaşık yumurta için yumurtlama pan yağlanmış aktarmak için kullanılabilir. 1-2 mL (Kimden adım 2.5) sperm çözüm yumurtalara ekleyin ve karışımı yavaşça. Sperm yumurta oranı yaklaşık 11.000 sperm/yumurta olmalıdır.
  7. Yumurtalara sperm ve yumurta etkinleştirmek için tatlı su ekleyin. Biraz yumurta karşılamak için yeterli su ekleyin. 30 s. gübreleme 1-2 dk içinde oluşması için yavaşça yumurta girdap. Tek bir katmanda düzenlenmiş olan yumurtaları döllemek önemlidir. Yayın balığı yumurta her embriyo çoklu katmanlar microinject önlemek üzere diğer uygun.
  8. Döllenmiş yumurta daha tatlı su ekleyin ve yumurta için 10-15 dk sertleşmesine.
  9. Bir kaç saat içinde döller ve kurutma önlemek için ıslak bir havlu tarafından kalan döllenmemiş yumurta içeren yumurtlama tava kapağı. Fertilizasyon kademeli bir şekilde yapılabilir, örneğin embriyo sürekli bir tedarik mikroenjeksiyon ve sigara enjekte denetim embriyolar için bir hücre aşamada emin olmak için her 30-60 dk 200 – 300 yumurta olabilir, bir dizi döllenmiş. Yumurta bunları kaldırmak üzere ıslak havlu uygun gibi ıslak havlu ve yumurtalar arasında temas kaçının. Bu iletişim kuralı, sıyırma sonra 2-3 saat içinde döllenmiş yumurta verimli bir şekilde microinjected ve yumurta olarak benzer başarı hemen sıyırma sonra döllenmiş vardı.

4. iğne çekerek ve yükleme

  1. 1.0 mm OD borosilikat cam kapiller 2 iğneler (şekil 3) çek. İğneler çeşitli kesiler yapılmış sünger parçası ile bir kağıt kutusu saklayın. İğne bozulmaması için sünger çapını iğne kök uzunluğundan daha küçük olmalıdır.
  2. İğne ucu keskin bir nesne kullanarak ibre en ince bölgenin küçük bir parça kırarak açın. Alternatif olarak, iğne mikroskop altında Forseps ile uç bölgesi en ince pinching tarafından açın.
  3. Enjeksiyon çözüm gRNA(s) Cas9 protein ile karıştırarak hazırlayın. Diğer türlü RNA ya da protein aynı yordamı ile enjekte edilir. Bu protokol için gRNAs hedef kanal yayın balığı bağışıklık ilgili genlerin, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen için iki tasarlanmış ve Şah ve arkgöre hazırlanmış. yüksek sadakat Taq polimeraz32,39kullanımı ile. EXoN 1 RBL gen protospacer bitişik motifi (PAM) sıra için altı çizili (şekil 6) 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' TICAM 1 gen (şekil 4) ve 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' gRNAs için genomik hedefi oldu.
    1. PATLAMA Kılavuzu RNA hedeflerine karşı kanal yayın balığı genom sıra ve bu potansiyel hedef kapalı site ile seçin.
    2. Fenol kırmızı renk gRNA/Cas9 protein Toplam hacim üçte biri kadar karıştırın ekleyin.
    3. Her embriyo 50 ile enjekte edilir nükleaz boş su ile gRNA/Cas9 protein karışımı nihai toplama ayarlamak yaklaşık 2.5 ng gRNA ve 7,5 ng Cas9 protein içeren nL. Karışımı 10 dakika buz kullanmadan önce kuluçkaya.
  4. Bir microloader ile 5-10 µL gRNA/Cas9 karışımı microloader iğne kök yerleştirip karışımı yavaş yavaş microloader ucu (şekil 3) geri çeker iken kovma enjeksiyon iğne yükleyin. İçinde hava kabarcıkları yakalama kaçının.
  5. İğne micropipette sahibine eklemek ve sıkı bir bağlantı sağlamak ve sahibi için micromanipulator ekleyebilirsiniz. Ücretsiz kararlı hareket emin olun. Basınç mikroenjeksiyon için azot silindir açılış ve basınç regülatörü yaparak uygulayın.
    Not: Enjeksiyon hacmi etkilenebilir basınç, iğne diyafram çapı ve enjeksiyon süresi tarafından. Enjekte, bir damla mineral yağı enjekte için birim belirlemek için bir hemasitometre yerleştirilir. Gerekirse, basınç, iğne ve iğne çapı süresi enjeksiyon hacmi azaltmak veya artırmak için ayarlanabilir. Birden çok kez tutarlı cilt sağlamak için mineral yağ enjekte.

5. Yayın balığı embriyo mikroenjeksiyon

  1. Sebze kısalma 100 mm temiz Petri kabına için çok ince bir tabaka uygulayın.
  2. Yağlanmış plastik bitki etiket kullanma, 50-100 yumurta döllenme tava Petri kabına aktarmak ve onları Holtfreter'ın çözüm (malzemeler tablo) ile kaplayın. Birbirlerine karşı yumurta tek bir katmanda hizalayın. Bu hizalama yumurtaların mikroenjeksiyon işlemi sırasında yerde tutmak gerekir.
  3. Petri kabına yumurta ile mikroskop sahnesinde yerini ve tek elle tutun. Bir tek düzgün hareket koryon ve sarısını deliyor dek Öte yandan (şekil 3) iğneyle indirin. İğne ucu enjeksiyon malzeme teslim etmeden önce blastodisc için mümkün olduğunca yakın olmalıdır.
    1. Sarısı enjeksiyon malzeme sunmak için pedal düşürmek. Blastodisc açıkça görünür değilse, enjeksiyon malzemesi sarısı, farklı konumlarda içine yayılmış. Bunu yapmak için iğne kadar sarısı sonuna eklenir, sonra pedal iç karartıcı ve iğne çekilmesi aynı anda yumurtalı farklı alanları ile enjeksiyon malzeme yaymak için yapılır. 50 nanoliters kadar kanal yayın balığı sarısı embriyo, ancak enjekte edilebilir, gRNA/Cas9 protein miktarı her gen mutasyon oranı ve embriyo hayatta kalma32için en iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş olması gerekiyor.
  4. İğne sorunsuz geri çek yumurta zarar için. Başka bir yumurta ile aynı yordamı enjekte Petri kabına taşıyın. Bu yumurta zarar verebilir veya iğne kırabilir Petri kabına hareketi enjeksiyon işlemi sırasında önlemek. Yırtıldı veya mikroenjeksiyon nedeniyle zarar yumurta kaldırın. Enjeksiyon 15-20 dk sonra gübreleme başlatılabilir ve embriyo (kadar yaklaşık 60-90 dakika sonra fertilizasyon) hala bir hücre aşamasında olduğu sürece devam etmek.
  5. Enjekte embriyo Holtfreter'ın çözüm doksisiklin ve40çıkım kadar 6-7 gün boyunca sürekli nazik havalandırma 10 ppm ile geri koyun. Çözüm her gün değiştirin ve ölü embriyo kaldırın.

6. mutasyon algılama

  1. Rastgele, birkaç enjekte embriyo 72 h sonrası döllenme, toplamak, sarısı kaldırmak ve genomik DNA ayıklayın. 3-5 sigara enjekte embriyo bir denetim içerir.
    Not: Genomik DNA embriyo yumurta kabukları ve sarısı malzeme İndinavir K sindirim ve etanol yağış32kullanarak çıkarıldıktan sonra elde edilebilir.
  2. GRNA nerede mutasyonlar yüksek sadakat Taq polimeraz32kullanarak gerçekleşmesi beklenen her gen için genomik hedefler kanat bir DNA kesimi yükseltmek. TICAM 1, astar 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG için 3' (İleri) ve 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (ters) bir 750 yükseltmek için kullanılan bp RBL iken, astar 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA için 3' (İleri) ve 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (tersi) için kullanılan RBL gen 375 bp segmentten yükseltmek.
    1. Aşağıdaki PCR reaksiyon kullanın: 20 µL PCR sınıf su; 1 x yüksek sadakat Taq enzim reaksiyon arabellek MgCl2, 0.2 mM dNTP ile karıştırın, her biri aynı, 100-300 ng genomik DNA ve yüksek sadakat Taq enzim karışımı 1,25 birimleri ileriye ve geriye doğru astar için 0.4 µM. PCR bisiklet koşullarını gerçekleştirmek: ilk denatürasyon 94 ° c 3 dakika; denatürasyon 94 ° C'de 35 döngüleri için 30 55 60 ° C'de tavlama s, s TICAM için ve 40 s için RBL, uzantısı 72 ° c için 1 dk/kb; ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı.
  3. Sıralama arıtılmış PCR ürünleri, surveyor mutasyon algılama tahlil, heteroduplex hareketlilik tahlil, restriksiyon enzimi tanıma sitesi kaybı gibi bir mutasyon algılama yöntem veya herhangi bir diğer mutasyon algılama yöntemi kullanarak mutant embriyo tespit hedef için uygun. Bu protokol için mutant embriyo TICAM 1 ve sıralama RBL gen için saflaştırılmış PCR ürünlerinin yanı sıra restriksiyon enzimi sapı site kesmek kaybı için arazi mutasyon algılama tahlil kullanarak bulmak.
  4. Mutant gen tanımlamak için PCR ürünleri ve sıra vektörel çizimler bireysel kolonilerden klonu. Şekil 4 ve şekil 6 ' da sunulan mutant gen enjekte embriyo geldi. PCR ürünleri altı microinjected ve her gen için 3 kontrol embriyo iki ayrı tüp, bir microinjected embriyo ve 86 vektörel çizimler ve diğer denetim embriyolar, hızla klonlanmış için içinde TICAM 1 ve 8 de dahil olmak üzere sıralı, RBL gen için 48 vektörel çizimler için havuza alınmış Her gen için 3 kontrol sigara enjekte embriyo reaksiyonlardan sıralanıyor.
  5. Farklı mutant gen tanımlamak için mutant embriyo gelen dizileri patlama veya T-kahve gibi herhangi bir DNA dizisi hizalama araç kullanarak vahşi tipi kol için karşılaştırın.

Sonuçlar

Mikroenjeksiyon protokolünün etkinliği göstermek için kanal yayın balığı otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen hedeflemek için tasarlanmış gRNAs microinjected.

TICAM 1
DNA sıralama vektörlerin havuza alınan, klonlanmış PCR ürünleri bireysel kolonilerden TICAM 1 gen indüklenen Indel mutasyonla...

Tartışmalar

Mikroenjeksiyon gen nakavt elde etmek için kanal yayın balığı embriyolar için detaylı bir protokol sunuldu. Enjeksiyon CRISPR/Cas9 proteinin sarısı çok daha kolaydır zaman kazandırır ve does değil istemek en gen transferi ve gen balıkla düzenleme için ortak teknik tek hücreli embriyo blastodisc microinjecting için karşılaştırıldığında kapsamlı eğitim 30 , 42. Geçerli protokol kanal yayın balığı TICAM 1 ile RBL gen indels inducing...

Açıklamalar

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Teşekkürler

Bu araştırma için Roger Cone USDA-NIFA Ödülü 2015-67015-23488 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Ronald Phelps damızlık stok seçim ölçütü video açıklaması için teşekkür ederiz. Ahmed Elaswad ve Karim Khalil Mısır kültür ve eğitim büro Washington DC'de doktora araştırma finansmanı için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reproboost implantCenter of Marine BiotechnologyLuteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-SWestern Chemical. Inc.For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol redSigma-AldrichP02900.5%, sterile filtered
Stereo microscopeOlympus213709For visualizing the eggs during microinjection
MicroinjectorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MPPI-3For the delivery of the injection material into the embryos
MicromanipulatorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MM33 For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956.003For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle pullerDavid Kopf InstrumentsModel 720For pulling microinjection needles
Cas9 proteinPNA Bio Inc. CP01Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System Roche Diagnostics, USAFor PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillariesFisher Scientific1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dishVWR25384-302For holding the embryos during the microinjection.
CriscoThe J.M. Smucker CompanyVegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solutionHome Made59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)Letco Medical690904Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

Referanslar

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 131CRISPR Cas9gen d zenlemegen nakavtmikroenjeksiyonkanal yay n bal embriyolarmutasyonproteinindels kesildi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır