Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Zusammenfassung

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Zusammenfassung

Das komplette Genom von der Kanal-Wels Ictalurus Punctatus, wurde sequenziert, führt zu größeren Möglichkeiten für Channel Catfish Genfunktion zu studieren. Gen Knockout wurde verwendet, um diese gen Funktionen in Vivozu studieren. Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System ist ein mächtiges Werkzeug zum Bearbeiten von genomischer DNA-Sequenzen um Genfunktion zu ändern verwendet. Während der traditionelle Ansatz CRISPR/Cas9 mRNA in die einzelne Zelle Embryonen durch Mikroinjektion einbringen wurde, kann dies ein langsamer und ineffizienter Prozess in Wels. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen mit CRISPR/Cas9 Protein beschrieben. Kurz, Ei- und Samenzellen wurden gesammelt und dann künstliche Befruchtung durchgeführt. Befruchtete Eizellen wurden in einer Petrischale mit Holtfreter Lösung überführt. Injektionsvolumen war kalibriert und dann leiten RNAs/Cas9 Ausrichtung, die die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM 1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert waren. Die gen-Knockout war erfolgreich, DNA-Sequenzierung Indels bestätigt wurden. Die vorhergesagte Protein Sequenz Veränderungen durch diese Mutationen enthalten Frameshift und Proteins wegen vorzeitigen Stopp-Codons abgeschnitten.

Einleitung

Mikroinjektion ist eine verbreitete Labortechnik verwendet, um eine kleine Menge einer Substanz wie DNA, RNA, Proteine und andere Makromoleküle in Zellen oder Embryos durch eine Glas-Kapillare-¹liefern. Mikroinjektion wird mit Sonderausstattung Einrichtung einschließlich einer Microinjector, Mikromanipulator und Mikroskop²durchgeführt. Die Technik wurde von den Forschern verwendet, um genetisch zu verändern viele Organismen durch die Generierung von gentechnisch veränderten Pflanzen, gen-Knockouts und Gentherapie, mit dem Ziel, Verständnis der Dynamik von intrazellulären Komponenten^{3,4 , 5}.

Der Kanal Wels (Ictalurus Punctatus) ist die beliebteste Wels-Arten in der Aquakultur und Freizeitfischerei Aktivitäten in den Vereinigten Staaten. Gibt es ein zunehmender Bedarf FunktionsGenomics in Channel Catfish zu studieren, und Sequenzierung des kompletten Genoms Channel Catfish erhöht den Nutzen der jüngsten Fortschritte in der Genome editing Tools^6,7. Genfunktion Verständnis würde nicht nur bereichern die Forschung, die auf Wels durchgeführt wird, sondern könnte auch zu effektiver genetischen Verbesserungsprogrammen, Wels-Industrie zu verbessern. Sobald wichtige Gene für ein bestimmtes Merkmal von Interesse identifiziert sind, können sie verwendet werden, genetisch Wels Produktion durch Erbgut Bearbeitung um vorteilhafte Allele generieren Auswahl für diese Allele, unterdrücken die schädlichen Allele, Übertragung zu verbessern die vorteilhafte Allele durch Transgenese oder eine Kombination dieser Optionen. Kombiniert die besten Gene für verschiedene wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften von verschiedenen Arten in einen Fisch würde erheblich verbessern Produktivität und Rentabilität von Fisch Produktion Betrieb⁸.

Gen Knockout ist eine direkte Methode, gen Funktionen in Vivozu studieren. Mutationen in der DNA-Ebene werden von zukünftigen Generationen vererbt werden, die ihre Auswirkungen in verschiedenen Generationen erleichtern wird. Unterschiedliche Genom-Bearbeitungs-Tools wurden entwickelten einschließlich Zink Finger Nukleasen (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten Protein 9 (CRISPR/Cas9 ) System^9,10,11,12.

Das CRISPR/Cas9-System ist eine leistungsstarke, effiziente Werkzeug, das verwendet wurde, um die genomische DNA-Sequenzen auch gen Knockout in Fische durch RNA-geführte Site-spezifische DNA-Spaltung^5,13bearbeiten. Das System besteht aus einen Leitfaden RNA (gRNA), die die gezielte Reihenfolge in das Genom und eine DNA-Endonuklease Enzym, Cas9 bestimmt. Das CRISPR/Cas9-System kann in beliebiger Reihenfolge in das Genom mehrere Vorteile gegenüber ZFN und TALENs Ziel gestaltet werden: (1) niedriger Kosten (2) einfacher Technik (3) mehr spezifische Bindung der RNA Anleitungenzu Zielsequenz, und reduziert Ziel Mutationen (4) mehrere Sequenzen können mit verschiedenen gRNA mit der gleichen Zeit (5) hohe Mutagenese Rate in Gene gezielt eingesetzt werden, die nicht von TALENs und (6) verbesserte Keimbahn-Übertragungsrate von Mutationen für bis zu 6-Fach mutiert sein könnte im Vergleich zu ZFN und TALENs^{14, 15,16,17,18}.

Die wichtigste alternative Methode für die Mikroinjektion ist Elektroporation, in denen elektrische Impulse auf Embryonen oder Zellen Membranpermeabilität und die Aufnahme von biologischen Molekülen^19,20erhöhen angewendet werden. Mehrere transgene Fische wurden mit Elektroporation wie Medaka (Oryzias Latipes), Zebrafisch (Danio Rerio), Königslachs (Oncorhynchus Tshawytscha), Channel Catfish, Goldbrasse (Sparus Mitgleid) erzeugt und gemeinsamen Karpfen (Cyprinus Carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Elektroporation wurde zur Plasmid DNA, RNA und Cas9 Protein für gen Knockout zu liefern. In Säugetierzellen, Cas9/gRNA Plasmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA und Cas9 Protein/gRNA komplexe wurden geliefert mit Elektroporation und Mutagenese Preise waren mit Cas9 Protein/gRNA komplexe für die meisten Elektroporation Bedingungen getestet²⁷am höchsten. In der Ascidian Chordate (Ciona Intestinalis) waren TALENs Konstrukte auszudrücken elektroporiert in befruchteten Eizellen, Ko von mehreren Genen²⁸zu induzieren. ZFN auszudrücken Plasmid Konstrukte wurden elektroporiert, knock out luteinisierendes Hormon im Channel Catfish²⁹. Einmal in die Zelle eingeführt, Plasmid Konstrukte werden müssen jedoch an RNA transkribiert und nach Funktionsproteine übersetzt, bevor sie die gewünschte DNA-Sequenz, die wahrscheinlich die Zeit der Mutagenese im Vergleich zur Mikroinjektion RNA verzögern würde ausrichten können / Protein. Ein Embryo entwickelt, mit zunehmender verzögerte Mutagenese Mosaikbildung der injizierten Gründer. Darüber hinaus dürfte die transgene Ausdruck den Ausdruck möglich mit Mikroinjektion, Senkung der Mutagenese-Effizienz zu erreichen.

Als Mittel für die Einführung von Genom-editing-Tools in Zellen hat Mikroinjektion mehrere Vorteile gegenüber Elektroporation. Genom Bearbeitung Moleküle kann zuverlässig in Zellen oder Embryos durch Mikroinjektion³⁰eingeführt werden. Weniger Injektionsmaterial ist erforderlich. Es ist leicht zu bestimmen, die Mengen an Material gespritzt. Höheren Mutation werden Tarife mit niedrigen Mosaikbildung im Gründer Fisch erreicht die Keimbahn Übertragung der Mutationen, F₁verbessern würde. Weniger Gründer Fische müssen analysiert werden, um die erste Generation, durch die höhere Mutationsrate zu produzieren. In Elektroporation müssen mehr Gründer Fische analysiert werden die Kosten steigen. Das Überleben der Channel Catfish mikroinjiziert Embryonen ist jedoch niedriger als elektroporiert diejenigen, obwohl dies durch die Injektion mehr Embryonen^31,32überwunden werden kann. Im Channel Catfish, Überleben von Eigelb mikroinjiziert Embryonen reichte von 16 bis 55 %, abhängig von den Genen angestrebt und die Dosierung von gRNA/Cas9 Protein³².

Regelmäßige Mikroinjektion von Wels Embryonen ist technisch anspruchsvoll und zeitraubend, jedoch eine schnelle und effiziente CRISPR/Cas9 Protein Mikroinjektion Protokoll ist für Channel Catfish Embryonen vorgestellt. Dieses Protokoll erfordert weniger Zeit und Know-how, da die Proteinlösung CRISPR/Cas9 in das Eigelb von einer Zelle Embryonen injiziert wird. Hunderte von befruchteten Eizellen können in 1 h (etwa den Zeitaufwand für die erste Zellteilung auftreten) injiziert werden. Um das Protokoll zu überprüfen, wurden zwei Krankheit Anfälligkeit-Genen in Channel Catfish, die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose bindende Lektin (RBL) gen klopfte. TICAM 1 engagiert sich in den Signalweg initiiert von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 3. Im Channel Catfish war TICAM 1 dramatisch hochreguliert nach bakteriellen Foulspiel mit Edwardsiella Ictaluri, während es herunterreguliert in blau Wels, eine Spezies resistent gegen E. Ictaluri³³war. RBL spielt eine wichtige Rolle in frühe Infektion mit Flavobacterium Columnare, der Erreger der Columnaris Krankheit, wo akute und robuste Hochregulation verzeichnete eine Columnaris-anfälligen Channel Catfish-Belastung im Vergleich zu einem Columnaris-resistenten Stamm³⁴.

Protokoll

Dieses Experiment wurde durchgeführt am Fisch Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle experimentelle Protokolle in diesem Experiment verwendet wurden von der Auburn University institutionelle Animal Care und Use Committee (AU-IACUC) genehmigt, bevor das Experiment ins Leben gerufen wurde. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Geräte und Zubehör in diesem Experiment verwendet. Im folgenden sind die Schritte und Verfahren für die Vorbereitung und Mikroinjektion Channel Catfish einzelligen Embryonen, wie in Abbildung 1dargestellt.

1. Brut Aktienauswahl und laichen

1. Wählen Sie gesunde Channel Catfish Brut bestand aus dem Stamm oder genetische Linie von Interesse. Channel Catfish Männchen und Weibchen sollen gute sekundären Geschlechtsmerkmale aufweisen.
2. Wählen Sie Männer, die einen breiten muskulösen Kopf, der breiter als der Rest ihres Körpers mit gut ausgebauten Genital-Papille. Dunkle Farbe, Narben und Wunden von territorialen Kämpfen sind auch Anzeichen für eine sexuelle Bereitschaft. Wählen Sie Frauen, die Köpfe, die schmaler als der Rest ihres Körpers sind, und haben Sie weiche, greifbar, gut abgerundeten Bauch. Stoppen Sie für die Richtigkeit und um zu vermeiden, betont die Fische während der ersten Behandlung Fütterung die Weibchen ca. 2-3 Tage vor der Prüfung ihre Bereitschaft zum Laichen.
3. Durchführen Sie Fisch, Handhabung, schnell, aber sorgfältig. Zum Umgang mit Stress zu reduzieren, führen Sie alle Prozeduren, die Handhabung Weibchen halten Fische laichen Taschen (32 mm Größe Mesh) erfordern.
4. Kurz vor Hormon Injektion induzieren Eisprung messen Sie das Körpergewicht der Weibchen.
5. Hängen Sie die laichen Taschen mit Frauen im Inneren in eine Durchströmung der Tank mit kontinuierlichen Wasserfluss und ausreichende Belüftung.
6. Aseptisch, laden Sie die Implanter, die eine 14 G-Nadel mit 85 µg/kg luteinisierendes Hormon Hormon analog (LHRHa) Implantat die Freigabe hat. Spülen Sie die Injektionsstelle (dorsale Muskulatur) mit steriler Kochsalzlösung 0,9 % vor der Injektion. Legen Sie die Implanter in einem 45°-Winkel und lassen Sie das Implantat. Zurückziehen der Nadel und streichen Sie die Injektionsstelle mit einem zuvor in 70 % igem Ethanol getränkten Wattebausch.
7. Ort der Laich Tasche in den Tank so, dass die Fische in vollständig eingetaucht sind Wasser 15-20 cm unter der Wasseroberfläche. Ausreichende Belüftung (über 5 ppm gelöste Sauerstoff) und gute Wasserqualität sind wichtig für den Eisprung hochwertige Eier.
8. Vorherzusagen Sie der Eisprung-Zeit anhand der Wassertemperatur mit Grad-Stunde (h) Beziehung³⁵. Grad-h Reaktionszeit = Zeit zwischen Hormon Injektion und Eisprung (h) * Wassertemperatur (° C). Zum Beispiel für eine Grad-h Reaktionszeit von 900-1000, ein Weibchen erwartet zum Laichen bei 36-40 h von Hormon Einspritzzeit bei 25 ° C. In der Regel erfolgt die erste Kontrolle nach Eiern ca. 36 h nach der Hormon-Injektion und dann in 4 h Intervall.
9. Um Eisprung zu überprüfen, heben Sie vorsichtig die Laich Tasche über der Wasseroberfläche während Sie auf der Suche nach der Eiern, die in der Laichzeit Tasche angebracht sind. Mindestens 10 Eiern sehen bedeutet diese weibliche Eisprung und bereit zum Abisolieren von Hand.

2. Sperma Vorbereitung

Hinweis: Spermien können ein paar h vor dem erwarteten Eisprung vorbereitet werden.

1. Einschläfern Sie Männchen durch ein perkussiver Schlag auf den Kopf ohne Narkose, da Anästhesie Spermienqualität negativ beeinflussen könnte.
2. Sammeln Sie die Hoden in eine kleine Waagschale, entfernen Sie jedes Gewebe zu und waschen Sie sie mit 50 mL 0,9 % Kochsalzlösung, Blut, zu entfernen, wenn nötig. Gut entwickelte Hoden sind weiß mit vielen villiform Projektionen ( Abbildung 2).
3. Bestimmen Sie das Gewicht der Hoden.
4. Um die Sperma-Lösung für die Befruchtung der Eizelle vorzubereiten, übertragen Sie die Hoden in die Mitte eines 100 cm² 100 µm Netzes mit Pinzette. Falten Sie dem Netz mit den Hoden im Gedränge der Hoden und Filtern Sie das Sperma in ein 50 mL Sammelröhrchen. Dies kann durch Druck auf die Hoden innerhalb des Netzes gegen den Rand des dem Sammelrohr über den Daumen. Verwenden Sie 0,9 % Kochsalzlösung, um das Sperma aus dem Netz in dem Sammelrohr zu waschen. Kochsalzlösung kann bis zu 10 mL/g Hoden hinzugefügt werden.
5. Bestimmen Sie die Konzentration der Spermien, überprüfen Sie die Motilität und Durchführbarkeit zu.
   Hinweis: Konzentration kann durch zählen der Samenzellen in einem bekannten verdünnten Volumen Milt mit einem Hemocytometer bestimmt werden. Alternativ kann die Dichte der Spermien durch die Auswertung der optischen Dichte Milt mit einem Spektralphotometer geschätzt werden. Bei dieser Methode wird die Absorption bei 505 nm Wellenlänge im Vergleich zu einer Regelkarte, die zuvor für die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von Spermien³⁶vorbereitet wurde. Beweglichkeit der Spermien kann unter dem Mikroskop als die Zeit von der Aktivierung der Spermien bis Beendigung der Spermien Bewegung (Motilität Dauer genannt)³⁷überprüft werden. Die Lebensfähigkeit der Spermien kann durch Färbung der Spermien mit selektiven Farbstoffe wie Trypan blau, die nur nicht lebensfähigen Samenzellen notwendig ist, während lebensfähige Samenzellen ungefärbten bleibt bestimmt werden. Diese Mikroinjektion Verfahren ist dies jedoch nicht erforderlich, wenn die Hoden gut entwickelt sind.
6. Sperma in 0,9 % Kochsalzlösung aus Schritt 2.5 bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb von 24 h nach der Zubereitung verwenden.

3. Ei-Sammlung und Düngung

1. Eine sehr dünne Schicht Gemüse Verkürzung auf einen sauberen, trockenen Pfanne laichen 20 cm Durchmesser.
2. Legen Sie das Weibchen in der Narkose Lösung mit 100 ppm gepufferten Tricaine Methan Sulfonate mit Natriumbicarbonat (pH-Wert Endlösung sollte 7.0) bis der Fisch vollständig betäubt³⁸ist.
   Achtung: Tricaine Methan Sulfonate möglicherweise irritierend Einatmen aufgenommenen oder durch die Haut absorbiert.
3. Sorgfältig, entfernen Sie die Fische aus dem Laich Beutel und Tauchen sie in 0,9 % Kochsalzlösung die Narkose Lösung abwaschen. Trocknen Sie die Fische ab, komplett mit einem sauberen Tuch, die Entfernung von der Schleimschicht auf der Körperoberfläche der Fische zu vermeiden.
4. Die Gegend um den Schlot, einschließlich die Bauchflossen, zur Befestigung der Eier während der Hand abstreifen zu verhindern, dass zuweisen Sie pflanzliche Verkürzung.
5. Hand Streifen die Eiern in die gefettete Pfanne Laichen durch sanften Druck auf die Eierstöcke. Gute Eiern sollte frei fließen, werden goldgelb in der Farbe und haben minimale oder keine Klumpen oder Blutgerinnsel (Abbildung 2). Vermeiden Sie den Kontakt zwischen Eiern und Wasser vor der Befruchtung, da Wasser Mikropyle Schließung fördert.
6. Um die Eizellen für die Mikroinjektion befruchtet, übertragen Sie 200 – 300 Eiern auf eine gefettete Pfanne Laich. Gefettete Plastikpflanze Etiketten dient als ein Löffel, um Eiern in die gefettete Pfanne Laichen zu übertragen. 1 – 2 mL der Lösung Spermien (aus Schritt 2.5) die Eier hinzufügen und vorsichtig mischen. Das Verhältnis von Spermien zum Ei sollte ungefähr 11.000 Sperma/Ei.
7. Fügen Sie Süßwasser, um die Eizellen, Spermien und Eizellen zu aktivieren. Fügen Sie genug Wasser, um etwas die Eiern bedecken. Vorsichtig schwenken die Eizellen für 1 – 2 min. 30 S. Befruchtung stattfinden sollte. Es ist wichtig, die Eizellen befruchtet, die in einer einzigen Schicht angeordnet sind. Wels-Eiern haften macht es schwierig, mehrere Schichten von Embryonen microinject zueinander.
8. Fügen Sie mehr Süßwasser zu den befruchteten Eiern und lassen Sie die Eiern 10 – 15 Minuten aushärten.
9. Decken Sie den Laichen Topf mit den restlichen unbefruchteten Eiern durch ein nasses Handtuch um zu verhindern, trocknen und in ein paar Stunden zu befruchten. Befruchtung kann in gewissem Sinne gestaffelt erfolgen, z. B., einer Charge von 200 – 300 Eiern lässt befruchtet alle 30 – 60 min um eine kontinuierliche Versorgung der Embryonen im einem Zell-Stadium für die Mikroinjektion und Kontrolle nicht injiziert Embryonen zu gewährleisten. Kontakt zwischen das nasse Handtuch und den Eiern zu vermeiden, da die Eizellen an das nasse Handtuch macht es schwierig, sie zu entfernen halten können. In diesem Protokoll Eiern innerhalb von 2 – 3 h nach dem Ausschalen befruchtet wurden effizient mikroinjiziert und hatte ähnliche Erfolge Eier befruchtet sofort nach dem Ausschalen.

4. Nadel ziehen und be-

1. Ziehen Sie eine 1,0 mm OD Borosilikatglas Kapillare in 2 Nadeln (Abbildung 3). Speichern Sie die Nadeln in einer Pappschachtel mit einem Stück Schwamm, in denen mehrere Einschnitte vorgenommen wurden. Um die Nadel zu brechen zu vermeiden, sollte der Durchmesser des Schwammes kleiner als die Länge des Stiels Nadel.
2. Öffnen Sie die Nadelspitze durch brechen ein kleines Stück von der Nadel dünnste Region mit einem spitzen Gegenstand. Alternativ öffnen Sie die Nadel durch Kneifen aus der dünnsten Region der Spitze mit der Pinzette unter die Lupe genommen.
3. Bereiten Sie die Injektionslösung durch Mischen von gRNA(s) mit Cas9 Protein. Andere Arten von RNS oder Protein können auch mit dem gleichen Verfahren injiziert werden. In diesem Protokoll wurden gRNAs auf zwei der Channel Catfish immun Verwandte Gene, Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose bindende Lektin (RBL) gen entworfen und zubereitet nach Shah Et Al. mit dem Einsatz von einem High-Fidelity Taq Polymerase^32,39. Die genomische Ziele für gRNAs waren 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' für TICAM 1-gen (Abbildung 4) und 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' Exon 1 RBL-gen mit Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) Sequenz unterstrichen (Abbildung 6).
   1. BLAST Guide RNA Ziele gegen das Channel Catfish Genom-Sequenz und wählen Sie die mit keine potenziellen Ziel-Sites.
   2. Farbe der gRNA/Cas9 Protein mischen sich zu einem Drittel des Gesamtvolumens fügen Sie Phenol Rot hinzu.
   3. Die Endkonzentration von gRNA/Cas9 Protein-Mix mit Nuklease freies Wasser so einstellen, dass jeder Embryo mit 50 eingespritzt wird nL, ca. 2,5 ng gRNA und 7,5 ng Cas9 Protein enthält. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min auf Eis vor Gebrauch.
4. Laden Sie mit einem Microloader 5 – 10 µL der gRNA/Cas9 Mischung in die Injektionsnadel durch Einfügen des Microloader in der Nadel Stamm und vertreiben die Mischung langsam beim Einfahren der Microloader Spitze (Abbildung 3). Einfangen von Luftblasen im Inneren zu vermeiden.
5. Legen die Nadel auf die Mikropipette Halter sorgen für eine enge Verbindung und dann die Mikromanipulator Halterung befestigen. Stabile Freizügigkeit zu gewährleisten. Druck für die Mikroinjektion durch die Stickstoff-Zylinder öffnen und Anpassen des Druckreglers.
   Hinweis: Das Volumen der Injektion kann durch den Druck, der Durchmesser der Nadel Öffnung und Einspritzdauer beeinflusst werden. Bestimmen Sie die Lautstärke auf Spritzen, Spritzen in einen Tropfen von Mineralöl auf ein Hemocytometer gelegt. Bei Bedarf kann der Druck, Dauer der Spritze und Nadel Durchmesser angepasst werden erhöhen oder verringern Sie die Lautstärke der Injektion. Injizieren Sie mehrere Male in das Mineralöl, einheitliche Lautstärke zu gewährleisten.

5. die Mikroinjektion von Wels Embryonen

1. Eine sehr dünne Schicht Gemüse zu einer sauberen Petrischale 100 mm kürzen.
2. Eine gefettete Plastikpflanze Zeichennutzung, 50 – 100 Eiern aus der Befruchtung Pfanne auf der Petrischale übertragen und bedecke sie mit Holtfreter Lösung (Materialtabelle). Richten Sie die Eiern gegeneinander in einer einzigen Schicht. Diese Ausrichtung sollten die Eizellen bei der Mikroinjektion in Position zu halten.
3. Legen Sie die Petrischale mit den Eiern auf der Bühne des Mikroskops und halten Sie ihn mit einer Hand. Senken Sie die Nadel mit der anderen Hand (Abbildung 3), bis es das Chorion und das Eigelb in einer glatten Bewegung durchbohrt. Die Spitze der Nadel sollte so nah wie möglich an der Blastodisc sein, vor der Auslieferung das Injektionsmaterial.
   1. Drücken Sie das Pedal um das Injektionsmaterial in das Eigelb zu liefern. Wenn die Blastodisc nicht deutlich sichtbar ist, kann das Injektionsmaterial in verschiedenen Orten im Eigelb verteilt werden. Um dies zu erreichen, wird die Nadel bis zum anderen Ende das Eigelb eingefügt, dann drücken des Pedals und zurückziehen der Nadelöhrs werden gleichzeitig durchgeführt, um das Injektionsmaterial durch verschiedene Bereiche der Dotter zu verbreiten. Bis zu 50 Nanoliter kann injiziert werden in das Eigelb von Channel Catfish Embryonen, aber, die Menge des Proteins gRNA/Cas9 für jedes Gen die besten Resultate für Mutation Rate und Embryo überleben³²optimiert werden muss.
4. Zurückziehen die Nadel glatt um das Ei zu beschädigen. Verschieben Sie die Petrischale, wieder ein Ei mit dem gleichen Verfahren zu injizieren. Vermeiden Sie Bewegung der Petrischale während des Einspritzvorgangs, da dies das Ei beschädigen oder Bruch der Nadel führen. Eiern, die gebrochen oder beschädigt durch Mikroinjektion zu entfernen. Injektion kann bei 15-20 min nach der Befruchtung begonnen werden und solange sind die Embryonen noch im Stadium einer Zelle (bis ca. 60-90 min nach der Befruchtung).
5. Legen Sie injizierte Embryonen zurück in Holtfreter Lösung mit 10 ppm von Doxycyclin und kontinuierliche sanfte Belüftung für 6 – 7 Tage bis zum Schlupf⁴⁰. Ändern Sie die Lösung täglich und entfernen Sie tote Embryonen.

(6) Mutation Erkennung

1. Nach dem Zufallsprinzip, sammeln Sie einige injizierte Embryonen bei 72 h Post Düngung, entfernen Sie das Eigelb und extrahieren Sie genomischen DNA. Enthalten Sie 3 – 5 nicht injiziert Embryonen als Steuerelement.
   Hinweis: Genomic DNA kann Embryonen nach der Entfernung der Eierschalen und Eigelb Material mit Proteinase K-Verdauung und Ethanol Niederschlag³²entnommen werden.
2. Ein DNA-Segment flankieren die genomische Ziele für gRNA jedes Gen, wo Mutationen auftreten, mit einem High-Fidelity Taq Polymerase³², voraussichtlich, zu verstärken. Für TICAM 1, die Primer 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (vorwärts) und 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (rückwärts) wurden verwendet, um eine 750 verstärken bp während für RBL, die Primer 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (vorwärts) und 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (rückwärts) wurden verwendet, um ein 375 bp-Segment aus dem RBL-gen zu verstärken.
   1. Verwenden Sie die folgende PCR-Reaktion: bis zu 20 µL PCR Grade Wasser; 1 X HiFi Taq Enzym Reaktion Puffer mit MgCl₂, 0,2 mM dNTP-mix, 0,4 µM für jeden der die vorwärts- und Grundierung von den gleichen Satz, 100-300 ng genomischer DNA und 1,25 Einheiten der High-Fidelity Taq Enzym Mischung. Führen Sie PCR Radfahren Bedingungen: erste Denaturierung bei 94 ° C für 3 min; 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 30 s, Glühen bei 60 ° C für 55 s für TICAM und 40 s für RBL, Erweiterung bei 72 ° C für 1 min/kb; und letzte Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten.
3. Die mutierten Embryonen mit einer Mutation Erkennungsmethode z. B. Sequenzierung des gereinigten PCR-Produkte, Landvermesser Mutation Erkennung Assay, Heteroduplex Mobility Assay, Verlust der Restriktionsenzym Anerkennung Website oder jeder andere Mutation Nachweisverfahren, das ist zu erkennen geeignet für das Ziel. Erkennen Sie in diesem Protokoll mutierte Embryonen mit Landvermesser Mutation Erkennung Assay für TICAM 1 und Verlust der Restriktionsenzym Schnitten SapI Website sowie Sequenzierung des gereinigten PCR-Produkte für RBL-gen.
4. Ermittlung der mutierten Allele Klonen Sie PCR-Produkte und Sequenz Vektoren aus einzelnen Kolonien. Die mutierten Allele, dargestellt in Abbildung 4 und Abbildung 6 kam von injizierten Embryonen. PCR-Produkte von sechs mikroinjiziert und 3 Kontrolle Embryonen für jedes Gen wurden zusammengefasst in zwei getrennten Röhren, für mikroinjiziert Embryonen und die andere für Kontrolle Embryonen, schnell geklont und 86 Vektoren für TICAM 1 und 48 Vektoren für RBL gen sequenziert, darunter 8 Reaktionen von 3 Kontrolle nicht injiziert Embryonen für jedes Gen-Sequenzierung.
5. Vergleichen Sie um verschiedene mutierten Allele zu identifizieren, die Sequenzen von mutierten Embryonen der Wildtyp-Sequenz mit einer DNA-Sequenz Alignment-Tool wie BLAST oder T-COFFEE.

Ergebnisse

Um die Effizienz des Protokolls Mikroinjektion zu demonstrieren, wurden entwickelt, um den Channel Catfish Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen Ziel gRNAs mikroinjiziert.

TICAM 1
DNA-Sequenzierung von Vektoren aus einzelnen Kolonien von aggregiert, geklonten PCR-Produkte ergab die Indel Mutationen in TICAM 1 gen induziert. Die Mutatio...

Diskussion

Ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen gen Knockout zu erreichen wurde vorgestellt. Injektion von CRISPR/Cas9 Eiweiß im Eigelb ist viel einfacher, spart Zeit und erfordert keine umfangreiche Ausbildung im Vergleich zu microinjecting die Blastodisc der einzelligen Embryonen, die die gängige Methode für die meisten Gentransfer und gen-Bearbeitung mit Fisch ist ^{30 , 42}. das aktuelle Protokoll erwies sich als erfolgreich bei ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reproboost implant	Center of Marine Biotechnology		Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%, sterile filtered
Stereo microscope	Olympus	213709	For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MPPI-3	For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MM33	For holding and controlling the movement of the injection needle.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 720	For pulling microinjection needles
Cas9 protein	PNA Bio Inc.	CP01	Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System	Roche Diagnostics, USA		For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries	Fisher Scientific		1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish	VWR	25384-302	For holding the embryos during the microinjection.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.
Holtfreter`s solution	Home Made		59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.