Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

Résumé

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Résumé

Le génome complet de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, a été séquencé, menant à plus grandes possibilités pour l’étude de la fonction du gène barbue. Knock-out du gène a été utilisé pour étudier ces fonctions de gènes in vivo. Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système est un outil puissant permettant de modifier les séquences d’ADN génomique pour altérer la fonction du gène. Alors que l’approche traditionnelle a été d’introduire CRISPR/Cas9 ARNm dans des embryons de cellule unique entre la microinjection, cela peut être un processus lent et inefficace dans le poisson-chat. Ici, un protocole détaillé pour microinjection des embryons de barbue avec CRISPR/Cas9 protéine est décrite. Brièvement, œufs et du sperme ont été recueillie et puis artificielle fécondation effectuée. Les œufs fécondés sont transférés à une boîte de Pétri contenant la solution de Holtfreter. Volume d’injection a été étalonné et ensuite guider RNAs/Cas9 ciblant le gène de la molécule (1 TICAM) adaptateur contenant du domaine récepteur péage/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) ont été microinjected dans le jaune d’embryons unicellulaire. Le coup de grâce de gène a réussi comme indels ont été confirmés par le séquençage de l’ADN. Les altérations de séquence de protéine en raison de ces mutations inclus déphasage et tronquée de protéine en raison de codons stop prématurés.

Introduction

Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre¹. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope². La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires^{3,4 , 5}.

La barbue de rivière (Ictalurus punctatus) est l’espèce de poisson-chat plus populaires dans l’aquaculture et les activités de pêche récréative aux États-Unis. Il y a un besoin croissant pour l’étude génomique fonctionnelle chez la barbue et le séquençage du génome complet du barbue améliore l’utilité des progrès récents en génomique édition outils^6,7. Comprendre la fonction du gène n’enrichirait pas seulement la recherche qui est actuellement menée sur le poisson-chat, mais pourrait également conduire à des programmes d’amélioration génétique plus efficaces pour améliorer l’industrie du poisson-chat. Une fois que les gènes critiques pour un trait donné d’intérêt sont identifiés, ils peuvent être utilisés pour améliorer génétiquement production poisson-chat par l’édition de génome pour générer des allèles bénéfiques, sélection pour ces allèles, supprimant les allèles préjudiciables, transfert les allèles avantageux grâce à la transgénèse, ou une combinaison de ces options. Combinant les meilleurs gènes pour différents traits commercialement bénéfiques provenant de différentes espèces dans un poisson améliorerait considérablement la productivité et la rentabilité de poisson production opérations⁸.

Knock-out du gène est une méthode directe pour étudier les fonctions de gènes in vivo. Mutations au niveau de l’ADN seront héritées par les générations futures qui faciliteront l’étude de leurs effets dans les différentes générations. Outils d’édition différents génomes ont été développés notamment zinc finger nucleases (ZFNs), transcription nucléases activator comme effecteur (TAPS) et groupés régulièrement dois‑je court palindrome répétitions/CRISPR-protéine associée à la 9 (CRISPR/Cas9 ) système^9,10,11,12.

Le système CRISPR/Cas9 est un outil puissant et efficace qui a été utilisé pour modifier des séquences d’ADN génomique y compris knock-out du gène chez les poissons à guidage RNA DNA in situ clivage^5,13. Le système est constitué d’un ARN guide (gRNA), qui détermine la séquence ciblée dans le génome et une enzyme d’endonucléase ADN, Cas9. Le système CRISPR/Cas9 peut être conçu pour cibler n’importe quelle séquence du génome avec plusieurs avantages par rapport aux ZFNs et TALENs : (1) plus bas coût d’ingénierie (2) plus facile fixation (3) plus spécifique du guide RNA de la séquence cible et réduit les mutations hors cible (4) plusieurs séquences peuvent être ciblées avec différent gRNA à la même vitesse de mutagenèse haute heure (5) dans les gènes qui ne pourrait pas être muté par TALENs et (6) taux de transmission meilleure lignée germinale des mutations pour jusqu'à 6 fois par rapport aux ZFNs et TALENs^{14, 15,16,17,18}.

L’autre principale méthode de microinjection est électroporation, dans lequel les impulsions électriques sont appliquées à des embryons ou des cellules pour augmenter la perméabilité de la membrane et l’absorption des molécules biologiques^19,20. Plusieurs poissons transgéniques ont été générés en utilisant l’électroporation comme medaka (Oryzias latipes), poisson zèbre (Danio rerio), le saumon chinook (Oncorhynchus tshawytscha), barbue, la dorade (Sparus sarba), et commune la carpe (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Électroporation a été utilisée pour fournir des protéines ADN, d’ARN et Cas9 de plasmide pour knock-out du gène. Dans les cellules de mammifères, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 ARNm/gRNA et des complexes de protéine/gRNA Cas9 ont été livrés à l’aide d’électroporation et les taux de mutagenèse étaient plus élevés utilisant des complexes de protéine/gRNA Cas9 pour la plupart électroporation conditions testées²⁷. Les chordés ascidies (Ciona intestinalis), TALENs exprimant les constructions étaient électroporation dans des oeufs fécondés pour induire la knockout de multiples gènes²⁸. ZFNs exprimant le plasmide constructions étaient électroporation pour assommer l’hormone lutéinisante dans barbue²⁹. Cependant, une fois introduit dans la cellule, des constructions de plasmide devra être transcrit à l’ARN et traduit en protéines fonctionnelles avant qu’ils peuvent cibler la séquence d’ADN désirée, ce qui retarderait probablement le temps de la mutagénèse par rapport à la microinjection d’ARN / protéine. Telle qu’un embryon se développe, mutagenèse retard augmente le mosaïcisme des fondateurs injectées. En outre, l’expression transgénique est peu susceptible d’atteindre le niveau d’expression possible avec microinjection, abaissant l’efficacité de la mutagénèse.

Comme un moyen pour introduire des outils d’édition du génome dans les cellules, microinjection présente plusieurs avantages sur électroporation. Génome, édition de molécules peut être fiable introduit dans des cellules ou des embryons par microinjection³⁰. Moins de matériel injection est nécessaire. Il est facile de déterminer les quantités de matériau injecté. Mutation plus élevée avec faible mosaïcisme chez les poissons du fondateur, les taux peuvent être réalisés qui améliorerait la transmission de la lignée germinale des mutations à F₁. Moins de poissons fondateur doivent être analysées pour produire la première génération, en raison du taux de mutation plus élevé. Dans l’électroporation, plus de poisson fondateur doivent être analysées qui augmentera les coûts. Cependant, la survie des embryons de barbue micro est inférieure à électroporation ceux, même si cela peut être surmonté en injectant plus embryons^31,32. Barbue de rivière, la survie des embryons de jaune d’oeuf-micro varie de 16 à 55 % selon les gènes ciblés et le dosage de la protéine gRNA/Cas9³².

Microinjection régulière des embryons de poisson-chat est techniquement difficile et chronophage, cependant, un protocole de microinjection de protéine CRISPR/Cas9 rapid et efficace est présenté pour les embryons de barbue. Ce protocole requiert moins de temps et expertise, puisque la solution protéique CRISPR/Cas9 est injectée dans le jaune d’un embryons de cellule. Des centaines d’oeufs fécondés peuvent être injectés en 1 h (environ le temps nécessaire à la première division cellulaire se produire). Pour valider le protocole, deux gènes reliés à la susceptibilité de la maladie ont été éliminés barbue, le gène molécule (TICAM1) adaptateur sans frais/interleukine 1 récepteur contenant du domaine et le gène de lectine (RBL) de liaison de rhamnose. 1 TICAM est impliqué dans la voie de signalisation initiée par récepteur toll-like (TLR) 3. Chez la barbue, TICAM 1 a considérablement augmenté suite à un tacle bactérien avec Edwardsiella ictaluri, alors qu’il était diminuée dans le poisson-chat bleu, une espèce résistante à ictaluri E.³³. RBL joue un rôle important dans l’infection précoce avec celui de Flavobacterium, l’agent causal de la maladie columnaris, où aiguë et upregulation robuste a été enregistrée chez une souche de barbue columnaris-sensible par rapport à un souche résistante à columnaris³⁴.

Protocole

Cette expérience a été menée au poisson Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Université d’Auburn, Alabama. Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette expérience ont été approuvées par l’Auburn University Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme (UA-IACUC) avant le début de l’expérience. Une liste du matériel et des fournitures utilisées dans cette expérience se trouvent dans la Table des matières. Voici les étapes et les procédures de préparation et de la microinjection d’embryons unicellulaire barbue tel qu’illustré à la Figure 1.

1. sélection de titres et de frai de géniteurs

1. Choisissez saine barbue de géniteurs de la souche ou lignée génétique d’intérêt. Femelles et mâles de barbue devraient montrer bon les caractères sexuels secondaires.
2. Sélectionner les mâles qui ont une tête large et musclée qui est plus large que le reste de leur corps avec la papille génitale bien développé. Couleur sombre, de cicatrices et de blessures de ces combats territoriaux sont aussi des signes de préparation sexuelle. Sélectionner les femelles qui ont des têtes qui sont moins larges que le reste de leur corps et ont un abdomen mou, palpable, bien équilibré. Pour une précision et d’éviter soulignant le poisson lors de la première manipulation, cesser de nourrir les femelles 2 ou 3 jours avant d’examiner leur état de préparation pour le frai.
3. Effectuer des poissons manutention rapidement, mais avec précaution. Pour réduire le stress de la manipulation, effectuez toutes les procédures nécessitant une manipulation femelles tout en maintenant le poisson fraie sacs (maillage de taille 32 mm).
4. Juste avant l’injection d’hormones pour induire l’ovulation, mesurer le poids des femelles.
5. Accrocher les sacs de reproduction avec des femelles à l’intérieur d’un flux par le biais de réservoir avec écoulement continu de l’eau et l’aération adéquate.
6. Conditions d’asepsie, charger l’implanteur qui a une aiguille de 14 G avec 85 µg/kg de l’hormone lutéinisante implant (LHRHa) analogue de l’hormone. Rincez le site d’injection (musculature dorsale) 0,9 % solution saline stérile avant l’injection. Insérez l’implanteur à un angle de 45° et libérer l’implant. Retirer l’aiguille et le coup du site d’injection avec un tampon d’ouate gonflée dans l’éthanol à 70 %.
7. Place le sac de frai dans le réservoir afin que le poisson soit totalement immergé dans l’eau 15 à 20 cm sous la surface de l’eau. Une aération adéquate (au-dessus de 5 ppm dissous d’oxygène) et bonne qualité d’eau sont importantes pour l’ovulation des oeufs de haute qualité.
8. Prédire le moment de l’ovulation basé sur la température de l’eau à l’aide de la relation de degré-heure (h)³⁵. Temps de réponse de degré-h = temps entre l’injection d’hormones et de l’ovulation (h) * température (° C) de l’eau. Par exemple, pour un temps de réponse de degré-h de 900 à 1 000, une femme est censée frayer à 36-40 h de temps d’injection de l’hormone à 25 ° C. Habituellement, la première vérification des oeufs se faite à environ 36 h après l’injection d’hormones, puis à intervalle de 4 h.
9. Pour vérifier l’ovulation, soulevez doucement le sac frai au-dessus de la surface de l’eau pendant que vous cherchez les oeufs qui sont fixées à l’intérieur du sac de frai. Voir au moins 10 oeufs indique cette femelle est ovulation et prêt pour le décapage de la main.

2. préparation de sperme

NOTE : Sperme peut être préparé quelques h avant l’heure prévue de l’ovulation.

1. Euthanasier les hommes par un percussion coup sur la tête sans anesthésie, car l’anesthésie peut avoir un effet négatif sur la motilité des spermatozoïdes.
2. Recueillir les testicules dans une petite casserole de pesage, supprimer n’importe quel tissu et lavez-les avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % pour enlever le sang, si nécessaire. Testicules bien développées sont blanches avec nombreuses projections villiformes ( Figure 2).
3. Déterminer le poids des testicules.
4. Pour préparer la solution de sperme pour la fécondation de l’ovule, transférer les testicules vers le centre de la maille 100 cm² 100 µm avec une pincette. Plier le maillage avec les testicules à l’intérieur, écraser les testicules et le sperme de filtre dans un tube de prélèvement de 50 mL. Cela peut être fait en appliquant une pression de testicules à l’intérieur de la maille contre le bord de la douille de la collection via le pouce. Solution saline à 0,9 % permet de laver le sperme de la maille dans le tube de prélèvement. Une solution saline peut ajouter jusqu'à 10 mL/g de testicules.
5. Déterminer la concentration des spermatozoïdes, vérifier la motilité et la viabilité.
   Remarque : La Concentration peut être déterminée en comptant les spermatozoïdes dans un volume connu de dilué de laitance utilisant un hémocytomètre. Alternativement, on peut estimer la densité du sperme en évaluant la densité optique de laitance à l’aide d’un spectrophotomètre. Dans cette méthode, l’absorption à la longueur d’onde de 505 nm est comparée à une Charte de contrôle qui a été préalablement préparée pour l’absorption des différentes concentrations de sperme³⁶. La motilité des spermatozoïdes peut être vérifiée au microscope comme le moment de l’activation des spermatozoïdes jusqu'à cessation de sperme mouvement (appelé durée de motilité)³⁷. La viabilité des spermatozoïdes peut être déterminée par le sperme avec des colorants sélectifs tels que le bleu de trypan qui tache de spermatozoïdes seulement non viables, tandis que les spermatozoïdes viables restera sans tache de coloration. Cependant, à ces opérations de microinjection, ce n’est pas nécessaire si les testicules sont bien développés.
6. Stocker le sperme dans une solution saline 0,9 % de l’étape de 2,5 à 4 ° C et utiliser dans les 24h après préparation.

3. collecte et fécondation des oeufs

1. Appliquez une très fine couche de matière grasse pour une propre et sèche pan de frai de 20 cm de diamètre.
2. Placer la femelle dans la solution anesthésique contenant 100 ppm de méthane-sulfonate de tricaïne tamponnée avec du bicarbonate de sodium (pH de la solution finale doit être 7.0) jusqu'à ce que le poisson soit complètement anesthésiés³⁸.
   ATTENTION : Méthane-sulfonate de tricaïne peut être irritant, s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau.
3. Avec précaution, retirez le poisson du sac frai et tremper dans une solution saline de 0,9 % à laver la solution anesthésique. Sécher le poisson complètement à l’aide d’une serviette propre, en évitant la suppression de la couche de mucus sur la surface de corps de poisson.
4. Appliquer shortening végétal sur la zone autour de l’évent, y compris les nageoires pelviennes, pour éviter la saisie des œufs pendant le stripping de la main.
5. Main la bande les oeufs dans la poêle graissée fraie en appliquant une légère pression aux ovaires. Bons oeufs devraient circuler librement, être de couleur jaune doré et très peu ou aucun amas ou des caillots de sang (Figure 2). Éviter tout contact entre les oeufs et l’eau avant la fécondation, car l’eau peut stimuler la fermeture du micropyle.
6. Pour fertiliser les oeufs à la microinjection, transférer 200 à 300 œufs dans un plat graissé de frai. Plante en plastique graissé étiquettes peut être utilisées comme une cuillère pour transférer les oeufs dans la poêle graissée fraie. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de sperme (de l’étape 2.5) aux œufs et mélanger doucement. Le ratio des spermatozoïdes à le œuf doit être environ 11 000 spermes/ovules.
7. Ajouter eau douce aux œufs pour activer le sperme et les ovules. Ajouter assez d’eau pour couvrir légèrement les œufs. Doucement agiter les oeufs pour 30 s. fécondation survient dans 1 à 2 min. Il est important de fertiliser les oeufs qui sont disposées en une seule couche. Oeufs de silure adhèrent les uns aux autres, compliquant la microinject des couches multiples d’embryons.
8. Ajouter plus d’eau douce pour les oeufs fécondés et laisser les oeufs à durcir pendant 10 à 15 min.
9. Couvrez la casserole fraie contenant les oeufs non fécondés restants par une serviette humide pour éviter le dessèchement et fertiliser pendant quelques heures. La fécondation peut se faire de manière échelonnée, par exemple, un lot de 200 à 300 oeufs peuvent être fécondés toutes les 30 à 60 minutes afin d’assurer un approvisionnement continu des embryons au stade une cellule pour la microinjection et embryons témoins non injectées. Éviter tout contact entre la serviette humide et les oeufs car les œufs peuvent adhérer à la serviette humide rendant difficile de les enlever. Dans ce protocole, oeufs fécondés dans les 2 – 3 h après le décapage ont été efficacement micro et avait un succès similaire comme œufs fécondés immédiatement après le décapage.

4. l’aiguille en tirant et chargement

1. Extraire un verre de borosilicate de 1,0 mm OD capillaire dans 2 aiguilles (Figure 3). Rangez les aiguilles dans une boîte de papier avec un morceau d’éponge dans laquelle plusieurs incisions ont été faites. Pour éviter de casser l’aiguille, le diamètre de l’éponge doit être inférieur à la longueur de la tige de l’aiguille.
2. Ouvrir l’extrémité de l’aiguille en brisant un petit morceau de région plus mince de l’aiguille à l’aide d’un objet pointu. Vous pouvez également ouvrir l’aiguille en pinçant au large de la région plus mince de la pointe avec une pince au microscope.
3. Préparer la solution d’injection en mélangeant gRNA(s) protéine Cas9. Autres types d’ARN ou protéine peuvent aussi être injectés avec la même procédure. Dans ce protocole, gRNAs ont été conçus pour cibler deux des gènes apparentés immunitaire barbue, gène de molécule (TICAM1) adaptateur contenant du domaine du récepteur toll/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) et préparées selon Shah et al.. avec l’utilisation d’une haute fidélité Taq polymérase^32,,³⁹. Les cibles génomiques de gRNAs étaient GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' pour TICAM 1 gène (Figure 4) 5' et 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' de l’exon 1 du gène RBL avec motif adjacent de protospacer (PAM) séquence soulignée (Figure 6).
   1. BLAST guide RNA cibles contre le génome de barbue de séquence et choisissent ceux avec aucun hors-cible des sites potentiels.
   2. Ajouter rouge de phénol à la couleur de la protéine gRNA/Cas9 mélanger à un tiers du volume total.
   3. Ajuster la concentration finale de protéine gRNA/Cas9 mélange avec de l’eau libre nucléase afin que chaque embryon est injecté avec le 50 nL contenant environ 2,5 ng gRNA et 7,5 ng Cas9 protéine. Incuber le mélange pendant 10 min sur la glace avant utilisation.
4. Avec un microloader, charger 5 à 10 µL du mélange gRNA/Cas9 dans l’aiguille d’injection en insérant le microloader dans la tige de l’aiguille et expulser le mélange lentement tout en rétractant la pointe de microloader (Figure 3). Ne pas emprisonner de bulles d’air à l’intérieur.
5. Fixer l’aiguille à l’exploitant une micropipette et assurer un lien étroit, puis visser le support sur le micromanipulateur. Garantir la libre circulation stable. Appliquer une pression de microinjection en ouvrant la bouteille d’azote et en ajustant le régulateur de pression.
   Remarque : Le volume d’injection peut être affecté par la pression, le diamètre de l’ouverture de l’aiguille et la durée de l’injection. Pour déterminer le volume à injecter, à injecter dans une goutte d’huile minérale sur un hémocytomètre. Si nécessaire, la pression, la durée de l’injection et le diamètre de l’aiguille peut être ajusté pour augmenter ou diminuer le volume de l’injection. Injecter plusieurs fois dans l’huile minérale pour volume cohérent.

5. la microinjection d’embryons de poisson-chat

1. Appliquez une très fine couche de matière grasse pour un plat de Pétri propre de 100 mm.
2. À l’aide d’une étiquette de plante en plastique graissé, transfert de 50 à 100 oeufs du bac de la fécondation à la boîte de Pétri et recouvrez-les avec la solution de Holtfreter (Table des matières). Aligner les oeufs uns contre les autres en une seule couche. Cet alignement doit maintenir les oeufs en place au cours du processus de microinjection.
3. Placez la boîte de Pétri avec les oeufs sur la scène du microscope et maintenez-le avec une seule main. Piquez l’aiguille avec l’autre main (Figure 3) jusqu'à ce qu’il perce le chorion et le jaune dans un seul mouvement fluide. La pointe de l’aiguille doit être aussi proche que possible de la blastodisc avant de livrer le matériel d’injection.
   1. Appuyer sur la pédale pour livrer le matériel d’injection dans le jaune. Si le blastodisc n’est pas clairement visible, le matériel d’injection peut se propager dans des lieux différents dans le jaune d’oeuf. Pour ce faire, l’aiguille est insérée à l’extrémité du jaune, puis appuyer sur la pédale et en retirant l’aiguille se font simultanément pour diffuser le matériel d’injection à travers différents domaines du jaune. Jusqu'à 50 microseringues peuvent être injectés dans le jaune de barbue d’embryons, cependant, la quantité de protéines gRNA/Cas9 doit être optimisée pour chaque gène obtenir les meilleurs résultats pour mutation embryon et taux de survie³².
4. Retirer l’aiguille en douceur pour éviter d’endommager le œuf. Déplacer la boîte de Pétri pour injecter un autre oeuf avec la même procédure. Éviter tout mouvement de la boîte de Pétri au cours du processus d’injection, car cela pourrait endommager le œuf ou de casser l’aiguille. Retirer les œufs s’est rompues ou endommagés en raison de la microinjection. Injection peut être démarré à 15 – 20 min après la fécondation et continuer aussi longtemps que les embryons sont encore en phase d’une cellule (jusqu'à environ 60 à 90 min après la fécondation).
5. Placez les embryons injectées en solution de Holtfreter contenant 10 ppm de doxycycline et continue aération douce pour 6 à 7 jours avant l’éclosion de⁴⁰. Changez la solution tous les jours et retirer les embryons morts.

6. détection de mutations

1. Au hasard, recueillir plusieurs embryons injectées à 72 h après la fécondation, enlevez le jaune et extraire l’ADN génomique. Inclure non injectés de 3 – 5 embryons sous forme de contrôle.
   Remarque : L’ADN génomique peut être extraites des embryons après enlèvement des coquilles d’oeufs et de matériel de jaune de œuf à l’aide de la digestion de la protéinase K et éthanol précipitation³².
2. Amplifier un segment d’ADN flanquant les cibles génomiques pour gRNA de chaque gène, où les mutations sont censées se produire, en utilisant une haute fidélité Taq polymérase³². Pour TICAM 1, les amorces 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (avec impatience) et 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un 750 bp alors que pour la RBL, les amorces 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (avec impatience) et 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un segment bp 375 du gène de la RBL.
   1. Utiliser la réaction PCR : jusqu'à 20 µL PCR l’eau de qualité ; 1 x haute fidélité tampon de réaction enzyme Taq avec MgCl₂, dNTP 0,2 mM mix, 0,4 µM pour chacun de l’apprêt avant et arrière de la même série, 100-300 ng ADN génomique et 1,25 unité de mélange d’enzyme Taq haute fidélité. Effectuer des conditions cyclisme d’amplification : dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à 60 ° C pendant 55 s pour TICAM et 40 s pour RBL, extension à 72 ° C pendant 1 min/kb ; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
3. Détecter les embryons mutants à l’aide d’une méthode de détection de mutation comme le séquençage des amplicons purifiées, test de détection de mutation arpenteur, analyse de mobilité hétéroduplex, perte du site de reconnaissance des enzymes de restriction, ou toute autre méthode de détection de mutation qui est approprié pour la cible. Dans ce protocole, détecter les embryons mutants à l’aide de test de détection de mutation arpenteur pour TICAM 1 et perte d’enzyme de restriction que SAPI couper site mais aussi de séquençage des produits PCR purifiés pour le gène de la RBL.
4. Afin d’identifier les allèles mutants, cloner des produits PCR et vecteurs de la séquence des colonies individuelles. Les allèles mutants présentés dans la Figure 4 et Figure 6 provenaient d’embryons injectées. Produits PCR de six micro et embryons de 3 témoins pour chaque gène ont été regroupées dans deux tubes séparés, un pour les embryons microinjectés et l’autre pour les embryons de témoins, rapidement clonés et 86 vecteurs pour TICAM 1 et 48 vecteurs de gènes RBL séquencé, dont 8 le séquençage de réactions de 3 embryons de témoins non injectés pour chaque gène.
5. Pour identifier les différents allèles mutants, comparer les séquences d’embryons mutants à la séquence de type sauvage à l’aide de n’importe quel outil d’alignement de séquence ADN comme BLAST ou T-café.

Résultats

Pour démontrer l’efficacité du protocole microinjection, gRNAs conçus pour cibler le barbue sans frais/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) et la rhamnose binding lectine (RBL) gène étaient micro.

TICAM 1
Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés a révélé les indel mutations induites dans le g?...

Discussion

Un protocole détaillé pour microinjection d’embryons de barbue d’atteindre knock-out du gène a été présenté. Injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans le jaune d’oeuf est beaucoup plus simple, fait gagner du temps et ne nécessite pas de formation approfondie par rapport à microinjecting le blastodisc de l’embryon unicellulaire, qui est la technique courante pour la plupart de transfert de gène et gène édition avec poisson ^{30 , 42}. le protocol...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reproboost implant	Center of Marine Biotechnology		Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%, sterile filtered
Stereo microscope	Olympus	213709	For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MPPI-3	For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Model MM33	For holding and controlling the movement of the injection needle.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 720	For pulling microinjection needles
Cas9 protein	PNA Bio Inc.	CP01	Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System	Roche Diagnostics, USA		For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries	Fisher Scientific		1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish	VWR	25384-302	For holding the embryos during the microinjection.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.
Holtfreter`s solution	Home Made		59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.
Doxycycline hyclate USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.