נפח גדול, תאורה בהתנהגותו רלוונטיות עבור Optogenetics אנושיות פרימטים

Summary

פרוטוקול לבנות של המאייר חודר לרקמות להעברת האור מעל בנפחים גדולים בקוטר מינימלי מוצג.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר של המאייר בנפח גדול, אשר פותחה עבור optogenetic מניפולציות במוח אנושיות הפרימטים. המאיר הוא ששונה סיב אופטי פלסטיק עם טיפ חרוט, כזה הוא האור emitting שטח > 100 x של סיבים קונבנציונלי. בנוסף מתאר את בניית המאיר בנפח גדול, פרוטוקול זה מפרט את כיול בקרת איכות להשתמש כדי להבטיח הפצה אפילו אור. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר שיטות עבור הוספת והסרה המאיר נפח גדול. שטחי ועמוק מבנים עשויים להיות מואר. המאייר נפח גדול זה אינו צריך להיות פיזית מצמידים אלקטרודה, כי המאיר עשוי פלסטיק, לא זכוכית, זה פשוט יתכופף בנסיבות כאשר סיבים אופטיים המסורתי היה מנפץ. כי המאייר הזה מספק אור על רקמות בהתנהגותו רלוונטיות עבור אמצעי אחסון (≈ 10 מ מ³) עם אין נזק חדירה גדולה יותר מאשר סיב אופטי רגיל, זה מקל על מחקרים התנהגותיים באמצעות optogenetics אנושיות פרימטים.

Introduction

כלי Optogenetic, המאפשרים שליטה עצביים אלפית שנייה מדוייק, מונחה אור נמצאים בשימוש נרחב ללמוד פונקציונלי פיזיולוגיה והתנהגות מכרסמים, חסרי חוליות. עם זאת, האתגרים הטכניים מוגבלת על השימוש optogenetics במוח אנושיות הפרימטים, אשר עוצמה ~ 100 x גדול יותר המוח מכרסמים ¹.

כדי להקל על מחקרים optogenetics קופים, מאייר היה שנועדה לתת מענה מתחרות שתי מטרות: נפח גדול תאורה ונזק חדירה מינימלי. ניסיונות קודמים לכתובת אחת הדאגות האלה הגיעו סוף יקר של האחר. חבילות של סיבים מאירות אחסון גדולים יותר אבל עם קוטר מוגברת, ולפיכך, נזק^2,3. סיבי זכוכית מחודדות להפחית נזק חדירה, אבל בקושי מיקוד האור כדי פולטות אור פני שטחים < 100 מיקרומטר^{2 4,5}. תאורה חיצוניים המוח דרך חלון בדורא עוקף את האתגר של חדירה נזק, עשוי לאפשר לתאורת נפח גדול, אבל זה יכול לשמש רק המוח שטחי מספר אזורים⁶.

כדי ליצור של המאייר קוטר בנפח גדול, קטן (איור 1 א'), קצה אופטי סיבים חום צמצום, את הליבה ואת חיפוי פלסטיק חרוט (איור 1bג). בניגוד סיבים אחרים מחודדות זה למקד את האור בנקודה צרה, מאפשר החריטה אור לברוח באופן שווה הצדדים של הטיפ, לפיכך, הפצת אור בהרחבה מעל שטח גדול (איור 1-de). מפני חדירה נזק הוא יחסי חדירה קוטר, המאייר הזה יש אין חדירה יותר נזק מאשר בד קונבנציונאלי, עדיין יש לו > 100 x האור פליטת אור ואזור מספק משטח להפכה עם 1/100th כוח אור צפיפות מוח פנטום (1.75% agarose) (איור 1e). דגם מונטה קרלו (איור 1f) ממחיש את ההבדל בהתפשטות אור בין סיבים קונבנציונאלי המאיר נפח גדול כאשר יש להם כוח אור שווה צפיפויות כאור שלהם פולטות משטחים. המאייר כל אחד בנפרד מכויל באמצעות כדור של שילוב (איור 2 א, ב') כדי להבטיח הפצה אפילו אור לאורך הקצה (איור 2 c).

המאייר נפח גדול זו אומתה עם optogenetic מניפולציה של התנהגות והן ירי עצביים פרימטים אנושיות. עשוי להתאים אישית את האורך עצה סיבים לכל אזור במוח, מפת שדה קלט בודדים של כל בעל חיים. המאיר יכול לזווג עם אלקטרודת חדירה להקלטות עצביים המתפרסים על האורך של תאורה. עוד, כי הסיבים יכולים לשאת בכל צבעי האור הנראה, זה ניתן לזווג עם כל של מולקולות optogenetic הזמינים הזמינים.

Protocol

הערה: כל ההליכים בבעלי חיים היו בהתאם להנחיות NIH, אושרו על ידי מסצ'וסטס המכון של טכנולוגיה הוועדה על החיה אכפת.

1. ייצור המאייר

1. משתמש בזוג מספריים חדות לחתוך קטע של 250 מיקרומטר קוטר פלסטיק סיב אופטי הוא לפחות 10 ס מ האורך הרצוי המאייר הכולל יותר.
2. להסיר 15-20 ס מ של פוליאתילן הג'קט מקצה לקצה סיב אופטי פלסטיק באמצעות חשפנית תיל מד 22.
3. לאבטח דיסטלי לרוב 3-5 ס מ בסוף הפשיטו הסיבים בתוך מלחציים vise שולחן.
4. אוחזת בקצה המעטפת של סיבי מתוח ביד אחת עם משיכה קבועה מתמיד. הסיבים צריך להיות מקביל לרצפה, בניצב סגן. לשמור על מתח קבוע על סיבים לאורך כל חימום וקירור (שלבים 1.5 ו- 1.6 להלן) כך הסיבים נשאר ישר ומתח ככל שכמות היין.
5. באמצעות הנמוכה ביותר של אקדח חום טמפרטורה כפול (570/1000 ° F,), מחממים את המקטע המטבחיים של סיבי עד זה הוא מדולל על קוטר של 60-100 μm, או על הקוטר של אדם.
6. לשמור על המתח התמידי על הסיבים תוך מתן אפשרות סיבים להתקרר. כשל כדי לשמור על מתח עלול לגרום סיבים תלתל.
7. לאשר את הקוטר של קצה ורקמת תחת מיקרוסקופ ויבתר. לחלופין, ניתן להשתמש במקום מחוגה.
   1. אם הסיבים אינה מספיק דק, חזור על שלבים 1.4 עד 1.6 כנדרש להשגת הקוטר עצה הרצוי.
   2. אופציונלי אם מחדש מושך, לשים סימן קטן-החלק הצר של הסיבים, אם זה להיות מחומם שוב כך המרכז של אקדח חום מטרות בחלק הצר של הסיבים.
   3. אם סיב דק מדי, להתחיל מחדש.
8. פעם הסיבים יש מלא מקורר לקוטר הרצוי הושגה, צבוט סיבים 3 ס מ בנקודה הצרה ביותר משני צדדיו. עם מהיר, חדים למשוך לאורך הציר של סיבי, הפרד את הצדדים כדי ליצור קצה מחודדות.
9. בחן על הקרע מיקרוסקופ העצה מחודדות תחת צריכת חשמל נמוכה (למשל, 4 X). אם העצה גרירות ממוזלגים או מקופלת ( איור 1f), למחוק הסיבים.
10. הכן לחרוט את הטיפ ישרים על ידי הנחת נייר-דבק המעבדה ליד הקצה של הקצה, עוזב את האחרון 5 מ מ חשוף. הקלטת מגן הסיבים איכול מעל לאורך הרצוי של פליטת אור. אורך עצה זו נבחרה בהתבסס על עובי של קליפת המוח בקופים באזור היעד. יכול להיות חשופים באורך ארוכים או קצרים יותר בהתאם לאורך הרצוי של תאורה. אם אורך עצה איכול שונים רצוי, הקצה של הקלטת למעבדה יכול להיות התקרבה או רחוק יותר את הטיפ מחודדות.
11. קיפול ריבוע קטן (~ 1 אינץ ' x 2 אינץ ') של גיליון מוזמים סיליקון קרביד 5 μm מעל בין האגודל לאצבע. המקום קצה סיבים בין שני הצדדים של הגיליון מוזמים, בעדינות לחרוט סיבים באמצעות תנועה סיבובית קטנה, כאילו מתגלגל של BB בין האגודל לאצבע. לעתים קרובות לסובב הסיבים כך כל הצדדים הם חרוט באופן שווה. תופיע העצה סיבים “ roughened ” בעין בלתי מזוינת באזורים יש כבר חרוט, בעוד אזורים האו ם חרוט בדרך כלל מופיעים חלק.
12. חזור על שלב 1.11 עם 3 μm אלומיניום אוקסיד משכשכים גיליון.
13. מוספית מחבר בקצה המאיר מול הקצה חרוט. זה מאפשר את אלומת האור לחבר כבל אופטי או לייזר.
    הערה: שיטה זו שונה מן השיטה המועדפת לתיקון זכוכית / סיליקה סיבים אופטיים ב- ferrules. כי ferrule מתכת קשה יותר סיבים אופטיים פלסטיק, ליטוש של סיבים ו ferrule כיחידה לאחר הדבקה עלולה לגרום נזק סיבים אופטיים פלסטיק כמו רסיסים זעירים של מתכת המיוצר בתהליך ליטוש ניתן להטמיע את עצמם סיבים ביקע שטוח.
    1. להסיר כ- 5 מ"מ של עטיפת פוליאתילן מהקצה הנגדי של המאיר באמצעות חשפנית תיל מד 22.
    2. לחתוך את הקצה הנגדי שטוח עם סכין חם להחלקת פני השטח.
    3. פולני הצד הנגדי שטוח עם משכשכים במרוכז פיינר גליונות: 5 מיקרומטר, 3 μm, 1 μm ו- 0.3 מיקרומטר.
    4. להוסיף את הדירה מול הקצה לתוך מיקרומטר 260 הקוטר הפנימי פלדת אל-חלד ferrule עד שזה יהיה מיושר עם סוף ferrule.
    5. חזותית לאשר כי הצד הנגדי הוא בצורה חלקה, אחיד מלוטש עם מיקרוסקופ סיב.
    6. הסיבים להסיר ferrule ותדביקי את ferrule אנכית, בקצה שולחן עם סיבים מצביעה למטה.
    7. ממלאים מזרק 1 מ"ל עם אפוקסי פלסטיק ולחבר מחט מד 18 הקהה המזרק.
    8. השתמש את המחט כדי להחיל אפוקסי למטה לתוך ferrule. למלא את ferrule לחלוטין עם אפוקסי.
    9. להוסיף הסיבים ferrule.
    10. למחוק את כל אפוקסי עודף ממשטח מלוטש של סיבי עם מגבון לח נטולת מוך לפני ייבוש במידת הצורך. אחרת, ניתן להסיר עודפי אפוקסי לאחר ה 12-24
    11. לאחסן הסיבים בעדינות עד כיול ומניחים כובע אבק מעל ferrule.

2. המאייר כיול ובקרת איכות

הערה: שיטות אלה לצורך כיול להעריך עבור פלט אור אי-ליניאריות במרחקים שונים מהקצה של הסיבים. הפצה אור אחידה נובעת בדרך כלל “ באמפי ” או “ גלי ” להתחדד.

1. צור מיגון קל הסרעפת עבור החלק העליון של הספרה שילוב באמצעות אור קליטת רדיד ( איור 2).
   הערה: ללבוש כפפות בכל פעם טיפול אור קליטת בנייר כסף כדי למנוע העור שמנים מיצירת כתמים המשקף האור.
   1. קפל 2 ” על ידי 4 ” פיסת אור קליטת רדיד על עצמו להקים 2 ” x 2 ” מרובע. שיטה חלופית הוא לחתוך 2 ” x 2 ” מרובע עם קליטת צד אחד האור, אור אחד המשקף בצד (קרי בצד של רדיד אלומיניום רגיל); עם זאת, שיטת מקפלים-over היא בטוחה יותר מכיוון שהוא מספק יתרון משעמם לטיפול הסרעפת שלב הבא.
   2. לקפל מעבדה קלטת או איזולירבנד לאורך קצות הכיכר לקשור את הקצוות הלא מקופלת. זה יחזיק את הצדדים וגם מגן מפני חתכים מכל קצוות חדים.
   3. לנקב חור במרכז הכיכר באמצעות מחט מד 26.
   4. להסיר את הבורג גדול המכסה לספרה שילוב ולכסות את הפתח עם הסרעפת. מקם את החור מעל המרכז. אם הסרעפת נוצר עם אחד סופג אור, אור אחד המשקף בצד, למקם את קליטת בצד את האור והאור המשקף בצד למטה, מול החלק הפנימי של הספרה שילוב.
      הערה: כדי למנוע אבק ופסולת להיכנס לספרה שילוב וכדי לשמור על החור ממורכז, לאבטח את הסרעפת אל מחוץ לספרה שילוב עם המעבדה קלטת.
2. מידה אור פלט לאורך הקצה בתוספות מיקרומטר 500 באמצעות micromanipulator או stereotaxic ואת הספרה שילוב של.
   הערה: בטיחות משקפי מגן של הגל המתאימים לענידה בכל פעם הלייזר מופעל.
   1. חבר את הקצה השני של סיבי לייזר או אור מקור, אך אינן מפעילות את האור פלט עדיין.
   2. לאבטח את אלומת האור כדי בעל stereotaxic (preferably מעבדה טייפ) עם קצה 7-10 מ מ מתחת לתחתית של בעל.
   3. בורג בעל stereotaxic לתוך הזרוע stereotaxic
   4. יישר את קצה המאיר עם החור במרכז הסרעפת. אפס את micromanipulator כאשר בקצה נמצא בדיוק באותה רמה כמו הסרעפת.
   5. לכבות את האור בחדר ואפס לספרה שילוב.
   6. להפעיל את הלייזר (או מקור אור) ולמדוד את סך כל הכוח אור הפלט באמצעות הספרה שילוב.
      הערה: השתמש תפוקת האור הנמוך ביותר האפשרי לבדיקה וכיול.
   7. להוריד את מיקרומטר סיבים 500 אל תוך שילוב כדור, חזור על השלב 2.2.6.
   8. המשך הפחתת הסיבים לתוך הספירה שילוב ומדידת פלט אור הכולל בתוספות מיקרומטר 500 עד הנהגים רמות כוח האור הכולל
      התראה: הכולל מטען קל צריך גובה, ברגע הטיפ כולו במרחב. לא ימשיכו להוריד הסיבים יותר מ 1-2 מ מ מעבר חרוט עצה אורך. אם העצה קשר בתחתית של הספרה שילוב, זה עלול להמיס ו/או להרוס את הספרה שילוב.
3. לאשר של סיב אחיד חרוט על ידי התוויית הכולל מטען פלט כמו פונקציה כמה רחוק סיבי הנמיך לתוך הספירה שילוב לאשר ליניאריות.

3-in Vivo תאורה

הערה: כאן, שיטות אלה מוצגים באמצעות מודל פלסטיק במקום הפרימטים אנושיות.

1. שתל חדר הקלטה בקוטר 25 מ מ הושתל מעל האזור במוח עניין לפני ניסויים.
2. לבצע אנטומי דימות תהודה מגנטית (MRI) לפני הניסויים. להציב רשת הקלטה מותאמת אישית בבית הבליעה ולמלא אותה עם חומר סיכה כירורגי סטרילי כדי לאפשר רשת ויזואליזציה והנחישות של הרמה של המבנים במוח דורא ואת היעד.
3. להכין מגדל של מיקרו נסיעה לפני כל מפגש הבדיקה.
   1. מוספית צינור מדריך מד 25 עם קצה משופע לאמצע והתחתון מלחציים בכונן. שני תופסנים משמשים כדי להבטיח כי צינור המדריך נשאר ישר. שניהם במלחצות ניתן להעביר באופן ידני אם תרצה.
      הערה: יכול להיות epoxied או מולחמים את התפסים ברכבת התחתית מדריך.
   2. אבטח המאיר נפח גדול ב המלחציים העליון באותו כונן. זה מחובר המנוע כונן.
   3. חוט המאיר בנפח גדול דרך הצינורית מדריך מלא, לאשר קצה המאיר מרחיב מעבר לקצה הצינור מדריך.
      הערה: האורך של המאייר המרחיבה לעבר קצה הצינור מדריך שווה למרחק מן השכבה הקשה של המוח לשוליים התחתון של האזור במוח היעד, כפי שנקבע באמצעות MRI.
   4. להשרות את מדריך שפופרת ואת המאייר תמיסת חיטוי (למשל, chlorohexidine) לחטא.
4. להציב רשת סטיריליים מותאמות אישית בתוך החדר נקי ואבטח אותו בכל כיוון שנקבעו מראש עם בורג בצד החדר. הרשת המוצג כאן יש מרווח בין 1 מ מ; עם זאת, המרווח ניתן להתאמה אישית לפי הצורך.
   הערה: זה צריך להיות זהה הרשת ואת כיוון ההדפסה המשמשים ה MRI אנטומיים.
5. מאובטח בעל מיקרו-כונן סטיאוטטי על תא הקלטה בכיוון שנקבע מראש.
6. משכי המאיר סטיריליים ברכבת התחתית מדריך על ידי משיכת המאיר את באמצעות מלקחיים סטרילי, בוטה. קצה המאיר אמור להיות 5-10 מ מ מעל קצה צינור מדריך.
   הערה: המאיר תשתחוו כלפי חוץ בין הצינור מדריך את המלחציים. זה לא יגרום נזק המאיר גמיש.
7. מוספית המיקרו-הכונן המחזיק ולמקם את הצינור מדריך לחור רשת היעד.
8. להוריד את הבמה מיקרו-נסיעה עד ברכבת התחתית מדריך פשוט דרך ברמת של דורה.
   הערה: אם רצונך בכך, מיקרו-כונן נוסף עם אלקטרודה ניתן להציב על הבמה ו הנמיך לתוך חור רשת שונים. השדה המקומי פוטנציאליים על אלקטרודה זו יציג חפץ אור תלויי-מרחק, אשר יכול לשמש כדי לאשר השמה המאייר.
9. ניסיון התחתונה המאיר ידנית עם מלקחיים סטרילי.
   1. אם יש התנגדות כלשהי, משכי המאיר 5 - 10 מ מ, לחכות 10 דקות כדי לאפשר את הרקמה להתיישב ולנסות שוב.
   2. אם יש עדיין ההתנגדות על ניסיון שני, משכי בקצה המאייר לתוך מדריך ברכבת התחתית התחתונה המדריך צינור 0.25 mm, ולאחר מכן נסה שנית.
   3. חוזר עד השקופיות המאייר דרך הצינורית מדריך ללא כל התנגדות.
   4. להוריד את אלומת האור עד שזה מתוח.
      התראה: . אל תלחצי המאיר בכוח כנגד התנגדות. במקרים אלה ברכבת התחתית מדריך בדרך כלל לא חדרו השכבה הקשה של המוח באופן מלא. דוחפים הסיבים בכוח יגרום לו לסמוך על עצמו, מניעת הסיבים של הזנת המוח והשמדת ואולי הטיפ ( איור 1 g)-
10. להתחבר את ferrule בקצה השני של המאיר אופטיקה גדולות יותר להגדיר או לייזר.
11. ודא בלי אור אינו גלוי פרימטים אנושיות.
    1. להשתמש האפלה מיגון או אור קליטת לסכל באופן מלא גם המגדלים הקלטה.
    2. למקם את כל החיבורים אופטי במעטפות מסוככים קליטת רדיד האור.
    3. מגן כל תיקון הכבלים או אור קליטת בנייר כסף או איזולירבנד שחור.
    4. זהירות נוסף, למקם את בנק דיודות פולטות אור (LED) דמה באותו צבע האור בשימוש הניסוי מאחורי הפרימטים אנושיות, פלאש הנוריות ברציפות ב- 2.5 Hz. פעולה זו מונעת את העיניים להסתגל באופן מלא החושך. אם יש זליגת אור בהיסח הדעת, האור המהבהב הזה יעזור למנוע את הדליפה תצהירו מלשמש גורם התנהגותי.

תוצאות

התאורה של אמצעי אחסון מוח גדולה אנושיות פרימטים מאפשרת תמרון optogenetic רלוונטי בהתנהגותו. אקר. et al. (2016) בשימוש זה המאייר נפח גדול עם Halorhodopsin אדום-העביר, מלתעות ⁷ ללמוד את התרומה הטמפורלי של השדה חזיתית העין (FEF) מונחה זיכרון saccades ב שני קופי רזוס. באופן ספציפי, נוירונים FEF היו מוז?...

Discussion

בעוד optogenetic כלים נמצאים בשימוש נרחב לחקר מחלת ופיזיולוגיה של מכרסמים, האתגר הטכני של אמצעי אחסון מוח גדולה זרחני מוגבל השימוש optogenetics אנושיות פרימטים. חלוצי מחקרים בקופים בשימוש צפיפות מטען גדול (~ 100 מ"מ/mW² מ"מ/W 20²) כדי להאיר כרכים קטנים, אולי < 1 מ³ודווח על תופעות התנהגותיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic optical fiber	Industrial fiber optics	SK-10	250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 °F
Lab marker	VWR	52877
Dissection microscope	VistaVision	82027-156	Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape	VWR	89097-972	4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet	ThorLabs	LF5P	5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet	ThorLabs	LF3P	3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet	ThorLabs	LF1P	1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet	ThorLabs	LF03P	0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife	Industrial fiber optics	IF370012	60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope	ThorLabs	FS201	optional
Stainless Steel Ferrule	Precision fiber optics	MM-FER2003SS-265	265 micron inner diameter
1 mL syringe	BD	14-823-30	Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy	Industrial fiber optics	40 0005
18 gauge blunt needle	BD	305180	1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe)	ThorLabs	KW32	available from many vendors
Light absorbing foil	ThorLabs	BKF12
Electrical tape	3M	Temflex 1700	Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle	BD	305111	0.5 inch length
Micromanipulator	Siskiyou	70750000E	may substitute other brands/models
Steretactic arm	Kopf	1460	may substitute other brands/models
Laser safety goggles	KenTeK	KCM-6012	must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source	vortran	Stradus 473-50	example of blue laser
Integrating sphere	ThorLabs	S142C	Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber	Crist instrument company	6-ICO-J0	Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps	NAN	DRTBL-CMS
Guide tube	Custom	N/A	Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system	NAN	NANDrive
Custom grid design	custom	custom	plans available upon request
Blunt forceps	FischerScientific	08-875-8A	generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers	Neiko	01407A	available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable	ThorLabs	FG200LCC-custom	This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps	ThorLabs	CAPF	Package of 25
ceramic split mating sleeve	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S