Büyük hacimli, insan dışı primatlar Optogenetics için davranışsal ilgili aydınlatma

Özet

Işık büyük birimlerde en az çapı ile teslim etmek için bir doku delici ışığının oluşturmak için bir protokol sunulmuştur.

Özet

Bu iletişim kuralı optogenetic manipülasyonlar insan dışı primat beyin için geliştirilmiş bir büyük hacimli ışığı açıklar. Işık yüzey alanı yayan maddedir ışığı ile kazınmış uç, değiştirilmiş bir plastik optik fiber böyle > 100 x o geleneksel bir elyaf. İnşaat büyük hacimli ışığının açıklayan ek olarak, bu iletişim kuralı bile hafif dağıtım sağlamak için kullanılan kalite kontrol kalibrasyon ayrıntıları. Ayrıca, bu iletişim kuralını ekleme ve büyük hacimli ışığı kaldırmak için teknikler açıklanır. Yüzeysel ve derin yapıları aydınlatılmış. Bu büyük hacimli ışığı fiziksel olarak bir elektrot birleştiğinde olabilir gerekmez ve ışığı, değil cam, plastik çünkü geleneksel optik lifler paramparça ne zaman o sadece durumlarda Bükülür. Bu ışığı davranışsal ilgili doku birimlerde (≈ 10 mm³) daha fazla penetrasyon hasar daha geleneksel bir fiber optik ile ışık sunar çünkü davranış çalışmalar optogenetics insan dışı primatlar kullanarak kolaylaştırır.

Giriş

Milisaniye kesin, ışık odaklı nöronal denetimi için izin Optogenetic araçları yaygın fonksiyonel fizyolojisi ve kemirgenler ve omurgasızlar davranışı incelemek için kullanılır. Ancak, teknik sorunlar optogenetics ~ 100 x kemirgen beyin ¹' den daha büyük bir hacme sahip insan dışı primat beyin kullanımı sınırlı olabilir.

İnsan dışı primatlar çalışmalarda optogenetics kolaylaştırmak için bir ışığı iki rakip gol gidermek amacıyla tasarlanmıştır: büyük hacimli aydınlatma ve en az penetrasyon hasar. Adres bu kaygıları için önceki girişimleri diğer pahalı geldim. Demetleri lifleri aydınlatmak daha büyük birimleri ancak artan çap ve böylece, hasar^2,3. Konik cam elyaf azaltmak penetrasyon hasar, ancak dar odak ışık ışık yüzey alanlarını yayan < 100 µm^{2 4,5}. Dış beyin aydınlatma dura bir pencereden sınama penetrasyon hasar kaçınmanızı sağlar ve büyük hacimli aydınlatma için izin verebilir, ancak yalnızca bir kaç yüzeysel beyin alanları⁶için kullanılabilir.

Büyük hacimli, küçük çaplı ışığı (Şekil 1a) oluşturmak için bir plastik fiber konik ısıdır ve çekirdek ve kaplama optik ucu (Şekil 1bc) kazınmış. Işık dar bir noktaya odaklanmak diğer konik lifleri, gravür ışık eşit olarak dışarı belgili tanımlık uç, böylece, ışık geniş geniş bir alanı (şekil 1 de) dağıtma kenarlarında kaçmak izin verir. Penetrasyon hasar penetrasyon çapı için orantılı, bu ışığı penetrasyon hasarı daha geleneksel bir lif vardır, henüz o vardır çünkü > 1 ile daha geniş yüzey alanı ve sunar ışığı yayan ışık x 100/100 ışık güç bir beyin hayalet (%1,75 özel) dansitesi (şekil 1e). Onlar kendi ışık yayan yüzeyler eşit ışık güç yoğunlukları varken Monte Carlo modeli (şekil 1f) hafif formada geleneksel bir elyaf ve büyük hacimli ışığı arasındaki farkı gösterir. Her ışığı tek tek (şekil 2a, b) ucu (Şekil 2 c) boyunca bile hafif dağıtım sağlamak için entegre bir küre kullanılarak kalibre edilmiş.

Bu büyük hacimli ışığı davranış ve insan dışı primatlar nöronal ateş etmeye optogenetic manipülasyon ile doğrulandı. Fiber ucu uzunluğu herhangi bir beyin bölgesinde ve her hayvanın bireysel alıcı alan eşleştirme için özelleştirilebilir. Işığı aydınlatma uzunluğu span nöronal kayıtları için derinlemesine bir elektrot ile eşleştirilmiş. Çünkü lif herhangi bir renk görünür ışığın taşıyabilir, Ayrıca, bu herhangi bir kullanılabilir kullanılabilir optogenetic molekülleri ile eşleştirilmiş olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: tüm hayvan yordamlar NIH kılavuzlarınıza uygun olarak vardı ve tarafından Massachusetts Institute of teknoloji Komitesi hayvan bakım kabul edildi.

1. ışığı imalat

1. 250 µm çapı plastik en az 10 cm istenen toplam ışığı uzunluktan daha uzun olan fiber optik bir bölümünü kesmek için keskin makas çifti kullanın.
2. 15-20 cm polietilen ceket plastik fiber optik 22 ölçüm tel striptizci kullanarak bir ucundan kaldır.
3. Distal güvenli bir tablo mengene kelepçe lif soyulmuş ucunun çoğu 3-5 cm.
4. Lif ceketli sonu gergin bir sürekli sabit çekme ile bir elinde tut. Fiber ahlak dik yere paralel olmalıdır. Isıtma ve soğutma bu incelir gibi lif düz ve gergin kalması (adımları 1,5 ve 1,6 aşağıdaki) boyunca lif üzerinde sürekli bu gerginlik korumak.
5. Çift sıcaklık ısı tabancası (570/1000 ° F,), en düşük fiyat ayarı kullanarak fiber soyulmuş bölüm çapı 60-100 mikron veya insan saçı çapını hakkında için inceltilerek kadar ısı.
6. Sürekli gerginlik üzerinde lif lif soğutmak izin verirken korumak. Başarısızlık gerginlik korumak için kıvırmak lif neden olabilir.
7. Diseksiyon mikroskop altında inceltilmiş uç çapı onaylayın. Alternatif olarak, bunun yerine Çap pergeli birini kullanabilirsiniz.
   1. Fiber yeterince ince değil, 1.4 ile 1.6 istenen uç çapı ulaşmak için gerektiği gibi yineleyin.
   2. İsteğe bağlı yeniden çekerek eğer koyarsanız küçük bir işareti lif en dar kısmı böylece ısı silah ortasına lif en dar kısmı hedefleyen bu tekrar ısıtılmış.
   3. Lif çok ince ise, baştan.
8. Fiber tam soğuduktan sonra elde istenen çap, lif en dar noktası 3 cm üstünde ikisinden biri yan çimdik. Hızlı bir çekme lif ekseni boyunca keskin, konik ipucu oluşturmak için iki ayrı.
9. Altında bir düşük güç (örneğin, 4 X) konik uç diseksiyon mikroskop üstünde inceleyin. Ucu çatallı veya ( şekil 1f) kıvrılmış, fiber atın.
Laboratuvar bant son 5 mm maruz bırakarak uç, sonuna yakın bir parçası yerleştirerek konik ucunu Etch
10. hazırla. Bant gravür ışık emisyon İstenilen uzunlukta yukarıda lif korur. Bu ipucu uzunluğu primat korteks hedef bölgedeki kalınlığına göre seçildi. Daha uzun veya daha kısa uzunluğu aydınlatma istenilen uzunluğa bağlı olarak maruz olabilir. Farklı etch ucu uzunluğu isterseniz, laboratuvar bant kenarına yakın için veya uzak konik ucunu taşınabilir.
11. , Başparmak ve işaret parmağı arasında küçük (~ 1 inç x 2 inç) kare 5 mikron silikon karbid alıştırma sayfası üzerinden katlayın. Alıştırma sayfası iki taraf arasında fiber ucu yerleştirin ve yavaşça küçük dairesel hareketler kullanarak fiber sanki bir BB başparmak ve işaret parmağı arasında inişli çıkışlı etch. Sık sık tüm tarafların eşit olarak kazınmış lif döndürür. Fiber ipucu görünür “ pürüzlü ” un kazınmış alanları genellikle düzgün görünür iken, kazınmış alanlarda çıplak gözle.
12. Sayfası alıştırma 3 μm kalınlığında alüminyum oksit ile tekrar adım 1.11.
13. Işığı kazınmış ipucu ters ucunda bir bağlayıcı yapıştırmayın. Bu bir optik kablo veya lazer ışığı sağlar.
    Not: Bu yöntem cam tamir için tercih edilen yöntem farklı / silika optik lifler halkalar. Metal yüksük plastik Optik lif, lif ve hakla sonra yapıştırma zarar verebilir bir birim olarak parlatma daha sert plastik fiber optik olarak küçük parçaları metal parlatma işlemi sırasında üretilen çünkü kendilerini düz i ciddi lif katıştırabilirsiniz.
    1. 5 mm polietilen ceket 22 ölçüm tel striptizci kullanarak ışığı ters sonundan kaldırın.
    2. Ucunu yüzeyi pürüzsüz düz bir sıcak bıçak ile kesmek.
    3. Gittikçe daha hassas alıştırma ile düz ucunu Lehçe sayfaları: 5 mikron, 3 mikron, 1 mikron ve 0.3 µm.
    4. Düz eklemek bir 260 µm iç çap paslanmaz çelik yüksük kadar yüksük sonu ile aynı hizada ucunu karşısında.
    5. Görsel olarak karşı tarafındaki diğer ucuna düzgün ve eşit bir lif mikroskopla parlatılır onaylayın.
    6. Fiber yüksük kaldırmak ve aşağı dönük fiber yüksük dikey olarak tablonun kenar bant.
    7. 1 mL şırınga plastik epoksi ile doldurun ve bir künt 18 gauge iğne şırıngaya takın.
    8. İğne yüksük aşağı epoksi uygulamak için kullanın. Yüksük tamamen epoksi ile doldurmak.
    9. Lif yüksük takın.
    10. Herhangi bir aşırı epoksi cilalı yüzey fiber gerekirse kurutma önce ıslak bir hav bırakmayan silin silin. Aksi takdirde, aşırı epoksi-ebilmek var olmak çıkarmak sonra 12-24 h.
    11. Lif yavaşça kalibrasyon kadar saklamak ve toz kapağı üzerinde yüksük yerleştirin.

2. Işığı kalibrasyon ve kalite kontrol

Not: ışık non-lineer fiber ucundan farklı mesafelerde çıktı için bu yöntemleri kalibrasyon için değerlendirmek. Genellikle düzensiz ışık dağılımı sonuçları bir “ inişli çıkışlı ” veya “ dalgalı ” konik.

1. Bir ışık koruyucu oluştur diyafram ışık emici folyo ( Şekil 2) kullanarak entegre küre üst için.
   Not: Ne zaman cilt önlemek için folyo emici işleme ışık ışık yansıtan lekeler oluşturmasını yağlar eldiven giymek.
   1. Kat 2 ” 4 ” parça folyo emici üzerinde kendi üzerinde bir 2 oluşturmak için ışık ” x 2 ” Meydanı. alternatif bir yöntem olduğunu bir 2 kesmek için ” x 2 ” kare bir ışık emici yan ve yan (Yani yansıtan bir ışık ile Standart alüminyum folyo bir tarafı); Sonraki adım. diyafram işlemek için sıkıcı bir kenar sağlar ancak, katlanır yöntemi daha güvenlidir
   2. kat laboratuvar teyp veya olmayan katlanmış kenarları bağlamak için kare kenarları boyunca Elektrik bandı. Bu her iki taraf bir arada tutan ve kesikler keskin kenarlar üzerinden karşı korur.
   3. 26 gauge iğne kullanarak meydanın ortasına bir delik delmek.
   4. Entegre küre büyük kap üzerinde çıkarın ve açılması diyafram ile kaplayın. Delik merkezine yerleştirin. Diyafram bir ışık emici ve yan yansıtan bir ışık ile oluşturulursa, yer kadar yan emici ışık ve aşağı, entegre küre içine bakacak şekilde yan yansıtan ışık.
      Not: Toz ve enkaz entegre küre girmesini önlemek için ve ortalanmış delik için diyafram laboratuvar bant ile entegre küre dışına güvenli.
2. Ölçü hafif bir micromanipulator veya stereotaksik kol ve entegre bir küre kullanılarak 500 µm artışlarla ipucu boyunca çıktı.
   Not: Lazer üzerinde olduğunda uygun dalga boyu koruyucu gözlük takılmalıdır.
   1. Fiber karşı tarafındaki diğer ucuna bir lazer veya ışık bağlanmak kaynak, ama henüz çıkış ışık tetiklemek değil.
   2. Işığı stereotaksik sahibi (prefe için güvenlirably laboratuvar bant ile) ucu sahibinin alt altında 7-10 mm.
   3. Vida stereotaksik indirdiğimde stereotaksik yuvasına
   4. Işığı diyafram ortasına delikle hizalayın. İpucu diyafram tam olarak aynı düzeyde olduğunda micromanipulator sıfır.
   5. Turn off Oda ışıkları ve entegre küre sıfır.
   6. Lazer (veya diğer ışık kaynağı) tetikler ve entegre küre kullanarak çıkış toplam ışık gücü ölçmek.
      Not: Kalibrasyon test etmek için olası en düşük ışık çıkışını kullanın.
   7. Lif 500 µm entegre Küre ve tekrar içine adım 2.2.6 indirin.
   8. Lif entegre küre düşürücü ve 500 µm artışlarla toplam ışık verimi toplam ışık gücü düzeyleri kapalı kadar ölçme devam
      Uyarı: Bir kez tüm belgili tanımlık uç Küre'ye toplam ışık gücü kapalı seviyesine. Fiber düşürmeye devam kazınmış ötesinde daha--dan 1-2 mm uzunluğu ipucu. Entegre küre alt ucu temasa geçerse, o eritebilir ve/veya entegre küre berbat.
3. Toplam ışık gücü gibi bir işlev ne kadar lif doğrusallık onaylamak için entegre küre içine düşürüldü çıkış komplo tarafından eşit şekilde kazınmış bir lif onaylayın.

3. Vivo içinde aydınlatma

Not: burada, bu yöntemlerin bir insan dışı primat yerine plastik bir modeli kullanarak gösterilir.

1. İmplant 25 mm çapında kayıt odası deneme önce ilgi beyin alan üzerinde implante.
2. Deneme önce anatomik manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gerçekleştirin. Odasında bir özel kayıt ızgara koyun ve kılavuz görselleştirme ve dura ve hedef beyin yapıları düzeyde belirlenmesi için izin vermek için steril cerrahi yağ ile doldurun.
3. Önce her test oturumu bir kule mikro-yola hazırlayın.
   1. Ucu eğimli ucu orta ve alt ile 25 ölçüm Kılavuzu tüp üstünde belgili tanımlık götürmek kıskaç. İki kelepçeler Kılavuzu tüp düz kalmasını sağlamak için kullanılır. Bu kelepçeler her ikisi de el ile isterseniz taşınabilirler.
      Not: Kılavuzu tüp epoxied veya kelepçeler için lehimli.
   2. Büyük hacimli ışığı aynı sürücüdeki üst kelepçe içinde güvenli. Şunu sıkıca sürücü motor bağlı.
   3. Büyük hacimli ışığı Kılavuzu tüpünden tamamen iş parçacığı ve ışığı ucu Kılavuzu tüp ipucu uzanır onaylayın.
      Not: Kılavuzu tüp ucu olarak beyin zarı mesafeden hedef beyin bölgesinin alt kenar boşluğuna eşittir Geçmiş uzanır ışığı uzunluğu belirlenir üzerinden MRI.
   4. Kılavuz tüp ve ışığı antiseptik çözüm (örneğin, chlorohexidine) sterilize etmek için emmek.
4. Temiz oda içinde özel bir steril kılavuz yerleştirin ve bir vida odası tarafında ile önceden belirlenmiş bir yönelim, güvenli. Burada gösterilen kılavuz 1 mm aralığı vardır; Ancak, boşluğu gerektiği gibi özelleştirilmiş olabilir.
   Not: Bu kılavuz ve anatomik MRI kullanılan yönlendirme için aynı olması gerekir.
5. Stereotaksik mikro-sürücü sahibi önceden belirlenmiş bir yönelim kayıt odasında üzerinde güvenli.
6. Steril, künt forseps kullanarak ışığı çekerek Kılavuzu tüp sterilize ışığı geri çek. Işığı ucu 5-10 mm Kılavuzu tüp ucu yukarıda olmalıdır.
   Not: Işığı dışa doğru kılavuz tüp ve kelepçe arasında yay olacak. Bu esnek ışığı zarar vermez.
7. Sahibi için mikro sürücü takmak ve Kılavuzu tüpü hedef kılavuz deliğe yerleştirin.
8. Daha düşük mikro-sürücü sahne Kılavuzu tüp sadece beyin zarı düzey arası olana.
   Not: İsterseniz, ikinci bir mikro-sürücü bir elektrot ile sahne alanı'nda yerleştirilir ve bir farklı bir kılavuz deliğe indirdi. Yerel alan bu elektrot potansiyel ışığı yerleşim doğrulamak için kullanılan bir mesafe bağımlı hafif yapı gösterecektir.
9. , Işığı el ile steril Forseps ile alt deneyin.
   1. Herhangi bir direnç ise, ışığı geri çek 5 - 10 mm, doku yeniden deneyin ve yerleşmek izin vermek için 10 dk bekle.
   2. İse hala direnç ikinci denemede, ışığı ipucu kılavuz 0,25 mm tüp ve yeniden deneyin Kılavuzu tüpün içine, alt geri çek.
   3. Işığı slaytlar arasında herhangi bir direniş olmadan Kılavuzu tüp kadar yineleyin.
   4. Daha düşük ışığı kadar gergin.
      Uyarı: Işığı direnci karşı zorla itmeyin. Bu gibi durumlarda Kılavuzu tüp genellikle beyin zarı tam olarak nüfuz değil. Fiber zorla iterek kendisi üzerinde beyin girme ve muhtemelen yok ucu ( şekil 1 g) fiber önleme eğmek için neden olur.
10. Kurmak daha büyük optik veya lazer ışığı diğer ucundaki yüksük bağlayın.
11. Işık yok insan dışı primat görünür olduğundan emin olun.
    1. Geçirmeyen koruyucu kullanın veya tam kayıt kuleleri kapsayacak şekilde folyo emici ışık.
    2. Tüm optik bağlantıları folyo emici lşıktan yapılmış korumalı zarflarda yerleştirin.
    3. Tüm patch kablolar ile folyo veya siyah Elektrik bandı emici her iki ışık kalkan.
    4. İlave bir önlem olarak insan dışı primat arkasında deneyinde kullanılan aynı ışık rengi bir yem ışık yayan diyot (LED) banka yerleştirin ve LED'ler sürekli 2.5 Hz de flash. Bu gözleri tamamen karanlığa ayarlama engeller. Yanlışlıkla ışık sızıntısı olsaydı, bu yanıp sönen ışık davranış tetikleyici olarak hizmet den sızıntıyı önlemek için yardımcı olacağını.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Büyük beyin cilt insan dışı primatlar olarak aydınlatma için davranışsal ilgili optogenetic manipülasyon sağlar. Acker vd. (2016) kullanılan bu büyük hacimli ışığı kırmızı kayar Halorhodopsin, bellek güdümlü saccades iki al yanaklı maymun içinde ön göz alana (FEF) zamansal katkısını çalışmaya Jaws ⁷ ile. Özellikle, FEF nöronlar Jaws içeren bir viral vektör ile enjekte ve büyük hacimli ışığı hedef sununun, gecikme süresi veya motor hazırlama ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Optogenetic araçları hastalığı ve Fizyoloji Rodents incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bir aydınlatıcı büyük beyin birimi teknik sorun optogenetics insan olmayan primatlarda kullanımı sınırlıdır. Maymunlar çalışmalarda öncü küçük birimleri, belki de aydınlatmak için büyük ışık güç yoğunlukları (~ 100 mW/mm² ile 20 W/mm²) kullanılan < 1 mm³ve korteks^{4, eksitatör opsins ile bildirilen mütevazı davranışs...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic optical fiber	Industrial fiber optics	SK-10	250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 °F
Lab marker	VWR	52877
Dissection microscope	VistaVision	82027-156	Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape	VWR	89097-972	4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet	ThorLabs	LF5P	5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet	ThorLabs	LF3P	3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet	ThorLabs	LF1P	1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet	ThorLabs	LF03P	0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife	Industrial fiber optics	IF370012	60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope	ThorLabs	FS201	optional
Stainless Steel Ferrule	Precision fiber optics	MM-FER2003SS-265	265 micron inner diameter
1 mL syringe	BD	14-823-30	Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy	Industrial fiber optics	40 0005
18 gauge blunt needle	BD	305180	1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe)	ThorLabs	KW32	available from many vendors
Light absorbing foil	ThorLabs	BKF12
Electrical tape	3M	Temflex 1700	Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle	BD	305111	0.5 inch length
Micromanipulator	Siskiyou	70750000E	may substitute other brands/models
Steretactic arm	Kopf	1460	may substitute other brands/models
Laser safety goggles	KenTeK	KCM-6012	must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source	vortran	Stradus 473-50	example of blue laser
Integrating sphere	ThorLabs	S142C	Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber	Crist instrument company	6-ICO-J0	Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps	NAN	DRTBL-CMS
Guide tube	Custom	N/A	Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system	NAN	NANDrive
Custom grid design	custom	custom	plans available upon request
Blunt forceps	FischerScientific	08-875-8A	generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers	Neiko	01407A	available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable	ThorLabs	FG200LCC-custom	This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps	ThorLabs	CAPF	Package of 25
ceramic split mating sleeve	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S