큰 볼륨, 비 인간 영장류에서 Optogenetics에 대 한 행동-관련 조명

요약

최소한의 직경이 큰 볼륨에 빛을 전달 하기 위한 조직 침투 조명 기 구축 프로토콜 제공 됩니다.

초록

이 프로토콜 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetic 조작에 대 한 개발 된 대규모 조명 기를 설명 합니다. 조명 기는 에칭 팁, 수정 된 플라스틱 광섬유 발광 표면적은 > 100 종래의 섬유의 x. 큰 볼륨 조명 기의 건설을 설명, 뿐만 아니라이 프로토콜도 빛을 분배를 보장 하는 데 사용 하는 품질 관리 교정을 자세히 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 삽입 하 고 제거 하는 큰 볼륨 조명에 대 한 기술을 설명 합니다. 표면 기도 하 고 깊은 구조를 조명 수 있습니다. 이 큰 볼륨 조명 기, 전극에 물리적으로 결합 될 필요는 없습니다 그리고 플라스틱, 유리 하지는 조명 때문에 그것은 것입니다 단순히 구 부 상황에서 전통적인 광학 섬유 깨지는 것 이다 때. 이 조명 기는 기존의 광섬유 보다 큰 침투 손상으로 행동-관련 조직 볼륨 (≈ 10 m m³) 빛을 제공 한다, 때문에 그것은 비 인간 영장류에서 optogenetics를 사용 하 여 행동 연구를 촉진 한다.

서문

밀리초 정밀, 빛 기반 신경 제어를 허용 하는 Optogenetic 도구 기능 생리학 및 설치류 및 무척 추 동물 행동 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 기술 과제는 설치류 뇌 ¹보다 큰 x 볼륨 ~ 100 비 인간 영장류 뇌에서 optogenetics의 사용을 제한 했다.

비 인간 영장류에서 optogenetics 연구를 촉진 하는 조명 기 두 경쟁 목표를 해결 하도록 설계 되었습니다: 큰 볼륨 조명 및 최소한의 침투 손상. 이러한 우려 중 하나는 주소 이전 하려고 다른 비싼에 왔습니다. 번들 섬유 조명 더 큰 볼륨의 하지만 증가 직경, 및, 따라서, 손상^2,3. 테이퍼 유리 섬유 하지만 좁게 초점 빛을 발광 표면 침투 손상을 감소 < 100 µ m^{2 4,5}. 외부 뇌 경질에 창문을 통해 침투 손상의 도전 circumvents 조명과 큰 볼륨 조명, 대 한 수 있지만 몇 가지 피상적인 뇌 분야⁶만 사용할 수 있습니다.

대규모, 작은 직경 조명 (그림 1a)를 만들려면 플라스틱 광 섬유 열 테이퍼 이며 코어와 클 래 딩의 팁 에칭 (그림 1bc). 좁은 지점에 빛을 집중 하는 다른 테이퍼 섬유, 달리는 에칭 팁, 따라서, (그림 1의 de) 큰 영역 빛을 광범위 하 게 배포 하는 방법의 측면에 밖으로 균등 하 게 탈출 하는 빛을 수 있습니다. 때문에 침투 손상을 침투 직경에 비례,이 조명 기는 기존의 섬유 보다 더 침투 손상 아직 그것은 > 발광 표면 영역 및 제공 빛 더 광범위 하 게 1 x 100/100 빛 전원 뇌 팬텀 (1.75 %agarose)의 밀도 (그림 1e). 몬테 카를로 모델 (그림 1 층) 그들은 그들의 발광 표면으로 동등한 빛 전원 밀도가지고 기존의 섬유와 대용량 조명 빛 확산에 차이 보여 줍니다. 각 조명 기는 개별적으로 (그림 2a, b) 팁 (그림 2c) 따라도 빛을 분배를 보장 하기 위해 통합 영역을 사용 하 여 보정 됩니다.

이 큰 볼륨 조명 기는 optogenetic 조작 동작 및 비 인간 영장류에 신경 발포의 유효성이 검증 되었습니다. 어떤 뇌 영역을 각 동물의 개별 수용 필드 지도 섬유 팁 길이 사용자 지정할 수 있습니다. 조명 조명의 길이 걸쳐 있는 신경 녹음에 대 한 관통 전극와 쌍 수 있습니다. 또한, 섬유는 가시 광선의 색상을 가져올 수 있다, 때문에 그것은 사용할 수 사용 가능한 optogenetic 분자의와 결합 될 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

참고: 모든 동물 절차 NIH 지침에 따라 했다 고 하 여 매사 추세 츠 연구소의 기술 위원회 동물 관리에 승인 했다.

1. 조명 제조

1. 예리한가 위의 쌍을 사용 하 여 250 µ m 직경 플라스틱 광섬유를 적어도 10 cm 길이 보다 긴 경우 원하는 총 조명 기의 부분을 잘라.
2. 22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 플라스틱 광섬유의 한쪽 끝에서 제거 하는 폴 리 에틸렌 재킷의 15-20 cm.
3. 테이블 바이스 클램프에 섬유의 벗겨진된 끝의 대부분 3-5 cm는 원심 보안.
4. 지속적인 꾸준한 당겨 한 손에 긴장 된 섬유의 외피 끝을 개최. 섬유 부에 수직으로 바닥에 평행 해야 합니다. 난방 및 냉각 (단계 1.5 및 1.6 아래) 되도록 섬유 직선과 긴장 된 그것 가겠다고으로 섬유에이 지속적인 긴장 유지.
5. 듀얼 온도 열 총 (570/1000 ° F), 가장 낮은 설정을 사용 하 여 열 섬유의 제거 섹션 그것은 직경 60-100 μ m, 또는 사람의 모발의 직경에 대 한 박 형까지.
6. 하면서 냉각 섬유는 섬유에 일정 한 긴장을 유지 합니다. 긴장을 유지 하기 위해 실패 컬 섬유를 발생할 수 있습니다.
7. 해 현미경 남았다 팁의 직경을 확인합니다. 또는, 하나는 대신 캘리퍼스를 사용할 수 있습니다.
   1. 섬유 충분히 얇은 경우, 반복 단계 1.4 1.6 통해 원하는 팁 직경을 달성 하는 데 필요한.
   2. 옵션 다시 당기는 경우 작은 마크에 넣어 섬유의 좁은 부분 열 총의 중심 대상 섬유의 좁은 부분을 다시 열 수 것입니다 경우.
   3. 섬유 너무 얇은 경우에, 다시 시작.
8. 섬유 전체 냉각 하 고 원하는 직경 달성, 양쪽에 섬유 좁은 지점에서 3 cm를 꼬집어. 빠르고와 날카로운 섬유의 축 따라 풀, 테이퍼 팁을 만들 측면을 분리.
9. 해 부 현미경에 낮은 전력 (예를 들어, 4 X) 아래 테이퍼 팁을 검토합니다. 팁 갈래 ( 그림 1 층) 웅크리고 경우 삭제 섬유.
10. 테이퍼 팁 떠나는 마지막 5 m m 노출 팁의 끝 근처 랩 테이프의 조각을 배치 하 여 엣지를 준비. 테이프는 빛 방출의 원하는 길이 위에 에칭에서 섬유를 보호합니다. 이 팁 길이 대상 지역에 영장류 피 두께에 따라 선정 되었다. 긴 또는 짧은 길이 조명의 원하는 길이 따라 노출 될 수 있습니다. 랩 테이프의 가장자리 또는 테이퍼 팁에서 가까이 이동 수 다른 엣지 팁 길이 바란다면.
11. 엄지손가락과 집게손가락 사이 5 μ m 실리콘 카바 이드 연마 시트의 작은 (~ 1 인치 x 2 인치) 광장을 접어. 연마 시트의 두 측면 사이의 섬유의 팁 놓고 엄지와 집게손가락 사이의 BB 롤링 마치 작은 원형의 움직임을 사용 하 여 섬유를 부드럽게 엣지. 모든 측면에 균등 하 게 새겨져 있다 있도록 자주 섬유를 회전 합니다. 섬유 팁 표시 됩니다 “ roughened ” 유엔 에칭 분야는 일반적으로 부드러운 표시 에칭 되어 있다 지역에서 육안으로.
12. 래핑 시트 3 μ m 알루미늄 산화물과 반복 단계 1.11.
13. 부착 커넥터 에칭된 팁 반대 조명 기의 끝에. 조명 기는 광 케이블 또는 레이저에 연결할 수 있습니다.
    참고: 이 방법은 유리를 해결 하기 위한 선호 하는 방법에서 다릅니다 / 깃 봉에서 실리 카 광섬유. 때문에 금속 아무 손상 시킬 수 있습니다 접착 후 섬유와 아무 단위로 연마 플라스틱 광 섬유 보다 더 플라스틱 광섬유 금속 연마 과정에서 생산의 작은 파편으로 평면 죽 습 섬유에 자신을 포함할 수 있습니다.
    1. 22 게이지 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 조명 기의 반대쪽에서 폴 리 에틸렌 재킷의 약 5mm 제거.
    2. 평면 표면을 반반 하 뜨거운 칼으로 반대쪽 끝을 잘라.
    3. 폴란드어 연속적으로 미세한 lapping와 평면 반대쪽 시트: 0.3 µ m, 1 μ m, 3 μ m, 5 µ m.
    4. 평면 삽입 끝 260 µ m 내부 직경 스테인리스 아무를 플러시는 아무의 끝까지 반대.
    5. 시각적으로 그 반대쪽은 원활 하 고 균일 하 게 연마 섬유 현미경으로 확인.
    6. 는 깃 봉에서 섬유를 제거 하 고 아래로 가리키는 섬유와 테이블의 가장자리에 수직으로 아무 테이프.
    7. 플라스틱 에폭시 1 mL 주사기를 주사기에 무딘 18 게이지 바늘을 첨부.
    8. 바늘을 사용에 아무로 내려 에폭시를 적용 합니다. 에폭시는 아무를 완전히 채워.
    9. 는 아무 섬유 삽입.
    10. 섬유의 광택된 표면에서 어떤 초과 에폭시 젖은 보풀 지우기 필요한 경우 건조 전에 닦아. 그렇지 않으면, 초과 에폭시 12-24 h. 후 제거 될 수 있다
    11. 교정까지 부드럽게 섬유를 저장 하 고 먼지 모자는 아무 장소.

2. 조명 보정 및 품질 관리

참고: 교정에 대 한 이러한 방법을 평가 광 섬유의 끝에서 다른 거리에 비선형 출력. 고르지 못한 광 분포에서 일반적으로 결과 “ 울 퉁 불 퉁 ” 또는 “ 물결 모양 ” 테이퍼.

통합 영역을 사용 하 여 호 ( 그림 2)를 흡수 하는 빛의 상단에 대 한

1. 만들기 빛 차폐 막.
   참고: 흡수 하는 피부를 방지 하기 위해 호 일 처리 빛 빛 반영 얼룩을 만드는에서 오일 때마다 장갑을 착용 한다.
2. 배 2
   ” 4 ” 자체는 2를 통해 호를 흡수 하는 빛의 조각 ” x 2 ” 광장. 전송 시각: 다른 방법 2를 삭감 하는 ” x 2 ” 측면을 흡수 한 빛과 반영 하는 측면 (즉, 한 빛 광장 표준 알루미늄 호 일의 측면); 그러나, 접이식 메서드는 다음 단계. 횡 경 막 처리에 대 한 무딘 가장자리를 제공 하기 때문에 안전
   1. 랩 테이프 또는 전기 테이프로 비 접힌 가장자리를 바인딩할 광장의 가장자리를 따라 접. 이 모두 함께 측면을 보유 하 고 날카로운 모서리에서 상처에 대 한 보호.
   2. 26 게이지 바늘을 사용 하 여 사각형의 중심에 구멍을 찌를.
   3. 통합 영역에서 모자에 큰 나사를 제거 하 고 횡 경 막과 개통을 커버. 센터 구멍을 배치 합니다. 막 빛 흡수 한 측면을 반영 하는 하나의 빛으로 만들어진 경우 배치 측면을 흡수 하는 빛 및 통합 분야의 내부를 직면 하 고 아래로 측면을 반영 하는 빛.
      참고: 통합 영역에 들어가기에서 먼지와 파편을 방지 하 고 중심 구멍을 유지, 보안 연구소 테이프로 통합 분야의 외부에 횡 경 막.
3. 측정 빛는 micromanipulator 또는 stereotaxic 팔과 통합 영역을 사용 하 여 500 µ m 단위로 팁 따라 출력.
   참고: 레이저에 때마다 적절 한 파장의 안전 고글을 착용 한다.
   1. 레이저 또는 빛 섬유의 반대쪽 끝을 연결할 소스, 하지만 아직 출력 하는 빛을 트리거하지 않습니다.
   2. 보안 stereotaxic 홀더 (prefe에 조명 기랩 테이프와 rably) 소유자의 하단 아래 7-10 m m 팁.
   3. 나사에 stereotaxic 올리다 stereotaxic 홀더
   4. 는 Illuminator 횡 경 막의 센터에 있는 구멍의 끝을 맞춥니다. 팁은 횡 경 막으로 정확한 동일한 수준 때는 micromanipulator 0.
   5. 차례 방 불 끄고 통합 영역 0.
   6. 트리거 레이저 (또는 다른 광원)와 총 빛 전원 통합 영역을 사용 하 여 출력을 측정.
      참고: 가능한 가장 낮은 광 출력을 사용 하 여 교정 테스트.
   7. 통합 영역 및 반복 단계 2.2.6에 섬유 500 µ m 낮은.
   8. 계속 통합 영역으로 섬유를 낮추는 총 빛 전력 레벨에서 500 µ m 단위로 총 광 출력 측정
      주의: 일단 전체 팁 영역에 총 빛 전원 수준 한다. 낮은 섬유를 계속 하지 않습니다에 에칭 넘어 1-2 m m 이상 길이 팁. 팁 통합 영역 하단의 연락처, 그것 수 있습니다 녹아 및/또는 통합 영역을 망치.
4. 총 빛 전원으로 얼마나 섬유의 함수는 선형성을 확인 통합 영역으로 하향 조정 되어 출력을 그려서 균등 하 게 에칭된 섬유 확인.

3. Vivo에서 조명

참고: 여기, 이러한 방법은 비 인간 영장류 보다는 플라스틱 모델을 사용 하 여 표시 됩니다.

1. 임 플 란 트 25 m m 직경 녹음 실 실험 전에 관심의 뇌 영역에 이식 했다.
2. 실험 전에 해 부 자기 공명 영상 (MRI)을 수행합니다. 챔버에는 사용자 지정 녹음 그리드를 배치 하 고 메 마른 외과 윤활제 그리드 시각화 및 경질 대상 뇌 구조의 수준 결정에 대 한 수 있도록 그것을 채울.
3. 각 테스트 세션 전에 타워 마이크로 드라이브를 준비합니다.
   1. 부착 드라이브에 중간과 더 낮은 경사진 팁 25 게이지 가이드 튜브 클램프. 두 개의 클램프는 가이드 튜브에 똑바로 되도록 하는 데 사용 됩니다. 원하는 경우 이러한 클램프의 둘 다 수동으로 이동할 수 있습니다.
      참고: 가이드 튜브 epoxied 되거나 납땜 하는 클램프.
   2. 같은 드라이브에 위 클램프에 큰 볼륨 조명 기를 보호합니다. 이 클램프는 드라이브 모터에 연결 된.
   3. 가이드 튜브를 통해 대규모 조명 기를 완벽 하 게 스레드 및는 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 지나서 확장 확인.
      참고: 가이드 튜브의 끝으로 경질에서 대상 뇌 영역의 아래쪽 여백 까지의 거리와 과거를 확장 하는 조명 기의 길이 통해 MRI 결정.
   4. 가이드 튜브 및 조명 (예, chlorohexidine) 소독 살 균 솔루션에 담가.
4. 깨끗 한 챔버 내부 사용자 지정 소독된 그리드를 배치 하 고 챔버 측면 나사와 미리 지정 된 방향에서 그것을 확보. 여기에 표시 된 눈금은 1mm 간격; 그러나, 간격 사용자 정의할 수 있습니다 필요에 따라.
   참고: 이 그리드와 해 부 MRI에서 사용 하는 방향에 동일 해야 합니다.
5. 미리 정해진된 방향으로 녹음 실에서 정위 적 마이크로 드라이브 홀더 보안.
6. 살 균, 무뚝뚝한 겸 자 사용 하 여 조명 기를 당겨 가이드 튜브에서 조명 하는 소독된 기를 철회. 조명 기의 팁 가이드 튜브의 끝 위에 5-10 m m 이어야 한다.
   참고: 조명 가이드 튜브 클램프 사이 바깥쪽으로 인사 합니다. 이 유연한 조명 기를 손상 하지 것입니다.
7. 마이크로 드라이브는 홀더를 부착 하 고 가이드 튜브 대상 그리드 구멍.
8. 낮은 마이크로 드라이브 단계 가이드 튜브는 경질의 수준을 통해 때까지.
   참고: 전극 두 번째 마이크로 드라이브를 스테이지에 배치 하 고 다른 그리드 구멍으로 낮 췄 다 수 있습니다. 이 전극에 잠재적인 로컬 필드 거리 의존 빛 유물, 조명 배치를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다 표시 됩니다.
9. 시도 낮은 조명 기는 수동으로 멸 균 포 셉와 함께.
   1. 어떤 저항 든 지 있는 경우에, 철회는 조명 기 5-10 mm, 조직 정착 하 고 다시 시도 하십시오 수 있도록 10 분을 기다립니다.
   2. 여전히 저항에 경우 두 번째 시도, 접어 야 조명 팁 가이드 튜브, 낮은 가이드 0.25 m m, 튜브 하 고 다시 시도 하십시오.
   3. 어떤 저항 없이 가이드 튜브를 통해 조명 기 슬라이드 때까지 반복.
   4. 낮은 조명 기는 긴장 된 때까지.
      주의: 강력히 저항에 대 한 조명 기를 밀어 하지 않습니다. 이러한 경우에 가이드 튜브 일반적으로 하지 관통 경질 완전히. 두뇌를 입력 하 고 팁 ( 그림 1 g)를 파괴 하는 가능 하 게 섬유를 방지 자체에 벤드를 하면 섬유를 강력히 추진.
10. 큰 광학 설정 또는 레이저에는 조명 기의 다른 끝에 아무 연결.
11. 확인 빛 비 인간 영장류에 게 표시 됩니다.
    1. 블랙 아웃 차폐 하거나 빛을 흡수 하는 완전히 녹음 타워를 포괄 하는 호 일.
    2. 호 일을 흡수 하는 빛의 만든 차폐 봉투에 모든 광학 연결 장소.
    3. 방패 모든 패치 케이블 중 빛을 흡수 하는 포 일 또는 검은 전기 테이프.
    4. 추가 조치로 비 인간 영장류 뒤에 실험에 사용 되는 동일한 빛 색의 미끼 발광 다이오드 (LED) 은행 놓고 2.5 Hz에서 지속적으로 Led 플래시. 이 어둠에 완전히 조정에서 눈을 방지 합니다. 만약 실수로 빛 누설 했다,이 번쩍이는 빛 행동 방 아 쇠로 봉사에서 누설을 방지 하기 위해 도움이 될.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

비 인간 영장류에서 큰 두뇌 볼륨의 조명 행동-관련 optogenetic 조작 가능합니다. 애 커 외. 레드 이동 Halorhodopsin, 턱 ⁷ 두 붉은 털 원숭이에 메모리 기반 saccades 정면 눈 분야 (들)의 임시 기여 공부 하 (2016) 사용이 큰 볼륨 조명 기. 특히, 들 신경 턱을 포함 하는 바이러스 성 벡터와 주입 되었고 대상 프레 젠 테이 션, 지연 기간 또는 메모리 기반 saccade 작업의 모터 준비 기간 동...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

Optogenetic 도구는 널리 질병 및 설치류에서 생리학을 공부 하는 데 사용 됩니다, 하지만 계몽 큰 두뇌 볼륨의 기술적 도전 비 인간 영장류에서 optogenetics의 사용을 제한 했다. 아마도 작은 볼륨을 밝히는 큰 빛 전원 밀도 (~ 100 mW/m m² ~ 20 W/m m²)를 사용 하는 원숭이 연구 개척 < 1 m m³, 그리고 피^{4, 흥분 성의 opsins 겸손 한 행동 효과 보고 ...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic optical fiber	Industrial fiber optics	SK-10	250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 °F
Lab marker	VWR	52877
Dissection microscope	VistaVision	82027-156	Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape	VWR	89097-972	4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet	ThorLabs	LF5P	5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet	ThorLabs	LF3P	3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet	ThorLabs	LF1P	1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet	ThorLabs	LF03P	0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife	Industrial fiber optics	IF370012	60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope	ThorLabs	FS201	optional
Stainless Steel Ferrule	Precision fiber optics	MM-FER2003SS-265	265 micron inner diameter
1 mL syringe	BD	14-823-30	Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy	Industrial fiber optics	40 0005
18 gauge blunt needle	BD	305180	1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe)	ThorLabs	KW32	available from many vendors
Light absorbing foil	ThorLabs	BKF12
Electrical tape	3M	Temflex 1700	Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle	BD	305111	0.5 inch length
Micromanipulator	Siskiyou	70750000E	may substitute other brands/models
Steretactic arm	Kopf	1460	may substitute other brands/models
Laser safety goggles	KenTeK	KCM-6012	must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source	vortran	Stradus 473-50	example of blue laser
Integrating sphere	ThorLabs	S142C	Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber	Crist instrument company	6-ICO-J0	Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps	NAN	DRTBL-CMS
Guide tube	Custom	N/A	Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system	NAN	NANDrive
Custom grid design	custom	custom	plans available upon request
Blunt forceps	FischerScientific	08-875-8A	generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers	Neiko	01407A	available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable	ThorLabs	FG200LCC-custom	This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps	ThorLabs	CAPF	Package of 25
ceramic split mating sleeve	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S