Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani

Riepilogo

Un protocollo per costruire un illuminatore penetrante di tessuto per fornire luce attraverso grandi volumi con diametro minimo è presentato.

Abstract

Questo protocollo descrive un illuminatore di grande volume, che è stato sviluppato per le manipolazioni di optogenetica nel cervello primate non umano. L'illuminatore è una fibra ottica di plastica modificata con punta acidato, tale che la superficie di uscita della luce è > 100 volte quella di una fibra convenzionale. Oltre a descrivere la costruzione dell'illuminatore a grandi volumi, questo protocollo dettaglia la taratura del controllo di qualità utilizzata per garantire la distribuzione uniforme della luce. Inoltre, questo protocollo descrive le tecniche per inserimento e rimozione dell'illuminatore di grande volume. Strutture superficiali e profonde possono essere illuminate. Questo illuminatore di grande volume non ha bisogno di essere fisicamente accoppiato ad un elettrodo, e perché l'illuminatore è fatta di plastica, non di vetro, esso semplicemente si piegherà a circostanze quando fibre ottiche tradizionali avrebbe distrutto. Perché questo illuminatore trasporta la luce sopra volumi rilevanti relativamente al comportamento del tessuto (≈ 10 mm³) con nessun danno una maggiore penetrazione di una fibra ottica convenzionale, esso facilita studi comportamentali utilizzando optogenetica in primati non umani.

Introduzione

Strumenti di optogenetica, che consentono un controllo preciso al millisecondo, luce-driven neuronale sono ampiamente utilizzati per lo studio funzionale fisiologia e comportamento nei roditori e invertebrati. Tuttavia, le sfide tecniche hanno limitato l'uso di optogenetica nel cervello primate non umano, che ha un volume ~ 100 volte più grandi del cervello del roditore ¹.

Per facilitare gli studi optogenetica in primati non umani, un illuminatore è stato progettato per affrontare due obiettivi contrastanti: illuminazione di grande volume e penetrazione minima danni. Precedenti tentativi di affrontare uno di questi problemi sono venuti presso il costoso di altro. Fasci di fibre per illuminare grandi volumi, ma con diametro maggiorato e, quindi, danno^2,3. Fibre di vetro conico riducono danni di penetrazione, ma stretto fuoco luce alla luce che emettono superfici < 100 µm^{2 4,5}. Illuminazione esterna del cervello attraverso una finestra nella dura elude la sfida di danni di penetrazione e può consentire per l'illuminazione di grande volume, ma può essere utilizzato solo per qualche superficiale cervello zone⁶.

Per creare un illuminatore di grandi volumi, di piccolo diametro (Figura 1a), la punta di plastica ottico della fibra è calore affusolato e il nucleo e il rivestimento sono incisi (Figura 1bc). A differenza di altre fibre conici che focalizzare la luce in un punto stretto, l'acquaforte permette alla luce di sfuggire uniformemente fuori i lati della punta, così, distribuendo in linea di massima luce su una vasta area (Figura 1 de). Perché danno di penetrazione è proporzionale al diametro di penetrazione, questo illuminatore non ha nessun più danni di penetrazione di una fibra convenzionale, eppure ha > 100 x la luce che emettono luce superficie area e trasporta più largamente con 1/100th il potere della luce densità in un cervello fantasma (1,75% agarosio) (Figura 1e). Un modello Montecarlo (Figura 1f) viene illustrata la differenza nella diffusione della luce tra una fibra convenzionale e l'illuminatore di grande volume hanno densità uguale potenza luce come loro superfici di uscita della luce. Ogni illuminatore è calibrato individualmente utilizzando una sfera integratrice (Figura 2a, b) per garantire una distribuzione uniforme della luce lungo la punta (Figura 2C).

Questo illuminatore di grande volume è stato convalidato con optogenetica manipolazione di comportamento e di firing neuronale in primati non umani. Lunghezza della punta della fibra può essere personalizzata a qualsiasi area del cervello e alla mappa del campo recettivo individuali di ogni animale. L'illuminatore può essere accoppiato con un elettrodo penetrante per le registrazioni di un neurone che si estendono la durata di illuminazione. Inoltre, poiché la fibra può trasportare qualsiasi colore della luce visibile, può essere accoppiato con qualsiasi delle molecole optogenetica disponibile disponibile.

Protocollo

Nota: tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida NIH e sono state approvate dal Massachusetts Institute di tecnologia Comitato sulla cura degli animali.

1. Illuminatore fabbricazione

1. usare un paio di forbici taglienti per tagliare una sezione di 250 µm diametro fibra ottica di plastica che è superiore alla lunghezza desiderata illuminatore totale di almeno 10 cm.
2. Rimuovere 15-20 cm di rivestimento in polietilene da un'estremità della fibra ottica plastica utilizzando una spogliarellista di filo di 22 calibro.
3. Secure distale maggior parte 3-5 cm dell'estremità spogliato della fibra in un morsetto morsa da tavolo.
4. Tenere l'estremità rivestita della fibra tesa in una mano con un tiro costante costante. La fibra deve essere parallela al piano, perpendicolare al vice. Mantenere questa costante la tensione sulla fibra durante il riscaldamento e raffreddamento (punti 1.5 e 1.6 qui sotto) in modo che la fibra rimane dritto e teso come si assottiglia.
5. Utilizzando l'impostazione più bassa di una pistola di calore doppia temperatura (570/1.000 ° F,), scaldare la sezione spogliata della fibra fino a quando si è assottigliata ad un diametro di 60-100 μm, o circa il diametro di un capello umano.
6. Mantenere la tensione costante sulla fibra, consentendo la fibra raffreddare. L'incapacità di mantenere la tensione può causare la fibra ad arricciarsi.
7. Confermare il diametro della punta assottigliata sotto un microscopio per dissezione. Alternativamente, uno può utilizzare pinze.
   1. Se la fibra non è abbastanza sottile, ripetere i passaggi da 1.4 attraverso 1.6 come necessario per ottenere il diametro desiderato punta.
   2. Opzionale se ri-tirando, mettere un piccolo segno alla parte più stretta della fibra se esso sarà riscaldata nuovamente affinché la parte più stretta della fibra si rivolge al centro della pistola di calore.
   3. Se la fibra è troppo sottile, ricominciare da capo.
8. Una volta che la fibra piena è raffreddato e il diametro desiderato è stato raggiunto, pizzicare la fibra di 3 cm dal punto più stretto su entrambi i lati. Con un rapido, sharp pull lungo l'asse della fibra, separare i lati per creare una punta conica.
9. Esaminare la punta conica sotto a bassa potenza (ad es., 4x) il microscopio di dissezione. Se la punta è biforcuta o arricciata ( Figura 1f), scartare la fibra.
10. Preparazione per incidere la punta conica mettendo un pezzo di nastro di laboratorio vicino alla fine della punta, lasciando l'ultimo 5 mm esposti. Il nastro protegge la fibra dall'incisione sopra la lunghezza desiderata dell'emissione luminosa. La lunghezza della punta è stata selezionata basato sullo spessore della corteccia del primate della regione di destinazione. Una lunghezza più corta o poteva essere esposti a seconda la lunghezza desiderata di illuminazione. Se si desidera una lunghezza della punta etch differenti, il bordo del nastro lab può essere spostato più vicino a o più lontano la punta conica.
11. Piegare un quadrato piccolo (~ 1 pollici x 2 pollici) di 5 μm in carburo di silicio lappatura foglio sopra tra il pollice e l'indice. Posizionare la punta della fibra tra i due lati del foglio lappatura ed etch delicatamente la fibra con piccoli movimenti circolari, come se un BB di rotolamento tra il pollice e l'indice. Consente di ruotare frequentemente la fibra in modo che tutti i lati sono incisi in modo uniforme. La punta della fibra apparirà “ irruvidito ” ad occhio nudo nelle aree che sono stati impressi, mentre ONU-acidati aree in genere appaiono uniformi.
12. Ripetere il punto 1.11 con un ossido di alluminio di 3 μm lappatura foglio.
13. Apporre un connettore all'estremità dell'illuminatore di fronte la punta acidata. Questo consente l'illuminatore per connettersi a un cavo ottico o laser.
    Nota: Questo metodo differisce dal metodo preferito per fissaggio vetro / fibre ottiche silice in puntali. Perché il puntale del metallo è più difficile che la fibra ottica di plastica, lucidatura della fibra e puntale come unità dopo incollaggio può danneggiare la fibra ottica di plastica come minuscoli frammenti di metallo prodotto durante il processo di lucidatura si può incorporare nel piatto-spaccati della fibra.
    1. Rimuovere circa 5 mm della giacca in polietilene dalla parte opposta dell'illuminatore con una spogliarellista di filo di 22 calibro.
    2. Tagliare l'estremità opposta con un coltello caldo per lisciare la superficie.
    3. Polacco l'estremità opposta piatto con lappatura successivamente più sottili fogli: 5 µm, 3 μm, 1 μm e 0,3 µm.
    4. Inserire il piatto altra estremità in un puntale in acciaio inox di diametro interno di 260 µm fino a quando non è a filo con la fine della ferrula.
    5. Confermare visivamente che l'estremità opposta è lucidato uniformemente e perfino con un microscopio fibra.
    6. Rimuovere la fibra dal puntale e la ghiera in senso verticale sul bordo di una tabella con nastro adesivo con la fibra rivolta verso il basso.
    7. Riempire una siringa da 1 mL con plastica epossidica e inserire un ago 18 calibro smussato nella siringa.
    8. Utilizzare l'ago per applicare la resina epossidica giù nella ghiera. Riempire completamente la ghiera con resina epossidica.
    9. Inserire la fibra della ferrula.
    10. Pulire qualsiasi resina epossidica in eccesso dalla superficie lucidata della fibra con un panno privo di lanugine bagnato prima dell'essiccazione se necessario. In caso contrario, la resina epossidica in eccesso può essere rimosso dopo 12-24 h.
    11. Memorizzare delicatamente la fibra fino a taratura e mettere un tappo di polvere sopra il puntale.

2. Illuminatore di calibrazione e controllo di qualità

Nota: questi metodi per la taratura valutare per emissione di luce non-linearità a distanze diverse dalla punta della fibra. Distribuzione irregolare della luce provoca tipicamente da un “ accidentata ” o “ ondulato ” cono.

1. Crea una schermatura luce a membrana per la parte superiore della sfera integratrice utilizzando luce assorbendo foil ( Figura 2).
   Nota: Indossare guanti quando foglio per evitare la pelle che assorbe luce di trattamento oli dalla creazione di macchie di luce riflettente.
   1. Fold 2 ” da 4 ” pezzo di luce assorbendo stagnola sopra su se stessa per formare un 2 ” x 2 ” Piazza. un metodo alternativo è quello di tagliare un 2 ” x 2 ” quadrato con una luce assorbendo laterale e una luce che riflette sul lato (cioè un lato del foglio di alluminio standard); Tuttavia, il metodo di piega è più sicuro perché fornisce un bordo opaco per la gestione del diaframma nel prossimo passaggio.
   2. piegare laboratorio nastro o nastro isolante lungo i bordi della piazza per associare i bordi non piegato. Questo tiene insieme i lati e protegge contro i tagli da spigoli vivi.
   3. Perforare un foro al centro del quadrato utilizzando un ago di 26 calibro.
   4. Rimuovere la grande vite il tappo dalla sfera integrata e coprire l'apertura con il diaframma. Posizionare il foro sopra il centro. Se il diaframma è stato creato con una luce assorbente e una luce che riflette sul lato, posizionare la luce assorbendo lato a e la luce si riflette sul lato verso il basso, verso l'interno della sfera integrata.
      Nota: Per evitare polvere e detriti di entrare la sfera di integrazione e di mantenere il foro centrato, garantire il diaframma verso l'esterno della sfera integrata con nastro adesivo lab.
2. Misura luce uscita lungo la punta incrementi di 500 µm utilizzando un micromanipolatore o stereotassica braccio e una sfera integratrice.
   Nota: Ogni volta che il laser è in si devono indossare occhiali di sicurezza della lunghezza d'onda appropriata.
   1. Collegare l'estremità opposta della fibra con un laser o la luce fonte, ma non attivano la luce uscita ancora.
   2. Secure l'illuminatore a un titolare stereotassica (Laddomeriscontro con nastro di laboratorio) con la punta 7-10 mm sotto il bordo inferiore del titolare.
   3. Vite il titolare stereotassica nell'ARM stereotassica.
   4. Allineare la punta dell'illuminatore con il foro al centro del diaframma. Zero il micromanipolatore quando la punta è sullo stesso livello esatto come il diaframma.
   5. Girare fuori le luci della camera e zero la sfera integratrice.
   6. Attivare il laser (o altra sorgente luminosa) e misurare la potenza di luce totale output utilizzando la sfera integratrice.
      Nota: Utilizzare la potenza luminosa minima possibile per il test di calibrazione.
   7. Abbassare la fibra 500 µm nell'integrazione sfera e ripetete il punto 2.2.6.
   8. Continuare abbassando la fibra nella sfera integratrice e misurazione della luce totale emessa 500 µm con incrementi fino a quando il potere della luce totale livelli off.
      Attenzione: Potenza di luce totale deve stabilizzarsi una volta che la punta intera è nella sfera. Non continuare ad abbassare la fibra più di 1-2 mm oltre l'acidato suggerimento lunghezza. Se la punta tocca il fondo della sfera integrata, esso può fondere e/o rovinare la sfera integratrice.
3. Confermare una fibra uniformemente acidata tracciando potenza luce totale output come una funzione di quanto la fibra è stata abbassata nella sfera integrata per confermare linearità.

3. illuminazione in Vivo

Nota: qui, questi metodi vengono visualizzati utilizzando un modello di plastica piuttosto che un primate non umano.

1. Dell'impianto è stata impiantata una camera di registrazione di diametro 25 mm sopra l'area del cervello di interesse prima sperimentazione.
2. Eseguire anatomico imaging a risonanza magnetica (MRI) prima della sperimentazione. Posizionare una griglia di registrazione personalizzata in aula e riempirlo con lubrificante chirurgico sterile per consentire visualizzazione griglia e determinazione del livello delle strutture cerebrali dura e target.
3. Preparare una torre micro-unità prima di ogni sessione di test.
   1. Affisso un tubo di guida di 25 calibro con punta tagliata a metà e inferiore morsetti sull'unità. Due morsetti sono utilizzati per garantire che il tubo di guida rimane dritto. Entrambi questi morsetti possono essere spostati manualmente se lo si desidera.
      Nota: Il tubo di guida può essere incollato con resina epossidica o saldato ai morsetti.
   2. Fissare l'illuminatore di grande volume nel morsetto superiore sulla stessa unità. Questo morsetto è attaccato il motore di azionamento.
   3. Infilare l'illuminatore di grande volume attraverso il tubo di guida completamente e confermare che la punta dell'illuminatore si estende oltre la punta del tubo guida.
      Nota: La lunghezza dell'illuminatore che estende passato la punta del tubo guida è uguale la distanza dalla dura al margine inferiore della regione del cervello di destinazione, come determinato tramite MRI.
   4. Immergere il tubo di guida e illuminatore in soluzione antisettica (ad es., clorexedina) per sterilizzare.
4. Posizionare una griglia personalizzata sterilizzata all'interno della camera pulita e fissarlo a un orientamento pre-specificato con una vite sul lato della camera. La griglia mostrata qui ha distanza di 1 mm; Tuttavia, la spaziatura può essere personalizzata secondo le necessità.
   Nota: Questo dovrebbe essere identico alla griglia e orientamento utilizzato nel MRI anatomico.
5. Fissare il supporto di micro-unità stereotassica sulla camera di registrazione in un orientamento predeterminato.
6. Ritrarre l'illuminatore sterilizzato dal tubo guida tirando l'illuminatore utilizzando pinze sterili, smussate. La punta dell'illuminatore dovrebbe essere 5-10 mm sopra la punta del tubo guida.
   Nota: L'illuminatore si piegherà verso l'esterno tra il tubo di guida e il morsetto. Questo non danneggerà l'illuminatore flessibile.
7. Appone il micro-drive al titolare e posizionare il tubo di guida nel foro della griglia di destinazione.
8. Abbassare la fase di micro-unità fino a quando il tubo di guida è solo attraverso il livello del dura.
   Nota: Se lo si desidera, un secondo micro-drive con un elettrodo possa essere collocato sulla scena e abbassa in un buco di griglia differenti. Local field potential su questo elettrodo mostrerà un artefatto luce di distanza-dipendente, che può essere utilizzato per confermare il posizionamento di illuminatore.
9. Tentativo minore l'illuminatore manualmente con pinze sterili.
   1. Se non c'è alcuna resistenza, ritirare l'illuminatore 5 - 10 mm, attendere 10 minuti per consentire al tessuto di stabilirsi e riprovare.
   2. Se c'è ancora resistenza al secondo tentativo, ritirare la punta di illuminatore nel tubo guida, più basso la guida tubo 0,25 mm e riprovare.
   3. Ripetere fino a quando le diapositive di illuminatore attraverso il tubo di guida senza alcuna resistenza.
   4. Abbassare l'illuminatore fino a quando è teso.
      Attenzione: Non spingere l'Illuminatore con forza contro resistenza. In questi casi il tubo di guida in genere non l'ha penetrata dura completamente. Spingendo con forza la fibra farà sì che per piegare su se stesso, impedendo la fibra di entrare il cervello e possibilmente distruggendo la punta ( Figura 1 g).
10. Collegare il puntale su altra estremità dell'illuminatore al più grande ottica impostare o laser.
11. Assicurarsi che nessuna luce è visibile per il primate non umano.
    1. Utilizzare black out schermatura o luce assorbendo stagnola per comprendere pienamente le torri registrazione.
    2. Inserire tutti i collegamenti ottici in schermato buste fatte di stagnola che assorbe luce.
    3. Scudo tutti i cavi di patch con entrambi foglio o nastro isolante nero che assorbe luce.
    4. Come ulteriore precauzione, posizionare una banca del diodo luminoso (LED) di richiamo dello stesso colore luce utilizzato nell'esperimento dietro il primate non umano e lampeggiano i LED continuamente a 2,5 Hz. Ciò impedisce agli occhi di regolazione completamente al buio. Se c'erano perdite involontarie di luce, questa luce lampeggiante aiuterebbe a prevenire la perdita da servire come un trigger comportamentale.

Risultati

L'illuminazione di volumi di grandi dimensioni del cervello in primati non umani consente per la manipolazione di optogenetica comportamentale pertinenti. Acker et al. (2016) utilizzato questo illuminatore di grande volume con il Halorhodopsin rosso-spostato, Jaws ⁷ per studiare il contributo temporale del campo frontale dell'occhio (FEF) da saccadi memoria-Guida in due scimmie rhesus. In particolare, FEF neuroni sono stati iniettati con un vettore virale contenente Jaws e poi illuminati ...

Discussione

Mentre optogenetica strumenti sono ampiamente utilizzati per studiare la malattia e della fisiologia nei roditori, la sfida tecnica di volumi di grandi dimensioni del cervello illuminante ha limitato l'uso di optogenetica in primati non umani. Studi nelle scimmie pionieristici utilizzato densità di grande potenza della luce (~ 100 mW/mm² a 20 W/mm²) per illuminare piccoli volumi, forse < 1 mm³e segnalati effetti comportamentali modesti con opsine eccitatorie in corteccia

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic optical fiber	Industrial fiber optics	SK-10	250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 °F
Lab marker	VWR	52877
Dissection microscope	VistaVision	82027-156	Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape	VWR	89097-972	4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet	ThorLabs	LF5P	5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet	ThorLabs	LF3P	3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet	ThorLabs	LF1P	1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet	ThorLabs	LF03P	0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife	Industrial fiber optics	IF370012	60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope	ThorLabs	FS201	optional
Stainless Steel Ferrule	Precision fiber optics	MM-FER2003SS-265	265 micron inner diameter
1 mL syringe	BD	14-823-30	Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy	Industrial fiber optics	40 0005
18 gauge blunt needle	BD	305180	1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe)	ThorLabs	KW32	available from many vendors
Light absorbing foil	ThorLabs	BKF12
Electrical tape	3M	Temflex 1700	Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle	BD	305111	0.5 inch length
Micromanipulator	Siskiyou	70750000E	may substitute other brands/models
Steretactic arm	Kopf	1460	may substitute other brands/models
Laser safety goggles	KenTeK	KCM-6012	must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source	vortran	Stradus 473-50	example of blue laser
Integrating sphere	ThorLabs	S142C	Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber	Crist instrument company	6-ICO-J0	Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps	NAN	DRTBL-CMS
Guide tube	Custom	N/A	Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system	NAN	NANDrive
Custom grid design	custom	custom	plans available upon request
Blunt forceps	FischerScientific	08-875-8A	generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers	Neiko	01407A	available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable	ThorLabs	FG200LCC-custom	This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps	ThorLabs	CAPF	Package of 25
ceramic split mating sleeve	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S