Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Summary

תחליפי הסחוס ואת העור היו bioprinted באמצעות bioink של nanocellulose-קילוף פלסטיצידיות מבוסס. Bioinks היו cellularized לפני ההדפסה באמצעות יחידת ערבול פסיבי צעד בודד. המבנה היו הפגינו להיות cellularized בצורה אחידה, יש גבוהה הכדאיות של התערוכה סמנים חיובית של בידול.

Abstract

Bioprinting היא טכניקה חזקה על הזיוף מהיר ולא לשחזור של בונה עבור יישומי הנדסה רקמות. במחקר זה, תחליפי עור סחוס היו מפוברק לאחר pre-cellularization bioink ניצול פסיבים הרומן ערבוב יחידת טכניקה. שיטה זו פותחה במטרה לפשט את הצעדים הכרוכים ערבוב של השעיה תא אל bioink בעלי צמיגות גבוהה. הרזולוציה של חוטים להפקיד דרך bioprinting מחייבת הבטחת של אחידות בחלוקת התא לפני ההדפסה כדי להימנע בתצהיר של אזורים ללא תאים או השמירה של גושים תא גדול כי יכול לסתום את המחט. נדגים הפרטים וביכולת במהירות השעיה תא עם bioink לפני bioprinting של תחליפי הסחוס והן העור. תחליפי רקמות שני יכול להיות מחונן עד 4 שבועות ניתוח היסטולוגית הפגינו תא הכדאיות והן בתצהיר של רקמות סמני מטריצה חוץ-תאית ספציפי (ECM) glycosaminoglycans (GAGs) ו קולגן אני בהתאמה.

Introduction

בשנים האחרונות, טכנולוגיית תלת מימד (3D) bioprinting הפך להיות יותר נגיש לחוקרים, המאפשר את הטכניקה להיות מנוצל באופן נרחב יותר להרכבת רקמות תחליפי. Bioprinting מבטיח לחולל מהפכה המחקר הביו-רפואי על ידי הקלה מהירה, הדיר הזיוף של בונה רקמות הגיוון הרב. עיקרה של הטכנולוגיה bioprinting מטילה ביכולת הבקרה בדיוק בתצהיר של biomaterials (המכונה bioinks) בשלושה ממדים. פעולה זו מאפשרת את הדור של פיגומים מורכבים עם אזורים הנבדלים זה מזה של מטריקס יצירות, גורמים ביו התאים ניתן לסכם באופן מדויק יותר מבנה רקמות מקורית.

Bioprinting יש נעזרו הזיוף של בונה עבור יישומים רבים של רקמות, כולל הסחוס¹, העור², שרירים³ועצם⁴. רקמות אלה יפים עבור bioprinting עקב שלהם מהותי תילומית המיקרו-ארכיטקטורות המתאימים רפריזה דרך שכבה-על התצהיר. בפרט, עור בעל מבנה מרובה שכבות מוגדרים היטב⁵, אשר מתאימה פבריקציה נוספת דרך שכבה-על התצהיר טכניקות כגון bioprinting. בנוסף, bioprinting יכול להיות מנוצל כדי ליצור מבנים בעלי המימדים אנטומיים, צורות כדי לתקן את הרקמות לערוק. היכולת להפיק biomaterials עם המטופל הספציפי בצורה ובגודל⁶ להתחיל לתת מענה הדרישה לתיקונים חלקית של רקמות רבות כולל אך לא מוגבל עצם פגמים נזק לסחוס, נגעים בעור אשר במידה משתנה -לחולה.

במחקר זה, שני תחליפי רקמות (הסחוס במפרק ואת העור) היו המציא דרך bioprinting של pre-cellularized bioinks. להבטיח מיזוג הולמת של bioink עם השעיה תא העשויים להבטיח התפלגות אחידה תא תוך שמירה על יכולת הקיום התא עשויה להיות אתגר. Bioinks מתאים bioprinting ויה ההבלטה לעיתים קרובות בעלי צמיגות גבוהה, ולכן דורשים ערבוב נרחב כדי להבטיח תערובת הומוגנית. מכניות לתאים יכול להתרחש בתנאים קשים ערבוב, להשפיע לרעה על יכולת הקיום. מחקרים הראו כי רוב מוות תאי במהלך תהליך ההדפסה הזרקת דיו מתרחשת במהלך ההכנה כמו ערבוב^7,8. בעוד ערבוב מסורתי עם עצבנות⁹ עשוי להיות מספיק עבור צמיגות נמוכה bioinks מתאים הזרקת דיו ההדפסה¹⁰, ערבוב של תאים לתוך bioink צמיגות גבוהה יותר מתאים שחול bioprinting קשה יותר. מיעון צורך זה, השימוש של ערבוב חרירי הפך פופולרי יותר עבור מיזוג bioinks במהלך תהליך ההדפסה¹¹. מסיבות אלה יש גם נרחב מנוצל במחקר מיקרופלואידיקה מערבוב נוזלים עם מספר ריינולדס נמוך איפה חשוב¹². הניצול של תהליך ערבוב מתמשך להשתלב השעיה תא bioink תאפשר אחידות במהלך תהליך ההדפסה. עם זאת, מאז המתלים תא בעל צמיגות נמוכה בהשוואה של bioink, קשיים יקום למניעת שיקוע התאים במהלך ההדפסה תהליך^9,13,14. לחלופין, ערבוב של תאים לתוך bioink לפני ההדפסה עלולה להתייחס לסוגיה זו.

כדי למזער את מות תאים במהלך מיזוג לתוך bioink, פיתחנו שיטה המבוססת על יחידת ערבול פסיבי להשתלב תאים bioink במספר מינימלי של צעדים. ערבוב כאוטי שנוצר באמצעות זרימת החומרים דרך יחידת ערבול מספיקה כדי reproducibly תערובת שני המרכיבים יחד^15,16. שיטה זו פותחה בעיקר כדי לפשט את המיזוג של כל השעיה תא עם כל bioink הזה מתאים שחול bioprinting. מספר שלבים בתהליך ערבוב היה ממוזער לחסל משתמש-למשתמש וריאציה של ערבוב. צעדים ערבוב יתר יכול להיות זמן רב, לא החלים על כל bioinks, במיוחד כשמדובר תאים. משני, אנחנו נועדו לפתח תהליך ערבוב זה היה עצמאי לשמר עקרות והן למזער אובדן הדגימה.

כתב יד זה, נדגים את המיזוג של השעיה תא עם bioink באמצעות ערבוב הטכניקה היחידה זה ממזער טיפול ותוצאות הכדאיות תא גבוהה והפצה המדים? פסיבים. Bioinks pre-cellularized אלה מנוצלים אז כדי bioprint סחוס או עור לבנות עם אחד או שני סוגי תאים, בהתאמה זה מתורבתים עד 6 שבועות. Bioink מנוצל הוא תערובת alginate-nanocellulose, אשר בעבר הראו התאמה bioprinting¹.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה של צ'אלמרס אוניברסיטת מחקר אנושי.

הערה: כל השלבים הם שיש לבצע בתוך אבטחה סטרילי ארון.

1. הכנת חומרים מתכלים, Bioink ותאים

1. להשיג שני מזרקים, אחד מזרק (איור 1) מיועד התליה תא, אמנם המזרק אחרים עבור bioink (איור 1b).
2. להשיג סטרילי פסיבי ערבוב יחידה (איור 1c) יכול להיות בשילוב עם מזרקים כפול באמצעות חיבור נעל זכוכית.
3. להשיג יחידת שחולק (איור 1d) זה יכול הבלטה של אמצעי אחסון של שני מזרקים סטרילי בו-זמנית בקצב מבוקר.
   הערה: יחס ערבוב מנוצל במחקר זה הוא 10:1. לכן, השתמש מזרק 12 mL ומזרק 1 מ"ל כנדרש על-ידי יחידת ערבול 10:1.
4. לקבל מחסנית סטרילי (איור 1e), מחבר נעל זכוכית נקבה-נקבה סטרילי כדי מעורב ישירות את המתלים bioink ותא לתוך.
5. להשיג או להכין את bioink עבור מיזוג עם השעיה התא.
   הערה: ב פרוטוקול זה, bioink nanocellulose/alginate מבוסס היה מנוצל. Bioink הזה יש קישורים צולבים באמצעות התוספת של פתרון סטרילי 100 מ מ CaCl₂ פוסט הדפסה.
6. ניתוק התאים באמצעות פתרון טריפסין/EDTA 0.5% ולספור את המספר הכולל של תאים באמצעות שיטת הדרה כחול trypan¹⁷.
   הערה: ב פרוטוקול זה, fibroblasts האנושית נוצלו.
7. לקבוע מה צפיפות תא רצוי ב הבונה המודפס הסופי. לחשב באמצעות המשוואות הבאות את הריכוז של התאים שנקטפו יש לדלל כדי להשיג צפיפות הסופי תא היעד הזה.
   הערה: ב פרוטוקול זה, צפיפות תא הסופי של 5 x 10⁶ תאים למ"ל היה מנוצל.
   1. בחר ריכוז התא הרצוי עבור הניסויים: ג_תאים (תאים/mL).
   2. לחשב את כמות bioink הצורך, V_bioink, בהתבסס על המספר הכולל של בונה הרצוי:
      V_bioink = V_לבנות × N_Contructs
      הערה: לדוגמה, עוצמת הקול של bioink לאדם לבנות הוא 100 µL. אם בונה 30 מודפסים, האחסון bioink צריך הוא 3 מ.
   3. לחשב את מספר התאים הדרושים:
      N_תאים = C_התא (1.1 × V_יכולים)
   4. Resuspend התאים (N_תאים) ב 1/10^בתאנון נפח bioink:
      V_{תא ההשעיה} = 0.1 × V_יכולים
      הערה: לדוגמה, אם V_bioink = 3 מ ל, אז V_{תא ההשעיה} = 0.1 × 3 מ ל = 0.3 מ ל

2. ערבוב של הבולם תא, Bioink

1. העברת התליה תא לתוך המזרק ההשעיה התא.
2. להעביר את bioink עוד מזרק או להשיג את המזרק המכיל את bioink.
3. למשוך בחזרה על הבוכנה מזרק bioink והכנס את המזרק לתוך יחידת שחולק. מקם את יחידת אנכית עם סכינים סטריליים נעל מחבר כלפי מעלה (איור 1f1).
4. חיזרו על הבוכנה של המזרק תא באורך דומה כמו המזרק bioink והכנס לתוך יחידת שחולק (איור 1f2).
5. לצרף שני מזרקים יחידת ערבול על ידי סיבוך המחברים נעל זכוכית (איור 1f3).
6. ראש מערכת ערבוב על-ידי לחיצה על יחידת שחולק על הבלטת האוויר במזרק. עוצרים את לקרקע לפני הפתרון להגיע המנעול סכינים סטריליים (איור 1g4).
7. לאחר לקרקע, לצרף את מחסנית מילוי בקצה של יחידת ערבול דרך מחבר נעל זכוכית (איור 1g5). ודא כי הבוכנה במחסנית מילוי בחלק התחתון לפני המצורף.
8. לאט לאט לדחוס (איור 1h6) יחידת שחולק לערבב את המתלים bioink ותא יחד לתוך המחסנית (איור 1i7).
9. לחצו הבוכנה בתוך המחסנית מילוי כלפי מטה עם טיפ pipet סטרילי לפנות את התערובת bioink-תא לאחר ערבוב. שמור את dispensing עד דחוס כדי להבטיח שהתערובת תא/bioink הנמתח לא בחזרה לתוך יחידת ערבול.
10. קאפ הדיו, טפח בעדינות על משטח העבודה כדי לעבור כל בועות האוויר העליון של המחסנית (בוכנה end).
    הערה: בשלב זה, התערובת תא/bioink הוא מוכן להדפסה. הסעיפים הבאים מתאר יישומים ספציפיים ונהלים ההדפסה.

3. קביעה של הכדאיות התא באמצעות יחידת ערבול לעומת ערבוב מרית ידנית

1. לנתק אדם fibroblasts (פסקה 7) עם פתרון טריפסין/EDTA 0.5%-80% הנהרות, לספור את ו- resuspend תרבות בינוני-צפיפות תא מספיקות כדי להשיג ריכוז סופי לאחר המיזוג עם bioink (1:10 יחס תא: bioink) של 5 x 10 ⁶ תאים למ"ל.
2. מיזוג תאים לתוך את bioink באמצעות או הפסיבי ערבוב יחידת טכניקה (שלב 2) או באמצעות מרית כדי להעריך את השפעת בשתי הטכניקות על התא הכדאיות.
3. להתמזג התאים bioink באמצעות ערבוב טכניקה יחידה 1, 2, או 3 פעמים לפני dispensing לתוך תבנית עבור cross-linking באמצעות 100 מ מ CaCl₂הפסיבי.
   הערה: כדי לבצע מיזוגים נוספים, מערבבים את התא/bioink ישירות לתוך מזרק מאשר מחסנית. ואז רמיקס את התערובת דרך יחידת ערבול בעקבות בפרוטוקול הקודם אך ללא הרכיב מזרק התא.
4. להתמזג התאים bioink נפרד באמצעות מכונות ידניות ערבוב בעזרת מרית עבור המשכים של העברה ס' 30, 60 או 90 את תערובות (בכל פעם ערבוב) לתוך תבנית עבור cross-linking באמצעות CaCl 100 מ מ₂.
5. להעביר את הדגימות צלחת טוב לאחר השלמת cross-linking ותרבות בתנאים רגילים.
6. לאחר יום 1 של תרבות, לשטוף את המבנים (n = 3-4 לכל קבוצה) ללא סרום תא תרבות בינוני במשך 30 דקות כתם התאים המבנה עם פתרון מכתימים (4 מיקרומטר Calcein AM, 1 מיקרומטר אתידיום homodimer-1) למשך 30 דקות.
   1. לשטוף פעמיים נוספות, דגירה את הדוגמאות סרום ללא תא בינוני תרבות עבור סכום כולל של 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.

להעביר את הדגימות פתרון דימות תא חי.

לרכוש תמונות באמצעות מצלמה צבעונית דיגיטלית 10 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מסנני FITC ואדום טקסס, לנתח באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

לבחור באקראי שלוש תמונות של כל מבנה על כימות של התא הכדאיות.

חישוב הכדאיות המבוססים על היחס של תאים חיים למספר הכולל של תאים. לנתח את הנתונים באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey.

4. Bioprinting של הסחוס תחליפי עם סוג תא בודד

1. ציירו דגם תלת-ממד של הרקמה הרצויה אנלוגי. להמיר קובץ Gcode עבור bioprinting, לטעון את הקובץ Gcode על ה bioprinter¹.
   הערה: ב פרוטוקול זה, מבנה מרובע עם מידות 4.8 x 4.8 x 0.9 מ מ³ היה מיוצא כקובץ STL. קובץ Gcode נוצר המבנה סריג באמצעות ההגדרות הבאות: עובי השכבה, 0.3 מ מ; דפוס infill, מרובע; infill צפיפות, 25%; . מהירות, 10 מ מ/s.
2. לבודד, cryopreserve העיקרי האנושי האף chondrocytes (hNC) מחולים בעקבות הפניה פרוטוקול¹.
3. הפשרת ואת להרחיב cryopreserved hNCs הרחב פעם בתרבות טפט באמצעות תקן תרבות בינוני ב 37 º C. ניתוק תאים על 80-90% למפגש עם פתרון טריפסין/EDTA 0.5% ולספור באמצעות פרוטוקול trypan הדרה כחול. כל הניסויים נערכו באמצעות hNCs ב פסקה 2.
4. Resuspend את hNCs-100 x 10⁶ תאים למ"ל בתוך 300 µL של תרבות בינוני עם סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 50 חומצה אסקורבית µg/mL, לקראת המיזוג עם bioink.
5. תערובת התליה תא hNC לתוך nanocellulose/קילוף פלסטיצידיות מבוסס bioink הבאים הפסיבי ערבוב פרוטוקול יחידת ביחס השעיה של 10:1 bioink:cell בריכוז תא הסופי של 9 x 10⁶ תאים/מ ל....
6. ודא כי bioprinter הוא עיקור באמצעות חשיפה UV ולנגב למטה עם 70% אתנול. לשמור על עקרות על ידי הצבת ארון זרימה שכבתית.
7. לצרף חרירי ההדפסה סטרילי מכלי המכיל את תערובות התליה תא bioink, להכניס bioprinter.
8. כיילו את bioprinter באופן ידני או על-ידי פרוטוקולים ספציפיים למדפסת.
9. Bioprint סריג-מובנה, עמוסי תא בונה באמצעות הדפסה הפרמטרים הבאים: 25 גרם זרבובית חרוט, בלחץ של 25 kPa. Bioprint תא ללא בונה (מעורבב עם תא בינוני המכיל תאים לא) כפקד.
10. קשר צולב את בונה על-ידי הוספת פתרון יוניים של 100 מ מ CaCl₂ עבור 5 דקות יש לשטוף את המבנים, דגירה במדיום תרבות בתנאים סטנדרטיים תרבות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 95% לחות יחסית). לשנות את המדיה כל יום השני או השלישי.
11. לאסוף דגימות לבדיקה היסטולוגית שבועות 2 ו- 4. כתם הדגימות לייצור איסור פרסום באמצעות כתם כחול של Alcian¹⁸.

5. Bioprinting של העור תחליפי עם שני סוגי תאים

1. לצייר דגם תלת-ממד של הרקמה הרצויה אנלוגי, להמיר קובץ Gcode עבור bioprinting. לטעון את הקובץ Gcode על bioprinter.
   הערה: ב פרוטוקול זה, מבנה מרובע עם מידות 4.8 x 4.8 x 0.9 מ מ³ היה מיוצא כקובץ STL. ואז קובץ Gcode נוצר המבנה סריג באמצעות ההגדרות הבאות: עובי השכבה, 0.3 מ מ; דפוס infill, מרובע; infill צפיפות, 25%; . מהירות, 10 מ מ/s.
2. להכין את התאים מיזוג לתוך bioink עבור bioprinting. עבור ייצור של תחליפי עור, שני סוגי תאים נוצלו. סוגי תאים שני היו שהתמזגו את bioink ואת bioprinting.
   1. להשיג HDF העיקרי. לשמור על תאים אלה בתקשורת צמיחה DMEM בתוספת סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 50 חומצה אסקורבית µg/mL. ניתוק תאים על 80-90% למפגש עם 0.5% טריפסין/EDTA פתרון, ספירה.
   2. לבודד, cryopreserve העיקרי hNC מחולים בעקבות הפניה פרוטוקול¹. הפשרת והרחב hNCs cryopreserved בתרבות חד שכבתי. ניתוק תאים על 80-90% למפגש עם 0.5% טריפסין/EDTA פתרון, ספירה.
3. Resuspend שני סוגי תאים-100 x 10⁶ תאים למ"ל בתוך צמיחה מדיה. מערבבים את המתלים תא ביחד ביחס של 1:1 להשגת ריכוז מוחלט הסופי של 100 x 10⁶ תאים/מ ל 300 µL של התקשורת.
4. תערובת התליה תא 50: 50 של HDF ו hNC לתוך nanocellulose/קילוף פלסטיצידיות מבוסס bioink הבאים הפסיבי ערבוב פרוטוקול יחידת ביחס השעיה של 10:1 bioink:cell בריכוז תא הסופי של 9 x 10⁶ תאים/מ ל....
5. ודא bioprinter הוא מעוקר או ממוקם זרימה שכבתית, בארון כדי לשמור על עקרות.
6. לצרף חרירי ההדפסה סטרילי מכלי המכיל את תערובות התליה תא bioink, להכניס bioprinter.
7. לכייל את bioprinter גם באופן ידני או פרוטוקולים ספציפיים למדפסת.
8. Bioprint סריג-מובנה, עמוסי תא בונה באמצעות הדפסה הפרמטרים הבאים: 25 גרם זרבובית חרוט, בלחץ של 25 kPa. Bioprint תא ללא בונה (מעורבב עם תא בינוני המכיל תאים לא) כפקד.
9. קשר צולב את בונה על-ידי הוספת פתרון יוניים של 100 מ מ CaCl₂ עבור 5 דקות יש לשטוף את המבנים, דגירה במדיום תרבות בתנאים סטנדרטיים תרבות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 95% לחות יחסית). לשנות את המדיה כל יום השני או השלישי.
10. לאסוף דגימות לבדיקה היסטולוגית שבועות 2 ו- 4. כתם הדגימות של קולגן אני ייצור של מאסון הכתם trichrome¹⁹.

תוצאות

תוצאות בכתב היד מחולקים לשני חלקים. קודם כל, הכדאיות תא ניתחנו את פוסט-ערבוב עם השיטה מכני או יחידת ערבול פסיבי. בשלב הבא, בונה סחוס והעור היו תרבותי וניתח לסמני היסטולוגית הרלוונטיים.

התפלגות התא הופיע הומוגנית בשני המקרים. עם זאת, הפעולה של ערבוב ביד באמצעות מרית (איור 2b) בעלת סטיה יותר מאשר ערבוב עם פסיבי ערבוב יחידה (איור 2). במידה, מהירות, ואת טכניקת ערבוב עם מרית תלויה מאוד למשתמש. עם זאת, מיזוג תאים לתוך bioink עם יחידת ערבול פסיבי המשקלל ערבוב, ממזער וריאציה על פני קבוצות. יתר על כן, 30, 60, 90 s ערבוב זמן מאי לא יספיק עבור ערבוב של כמות גדולה של תאים לתוך כמות גדולה של bioink. המיזוג קפדנית יותר דרך ערבוב עם מרית ייתכן שיהיה צורך. לשם השוואה, ניצול יחידת ערבול פסיבי יותר שומרת על היחס בין ערבוב של התאים bioink במהלך המיזוג ומבטיחה כי ערבוב הומוגנית מבוצעת. בנוסף, דוגמת אובדן היא דאגה עם טכניקות ערבוב המסורתי שבו bioink יכול להשאר מאחור את צלחות פטרי, צינורות וכלים ערבוב בגלל צמיגות גבוהה שלהם. הכדאיות תא היה גבוהים עבור ערבוב עם יחידת ערבול (> 90%) 1, 2, או 3 פעמים. כאשר יחידת ערבול פסיבי היה מנוצל, מיזוג לקח בערך 1 דקות בקצב איטי המיזוג קבוע. תוך ערבוב עם מרית הציג הכדאיות גבוהה לאחר ערבוב עבור s 30 ל- 60, גדול מ- 90 s של ערבוב, גרמו לירידה משמעותית הכדאיות לעומת קבוצות אחרות (77.9 ± 14%, p < 0.05) (איור 2c). זה יכול להיות בגלל ערבוב יתר הגורמת נזק לתאים. חי/מת לטווח ארוך מכתים לאחר 14 ימים ו- 28 ימים של תרבות מוצג משלים באיור1. התאים מתחילים להפיץ ביום 14, מתפשטים מאוד ביום 28 ו מצביעים על יכולת הקיום טוב.

לאחר תרבות, תחליפי רקמת סחוס והן העור נותחו באמצעות כימיקלים. ניתוח של בונה סחוס ימים 0, 14, ו- 28 מציג עלייה הכמות ואת כיסוי של GAGs כפי שמתואר דרך כתם כחול Alcian (איור 3a-3_c). העדר של הכתם הוא הבחין ביום 0, בעוד ביום 14 מכתים היא מוגבלת למקומות proximal לתאים. עם זאת, ביום 28 של התרבות, Alcian הכחול נמצא בכל הבונה, הממחיש את היווצרות chondrocytic ECM. Bioprinted העור בונה נותחו באמצעות היסטולוגית מכתים של קולגן אני ניצול של מאסון הכתם Trichrome (d-3fאיור 3). בדומה בונה סחוס, דגימות יום 0 הציג אין התצהיר קולגן. ביום 14 של תרבות, פיקדונות משמעותי של קולגן נרשמו מסביב לתאים ולאורך השטח של הבונה. זה היה עוד יותר משופר ביום 28, כמו קולגן צפופה שכבות נמצאו על פני השטח לבנות ובתוך הנפח.

איור 1 : פסיבי ערבוב מערכת יחידת. מזרק 1 מ"ל () עבור תא ההשעיה, מזרק של 12 מ ל (b) עם bioink, יחידת שחולק (c), יחידת ערבול פסיבי (d) (e) מילוי טונר, (f) הרכבה של מזרק bioink (1) ותא ההשעיה מזרק (2) ביחידה שחולק, מצורף של יחידת ערבול פסיבי עד הסוף של מזרקים (3), קובץ מצורף (g) של המחבר נעל זכוכית נקבה-נקבה (4) והן מצורף של המחסנית מילוי (5) משלים את ההרכבה, (h ) לדחוס את יחידת שחולק פריים של ערבוב יחידה (6), (אני) להמשיך לדחוף על יחידת שחולק כדי לערבב התליה תא עם bioink מדבקות/ברקודים לתוך המחסנית מילוי (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : תא הכדאיות תמונות וניתוח. להחליפן בתמונות מציגים חי (ירוק) וגם fibroblasts האדם מת (אדום) לאחר ערבוב עם הפסיבי ערבוב יחידה 1, 2 או 3 פעמים () או מרית 30, 60 או 90 שניות (b) ותרבות תלת-ממד עבור יום אחד. תמונות בהגדלה X 4 מוצגים. סרגלי קנה מידה מציינים 200 מיקרומטר. (ג) אחוז הכדאיות הממוצע של האדם fibroblasts לאחר ערבוב עם הפסיבי ערבוב יחידה או מרית ותרבות תלת-ממד עבור יום אחד. קווי שגיאה הצג את סטיית התקן של הממוצע, * 0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: רקמות ספציפיות מטריצה חוץ-תאית התצהיר. בונה סחוס Bioprinted מוכתם glycosaminoglycans ניצול Alcian הכחול בשעה () יום 0, (b) 14, ו- (ג) 28. תמונות שנלכדו בהגדלה X 5. Bioprinted העור בונה מוכתם קולגן אני משתמש Trichrome של מאסון (d) יום 0, (e) 14, ו (f) 28. תמונות שנלכדו בהגדלה X 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1: תא הכדאיות-ביום 14 (), וביום 28 (b). סולם בר הוא 200 מיקרומטר, ירוק מתייחס לחיות תאים, אדום מתייחס תאים מתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כפי שמתואר בכתב היד, pre-cellularized bioinks היו bioprinted לפברק או סחוס או עור תחליפי את זה היו תרבותי עבור עד 4 שבועות. תא הכדאיות לאחר המיזוג באמצעות הפסיבי ערבוב הטכניקה היחידה היה גבוה יותר מאשר שיטות ערבוב. בנוסף, פישוט של תהליך המיזוג באמצעות יחידת ערבול תצמצם את מספר הטיפול ומאפשר יותר עקביות מידת ערבוב. בסופו של דבר, התוצאה טובה יותר הפארמצבטית בחלוקת התא שני בתוך את bioink, ועל -פני בונה וקבוצות ניסיוני. בתצהיר של רקמות ECM רכיבים ספציפיים כגון GAGs קולגן אני נצפתה עבור תחליפי הסחוס והן העור, בהתאמה לאחר 4 שבועות של תרבות. אפשרות זו מציינת את הגמישות של טכניקת ערבוב והן את הגיאומטריה לבנות שבחרת ליצור מטרות רקמות שונות. הזיוף של הסחוס והן העור תחליפי הציג את הגמישות של שני השימוש של bioink nanocellulose-קילוף פלסטיצידיות הטכניקה bioprinting עבור מטרות שונות רקמות מהונדסים. נדון בשני רכיבים של המחקר שלהלן: (1) פסיבי ערבוב הטכניקה היחידה, ו (2) על אופן הפעולה של תאים בתוך תחליפי הסחוס והעור.

לפיתוח, אופטימיזציה של טכניקה עבור מיזוג השעיה תא אל bioink היה בעל חשיבות עליונה עבור הזיוף של מבנים אלה. בניגוד המסורתי צמיגות נמוכה הידרוג חומרים, הביא צמיגות גבוהה של bioinks הקושי pre-cellularization של bioink לפני ההדפסה. כחלופה השיטה המסורתית של השתלבות תא bioink, עבור בשלב אחד ערבוב של השעיה תא לתוך bioink צמיגה פרוטוקול שפותח, דנו. בנוסף, היישום המעשי של טכניקה זו ערבוב בייצור של בונה רקמות הוערך. גישה ערבוב זו בשלב אחד יש כמה יתרונות על פני מסורתי טכניקות כלולים מבוקרים ערבוב יחס ערבוב, וצמצום של לחצים הטיה גבוהה ולא סדירות, וסגור מערכת סגורה לחסל את הדגימה תוך ערבוב כלי. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בטכניקה זו על מנת להבטיח היתרונות על פני שיטות מסורתיות למיזוג תאים/bioink. זה חיוני כדי להבטיח כי התאים במזרק תא מושעה וכי מעורבב היטב לפני המיזוג. מדי גדול של פער הזמן בין הרמה והעברה של התאים במזרק, החל תהליך ערבוב יכול לגרום לתאים משקעים, אשר תגרום ערבוב לא אחידה והפצה לתוך פילמנט המודפס. אם שקיעת היפוך שנצפו, פשוטה (2 - 3 פעמים) של מכלול יחידת ערבול פסיבי מייד לפני ערבוב מספיקה resuspend את התאים ולהבטיח התפלגות אחידה לפני המיזוג. חשוב גם כי בועות אוויר במזרקים בוטלו או ממוזער מראש כדי להבטיח יחס ערבוב יישאר קבוע. אם יישארו בועות אוויר גדול במחסנית bioink לפני המיזוג, מומלץ כי הפתרון ניתן להפעיל באמצעות יחידת ערבול מועד נוסף כדי להבטיח ערבוב יסודי. אם יישארו בועות אוויר, עדין הקשה של המזרק/המחסנית ההדפסה יכול תחסיר בועות אוויר שיורית. בנוסף, אם חומר מרובים מיזוג (מספר ערבוב יחידות או חומרים) הוא הכרחי עבור מבנים מורכבים יותר, ריכוזי המתלים תא bioinks להיות מעורב שתישמר להבטיח כי לאחר דילול באמצעות מיזוג, תקין ריכוז סופי עדיין מושגת.

לעומת טכניקות אחרות המיזוג, היחידה ערבוב פסיבית היא הגישה של הרומן cellularize bioinks. שלא כמו טכניקות ערבוב אחרות כגון מזרק כפול ערבוב, או ערבוב עם מרית או כלי אחר, יחידת ערבול פסיבית מאפשר עקביות יותר מיזוג על פני קבוצות ומשתמשים. הטבע של טכניקות ערבוב ידני, כגון מרית ערבוב, תוצאות וריאציה משתמש-למשתמש יותר היקף ושיעור של ערבוב. בנוסף, מערכות סגורות כגון הפסיבי ערבוב יחידת ולערבב במזרק כפול יש הפסד מדגם קטן ללא לעומת ידני ערבוב בתוך צלחת פטרי או צינור.

שניהם תחליפי רקמות מפוברק כתב יד זה כללה סוג אחד של bioink, אחד או שני סוגי תאים. עם זאת, bioprinting של תחליפי רקמה מורכבת ארכיטקטורות המכילים מחוזות נפרדים bioinks עם סוגי תאים נפרדים יתכן שיהיה צורך הזיוף של יותר רקמת פיזיולוגיים בונה^{20,21, 22}. יותר התמחה bioinks עם יצירות ייחודיות או פונקציונליות עשוי להיווצר באמצעות מיזוג של מספר סוגי bioinks קיימים יחד כדי ליצור bioinks multimaterial שיש נפרדות יצירות או פונקציות^{23, 24}. זה עשוי להיות חשוב במיוחד על רקמות מעבר אזורים כגון העור שכבה תת עורית או הסחוס העצם באזור של רקמה איפה הדרגתי של bioink הרכב^25,26 עשוי להיות נחוץ להבטיח התפתחות אזורים קריטיים אלה נמצאו רקמות יליד²⁷. בנוסף, יחידת ערבול יכול להיות מנוצל כדי להתמזג גורמי גדילה של אורגניזם לתוך bioinks לפני bioprinting. חיסול של אובדן מדגם עם מערכת ערבוב סגור הוא אטרקטיבי לשימוש של גורמים ביו ריכוז נמוך יקר, היכן דגימת הפסד יכול לגרום לשינוי ל הריכוז הסופי שלהם בתוך הבונה bioprinted, במיוחד כאשר מעברי צבע מעורבים.

מגבלה עם כל טכניקת ערבוב, כולל את הפסיבי ערבוב יחידת מנוצל במחקר זה, הוא הסיכון לפגיעה סוגי תאים רגישים באופן מכני. לדוגמה, בודדו תאי גזע כזה אלו רגישים יותר מכניות^28,29מח עצם או העובר, או גזע pluripotent המושרה. המעשה של ערבוב מקנה חריג מכני מדגישה על התאים עקב כוחות גזירה מעורב בתהליך ערבוב, הם חייבים להיות מאוזנת כדי לשמר את הכדאיות³⁰. בזמן השימוש העיקרי fibroblasts chondrocytes במחקר זה הביא טוב הכדאיות (איור 2), מחקרים נוספים נחוצים לקבוע תעריפים ערבוב בטוח ואת יחסי עבור סוגי תאים רגישים יותר. עד אז, מומלץ כי ערבוב להתבצע תחת קצב איטי קבוע כדי למקסם את יכולת הקיום. בנוסף, צפיפות התאים שנבחרו במחקר זה נקבע בהתבסס על מחקרים קודמים¹. צפיפות תא הזה לא יכול להיות אידיאלי עבור כל סוגי תאים.בפרט, מיזוג תאים על ריכוז גבוה יותר עלולה לגרום באנשי תאים תאים מוגבר זה עשוי לשפר את הכדאיות תא, רקמה היווצרות^31,32. בהלך רוח דומה, יחידת ערבול פסיבי יכול להיות החלים על מיזוג תאים spheroids או אחרים אגרגטים תא³³ לתוך bioinks.

כמו הציע, הפגינו במחקר זה, פסיבים ערבוב מערכת יחידת יכול במהירות להתמזג השעיה תא bioink צמיגה. בעוד הסיכון עבור פגיעה מכנית על התאים עדיין נשאר, הגישה מאפשרת עקביות יותר מיזוג בתוך מחקר יחיד ועל -פני המשתמשים. Bioinks pre-cellularized ניצול גישה זו שימשו כדי להמציא סחוס בשני העור תחליפי היו בתרבית עד 4 שבועות, והוא הפגין בתצהיר של רקמות ספציפיות ECM סמנים. מחקרים עתידיים יתמקד הניצול של הפסיבי ערבוב מערכת יחידת למיזוג bioinks מתמחה החל bioinks תקנית עבור הזיוף של תחליפי רקמות מורכבות יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
STARTINK Kit	CELLINK	SK0001	Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure
Live/Dead Kit	Life Technologies	L3224	Kit for the analysis of cell viability after mixing
Masson's Trichrome	Sigma Aldrich	HT15-1KT	Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs
Alcian Blue	Sigma Aldrich	B8438-250ML	Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs
INKREDIBLE+ bioprinter	CELLINK	Gen1+	Printer utilized in the study
DMEM with Glutamax	Thermofisher	10566016	Media for culture of the cells
10% fetal bovine serum	Thermofisher	A3160402	Media supplement
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063	Media supplement
live cell imaging solution	thermofisher	A14291DJ	component utilized using live/dead imaging
inverted microscope	Olympus	IX73	microscope utilized
a digital color camera	Olympus	XC10	microscope camera utilized
cellSens imaging software	Olympus	n/a	stock software with the microscope
ImageJ	NIH	n/a	open source image analysis software
GraphPad Prism 7	GraphPad	n/a	software for statistical analysis
Slic3r software (v1.2.9)	Slic3r	n/a	open-source software to convert .stl file to gcode
primary adult human dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	cell source for fibroblasts