Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Özet

Kıkırdak ve cilt analogları nanocellulose-aljinat dayalı bioink kullanarak bioprinted vardı. Bioinks bir tek adım pasif karıştırma ünitesi üzerinden yazdırmadan önce cellularized. Yapıları düzgün cellularized, yüksek canlılık var ve farklılaşma olumlu işaretleri sergilemek için gösterdi.

Özet

Bioprinting yapıları doku mühendisliği uygulamaları için hızlı ve tekrarlanabilir imalatı için güçlü bir tekniktir. Bu çalışmada, kıkırdak ve cilt analogları birimi teknik karıştırma bir roman pasif kullanan bioink pre-cellularization sonra fabrikasyon. Bu teknik bir hücre süspansiyon çok viskoz bir bioink karıştırma adımları kolaylaştırmak amacı ile geliştirilmiştir. Bioprinting yatırılır filamentler çözünürlüğe tekdüzelik hücre dağıtım bölgeleri hücre olmadan birikimi veya iğne yapışmasına neden olabilir büyük hücre kümeleri saklama önlemek için yazdırmadan önce güvence gerektirir. Biz hızla bir hücre süspansiyon kıkırdak ve cilt analogları bioprinting önce bir bioink ile karıştırmak için yeteneğini göstermek. Her iki doku analogları 4 haftaya kadar kültürlü. Hücre canlılığı ve doku belirli hücre dışı Matriks (ECM) işaretlerini glikozaminoglikan (gag) ve kollajen gibi birikimi histolojik analiz gösterdi ben sırasıyla.

Giriş

Son yıllarda, üç boyutlu (3D) bioprinting teknoloji araştırmacılar, daha yaygın olarak doku analogları imalatı için kullanılan olmak için teknik izin için daha erişilebilir hale geldi. Bioprinting Biyomedikal Araştırma çok yönlü doku yapıları, hızlı ve yinelenebilir imalat kolaylaştırarak devrim vaat ediyor. Bioprinting teknoloji dönüm noktası tam olarak (bioinks da bilinir) Biyomalzeme birikimi kontrol yeteneği üç boyutlu olarak bırakır. Bu karmaşık iskele üretimi ile matris besteleri, biyoaktif faktörleri ve daha doğru bir şekilde yerel doku yapısı özetlemek hücreleri farklı bölgelerinde sağlar.

Bioprinting yapıları kıkırdak¹, Cilt², kas³ve kemik⁴dahil olmak üzere birçok doku uygulamaların imalatı için kullanılmıştır. Bu doku bioprinting nedeniyle kendi içsel çizgili mikro-tekrarlama yoluyla katman katman ifade için uygun olan mimarileri için caziptir. Özellikle, deri imalat bioprinting gibi katman katman ifade teknikleri için uygun olan bir iyi tanımlanmış çok katmanlı yapısı⁵, sahip olur. Ayrıca, bioprinting gerekli anatomik boyutları sahip yapıları oluşturmak için kullanılması gereken ve doku onarımı için şekiller defekt. Biyomalzeme hasta özel boyut ve şekil⁶ ile oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere birçok dokuların kısmi onarım için talep adrese başlayabilirsiniz ancak bunlarla sınırlı olmamak kemik defektleri, kıkırdak hasarı ve deri lezyonları olan ölçüde değişir hasta hasta.

Bu çalışmada, iki doku analogları (eklem kıkırdak ve cilt) pre-cellularized bioinks bioprinting ile fabrikasyon. Bir bioink süre hücre canlılığı koruyarak bir meydan okuma olabilir tek tip hücre dağıtım emin olabilirsiniz hücre süspansiyon ile yeterli karıştırma sağlanması. Bioinks bioprinting yolu ile ekstrüzyon için uygun çoğu kez çok viskoz ve bu nedenle homojen bir karışım sağlamak için kapsamlı karıştırma gerektirir. Hücrelere mekanik hasar sert karıştırma koşullar altında ortaya ve canlılığı olumsuz etkiler. Çalışmalar çoğu hücre ölümü mürekkep püskürtmeli baskı işlemi sırasında^7,8karıştırma gibi hazırlık sırasında oluşur göstermiştir. Geleneksel ajitasyon⁹ ile karıştırma düşük viskozite bioinks mürekkep püskürtmeli baskı¹⁰için uygun için yeterli olsa da, hücrelerin yüksek viskozite bioink karıştırma ekstrüzyon bioprinting için daha uygun daha zordur. Bu ihtiyaç adresleme, püskürtme uçlarını karıştırma kullanımı bioinks sırasında yazdırma işlemi¹¹karıştırma için daha popüler hale geldi. Bu mikserler da yaygın olarak önemli¹²nerede sıvıları düşük Reynolds sayısı ile karıştırma havacilik araştırmada kullanılmıştır. Bir hücre süspansiyon bir bioink karıştırmak için sürekli bir karıştırma işlemi kullanımı bütünlüğü için yazdırma işlemi sırasında izin vermez. Ancak, hücre süspansiyonlar Düşük viskoziteli bir bioink için karşılaştırıldığında sahip beri zorluklar yazdırma işlemi^9,13,14sırasında sedimantasyon hücrelerin önlemede ortaya çıkacak. Alternatif olarak, hücrelerin yazdırmadan önce bir bioink içine karıştırma bu sorunu ele.

Hücre ölümü bir bioink karıştırma sırasında en aza indirmek için hücreleri adım en az sayısında bir bioink içine karıştırmak için pasif bir karıştırma birim dayalı bir teknik geliştirmiştir. Malzemeleri karıştırma birimi aracılığıyla akış ile oluşturulan kaotik karıştırma tekrarlanarak karışım iki bileşen birlikte^15,16için yeterlidir. Bu yöntem öncelikle ekstrüzyon bioprinting için uygun herhangi bir bioink ile herhangi bir hücre süspansiyon karıştırma basitleştirmek için geliştirilmiştir. Karıştırma işlemi adım sayısını karıştırma kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon ortadan kaldırmak için simge durumuna küçültülmüş. Özellikle hücreleri söz konusu olduğunda aşırı karıştırma adımları zaman alıcı ve tüm bioinks için geçerli değildir olabilir. İkincil, kısırlık korumak hem de örnek kaybı en aza indirmek için kendi kendine yeten bir karıştırma işlemi geliştirmek amaçlanmıştır.

Bu makale, bir hücre süspansiyon işleme en aza indirir ve yüksek hücre canlılığı ve üniforma dağıtım sonuçları birimi teknik karıştırma bir pasif kullanarak bir bioink ile karıştırma göstermektedir. Bu pre-cellularized bioinks sonra bir kıkırdak veya cilt oluşturmak sırasıyla 6 haftaya kadar kültürlü bir ya da iki hücre türleri, bioprint için kullanılmaktadır. Kullanılan bioink daha önce bioprinting¹için uygunluk göstermiştir bir aljinat-nanocellulose karışımıdır.

Protokol

Bu iletişim kuralı Chalmers üniversitenin insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.

Not: Tüm steril Biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilecek adımlardır.

1. hazırlanması sarf malzemeleri, Bioink ve hücreleri

1. İki şırınga elde etmek, bir şırınga (şekil 1bir) hücre süspansiyon için diğer şırınga bioink (şekil 1b) için ise.
2. Radarı kilit bağlantısı üzerinden ikili şırınga ile birleştiğinde bir steril pasif karıştırma ünitesi (şekil 1c) edinin.
3. Kontrollü bir hızda aynı anda iki steril şırınga bir birimden bükün bir dağıtım birimi (şekil 1d) edinin.
   Not: Bu çalışmada kullanılan karıştırma oranı 10: 1'dir. Bu nedenle, 12 mL şırınga ve 1 mL şırınga 10:1 karıştırma birimi tarafından gerektiği gibi kullanın.
4. Steril kartuş (şekil 1e) ve bioink ve hücre süspansiyon içine doğrudan karışık için bir steril kadın-erkek radarı kilit bağlayıcı elde etmek.
5. Elde etmek veya bioink ile bir hücre süspansiyon karıştırma için hazırlamak.
   Not: Bu protokol için bir nanocellulose/aljinat dayalı bioink kullanılmıştır. Bu bioink bir steril 100 mM CaCl₂ çözüm sonrası yazdırma ilavesi ile çapraz bağlanmış.
6. Hücrelerin % 0.5 tripsin/EDTA çözüm kullanarak bağlantısını kesin ve toplam¹⁷trypan mavi dışlama yöntemi kullanarak hücreleri sayar.
   Not: Bu protokol için insan fibroblast kullanılmıştır.
7. Ne hücre yoğunluğu son yazdırılan yapı isteniyorsa belirlemek. Aşağıdaki denklemler bu hedef son hücre yoğunluğu sağlamak için seyreltilmiş gerekir hasat hücreleri konsantrasyon kullanarak hesaplama.
   Not: Bu protokol için 5 x 10⁶ hücre/mL son hücre yoğunluğu kullanılmıştır.
   1. Deneyler için istenen hücre konsantrasyonu seçin: C_hücre (hücre/mL).
   2. Bioink gerekli, V_bioink, istenen yapıları toplam sayısına göre miktarı Hesapla:
      V_bioink = V_inşa × N_konutların
      Not: Örneğin, 100 µL bioink yapı başına bir birimdir. 30 yapıları yazdırıldıysa, sonra gerekli bioink 3 mL birimdir.
   3. Gerekli hücre sayısını hesaplar:
      N_hücreleri = C_hücre (1.1 × V_biyolink)
   4. 1/10^th bioink hacmi hücreler (N_hücreleri) resuspend:
      V_{hücre süspansiyon} = 0.1 × V_biyolink
      Not: Örneğin, eğer V_bioink 3 mL, sonra V_{hücre süspansiyon} = 0,1 × 3 mL = 0.3 mL =

2. hücre süspansiyon ve Bioink karıştırma

1. Hücre süspansiyon hücre süspansiyon şırınga aktarın.
2. Bioink başka bir şırıngaya aktarmak veya bioink içeren bir şırınga elde edilir.
3. Bioink şırınga pistonu geri çekilip şırınga dağıtım ünitesine yerleştirin. Birim radarı kilit bağlayıcı yukarı doğru (şekil 1f1) ile dikey olarak yerleştirin.
4. Hücre şırınga pistonu geri bioink şırınga olarak benzer bir uzunluk için çekin ve dağıtım birimi (şekil 1f2) yerleştirin.
5. Her iki şırınga radarı kilit bağlayıcılar (şekil 1f3) büküm tarafından karıştırma birimine ekleyin.
6. Karıştırma sistemi şırınga havada Yükselt için dağıtım biriminde iterek Başbakan. Radarı kilit (şekil 1g4) ulaşan çözüm önce astar durdurmak.
7. Priming sonra karıştırma birim yolu ile belgili tanımlık radarı kilit bağlamak (şekil 1g5) sonu dolum kartuş takın. Dolum kartuş pistonu alt eki önce olduğundan emin olun.
8. Yavaş yavaş (şekil 1h6) bioink ve hücre süspansiyon birlikte kartuş (şekil 1i7) karıştırmak dağıtım birimi sıkıştırmak.
9. Pistonu aşağı doğru bioink hücreli karışımı karıştırma sonra başvurun için steril damlalıklı ipucu ile dolum kartuş itin. Hücre/bioink karışımı karıştırma ünitesine kalıptan çekilmiş değil emin olmak için sıkıştırılmış kadar dağıtımı devam et.
10. Kartuş kap ve herhangi bir hava kabarcıkları kartuş (piston son) başına taşımak için çalışma yüzeyinin üzerinde hafifçe dokunun.
    Not: Bu noktada, hücre/bioink yazdırma için hazır karışımdır. Aşağıdaki bölümlerde belirli uygulamalar ve yazdırma işlemleri açıklayacağım.

3. el ile Spatula karıştırma için karşılaştırıldığında bir karıştırma birimini kullanarak hücre canlılığı tespiti

1. İnsan fibroblast (Bölüm 7), % 80'i izdiham bir % 0.5 tripsin/EDTA Çözümle ayırmak, sayma ve kültür orta bioink ile karıştırma sonra son bir konsantrasyon ulaşmak için yeterli hücre yoğunluğu, resuspend (1:10 cep: bioink oranı) 5 x 10 ⁶ hücre/mL.
2. Hücre içine her iki pasif birimi teknik (Adım 2) karıştırma kullanarak bioink veya hücre canlılığı her iki tekniğin de etkisini değerlendirmek için spatula ile karıştırın.
3. Hücreleri kullanarak birimi teknik 1, 2 veya 3 kez 100 mM CaCl₂kullanarak cross-linking için bir kalıp içine dağıtımı önce karıştırma pasif bioink içine karışımı.
   Not: ek karışımlar gerçekleştirmek için bir şırınga yerine doğrudan bir kartuş cep/bioink karıştırın. O zaman önceki protokol sonrası karıştırma birimi aracılığıyla ama hücre şırınga bileşen olmadan karışım klibi için.
4. Hücreleri içine el ile mekanik bir spatula ile için 30, 60 veya 90 s. Aktarım süreleri (karıştırma her süre) karışımları için 100 mM CaCl₂ile ilişkilendirerek bir kalıp içine karıştırma kullanarak ayrı bir bioink karışımı.
5. Örnekleri cross-linking ve kültür standart koşullar altında tamamlanmasından sonra iyi bir tabağa aktarın.
6. Yapıları kültür 1 gün sonra yıkayın (n = 3-4 grup başına) serum serbest hücre kültür orta 30 dakika süreyle boyama bir çözüm yapıları hücrelerde leke (4 µM Calcein AM, 1 µM arasında etidyum homodimer-1) 30 dk için.
   1. İki ek kez yıkayın ve serum serbest hücre kültür orta 37 ° C'de 1 saat olmak üzere toplam örneklerinde kuluçkaya

Örnekleri canlı hücre yansıma çözümü aktarın.

İmge yolu ile 10 X büyütme FITC ve Texas kırmızı filtrelerle ters bir mikroskop kullanarak bir dijital renkli kameraya almak ve görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz.

Rasgele üç görüntüleri her yapı miktar hücre canlılık için seçin.

Toplam hücre sayısı için canlı hücreler oranını temel alan canlılığı hesaplayın. Bir tek yönlü ANOVA Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi ile takip üzerinden veri analiz.

4. Bioprinting kıkırdak analogları ile bir tek hücre türü

1. 3D model analog istenen doku çizin. Bioprinting için Gcode dosyasına dönüştürmek ve bioprinter¹Gcode dosyasını yükleyin.
   Not: Bu protokol için STL dosya olarak boyutları 4.8 x 4.8 x 0.9 mm³ kare yapısıyla ihraç edildi. Gcode dosya aşağıdaki ayarları kullanarak kafes yapısı oluşturuldu: katman kalınlığı, 0.3 mm; dolgu deseni, dikdörtgen çizgili; dolgu yoğunluğu, % 25; hız, 10 mm/s.
2. İzole ve birincil insan burun kondrosit (hNC) hastaların başvurulan protokolü¹takip cryopreserve.
3. Çözülme ve cryopreserved hNCs genişletin ve bir kez standart kültür orta 37 ° C'de kullanarak monolayer kültür genişletin Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ile bağlantısını kesin ve bir trypan mavi dışlama protokolü kullanarak saymak. HNCs geçit 2 kullanarak tüm deneyler yapılmıştır.
4. 100 x 10⁶ hücre/mL 300 µL % 10 fetal sığır serum, % 1 penisilin-streptomisin ve bioink ile karıştırma için hazırlık 50 µg/mL askorbik asit ile takıma kültür ortamının içinde hNCs resuspend.
5. Karışım hNC hücre süspansiyon nanocellulose/aljinat içine Birimi Protokolü 9 x 10⁶ hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için 10:1 bioink:cell süspansiyon oranında karıştırma pasif bioink aşağıdaki temel.
6. Bioprinter UV Işınlarına maruz kalma ve temizleme işlemi aşağı % 70 etanol ile steril edilmektedir emin olun. Kısırlık bir laminar akışı kabine yerleştirerek korumak.
7. Steril yazdırma başlıklarını bioink/hücre süspansiyon karışımlar içeren kartuşları takın ve bioprinter yerleştirin.
8. Bioprinter el ile veya iletişim kuralları tarafından yazıcıya özel ayarlama.
9. Bioprint kafes yapılı, aşağıdaki yazdırma parametrelerini kullanarak hücre yüklü yapıları: 25G konik Nozul 25 kPa basınçta. Bioprint-boş hücre yapıları (yok hücreleri içeren hücre orta ile karışık) bir denetim olarak.
10. 100 mm CaCl₂ 5 dk. durulama için iyonik bir çözüm yapıları ekleyerek yapılarını bölünmelerini ve standart kültür koşullarda (37 ° C, % 5 CO₂ve % 95 bağıl nem) kültür ortamında kuluçkaya. Medya her ikinci veya üçüncü gün değiştirin.
11. 2 ve 4 haftalıkken histolojik analizler için örnekler toplamak. Bir Alcian mavi leke¹⁸kullanarak GAG üretim için örnekleri leke.

5. cilt analogları iki hücre tipleri ile Bioprinting

1. İstenen doku analog 3D model çizmek ve bioprinting için Gcode dosyasına dönüştürün. Bioprinter üzerinde Gcode dosya yükleyin.
   Not: Bu protokol için STL dosya olarak boyutları 4.8 x 4.8 x 0.9 mm³ kare yapısıyla ihraç edildi. O zaman Gcode dosya aşağıdaki ayarları kullanarak kafes yapısı oluşturuldu: katman kalınlığı, 0.3 mm; dolgu deseni, dikdörtgen çizgili; dolgu yoğunluğu, % 25; hız, 10 mm/s.
2. Hücreleri bioprinting için bioink içine karıştırma için hazırlayın. Cilt analogları imalatı için iki hücre türleri kullanılmıştır. İki hücre tipleri bioink ve bioprinting içine karıştırılmıştır.
   1. Birincil HDF edinin. Bu hücrelerin % 10 fetal sığır serum, % 1 penisilin-streptomisin ve 50 µg/mL askorbik asit ile DMEM büyüme medyada bakımı. Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ve sayısı ile bağlantısını kesin.
   2. İzole ve başvurulan protokolü¹takip hastaların birincil hNC cryopreserve. Çözülme ve monolayer kültür cryopreserved hNCs genişletin. Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ve sayısı ile bağlantısını kesin.
3. 100 x 10⁶ hücre/mL büyüme ortam içinde her iki hücre tipleri resuspend. 100 x 10⁶ hücre/mL 300 µL medya bir son toplam konsantrasyon ulaşmak için birlikte bir 1:1 oranında hücre süspansiyonlar karıştırın.
4. Karışım 50: 50 hücre süspansiyon HDF ve nanocellulose/aljinat içine hNC Birimi Protokolü 9 x 10⁶ hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için 10:1 bioink:cell süspansiyon oranında karıştırma pasif bioink aşağıdaki temel.
5. Bioprinter steril edilmektedir veya laminar akış içinde kısırlık korumak için kabine yerleştirilir emin olun.
6. Steril yazdırma başlıklarını bioink/hücre süspansiyon karışımlar içeren kartuşları takın ve bioprinter yerleştirin.
7. Bioprinter ya da el ile ayarlamak veya yazıcıya özgü protokoller.
8. Bioprint kafes yapılı, aşağıdaki yazdırma parametrelerini kullanarak hücre yüklü yapıları: 25G konik Nozul 25 kPa basınçta. Bioprint-boş hücre yapıları (yok hücreleri içeren hücre orta ile karışık) bir denetim olarak.
9. 100 mm CaCl₂ 5 dk. durulama için iyonik bir çözüm yapıları ekleyerek yapılarını bölünmelerini ve standart kültür koşullarda (37 ° C, % 5 CO₂ve % 95 bağıl nem) kültür ortamında kuluçkaya. Medya her ikinci veya üçüncü gün değiştirin.
10. 2 ve 4 haftalıkken histolojik analizler için örnekler toplamak. Örnekleri kollajen için leke ben bir Masson'ın trichrome leke¹⁹kullanarak üretim.

Sonuçlar

Bu el yazması sonuçlarında iki bölüme ayrılır. İlk olarak, hücre canlılığı sonrası karıştırma mekanik yöntemi veya pasif karıştırma ünitesi ile analiz edildi. Ardından, kıkırdak ve cilt yapıları kültürlü ve ilgili histolojik işaretler için analiz.

Hücre dağıtım her iki durumda da homojen ortaya çıktı. Ancak, bir spatula (Şekil 2b) kullanarak el ile karıştırma eylem bir pasif karıştırma ünitesi ile (Şekil 2bir) karıştırma daha daha fazla farkı vardır. Ölçüde, hız ve karıştırma tekniği bir spatula ile kullanıcı üzerinde son derece bağımlı. Ancak, hücre içine bir bioink pasif bir karıştırma ünitesi ile karıştırma karıştırma programların yönetimini standartlaştıran ve toplu işlemleri arasında varyasyon en aza indirir. Ayrıca, Mayıs 30, 60 ve 90 s karıştırma zaman hücre büyük miktarda bioink büyük bir miktar karıştırma için yeterli olmayabilir. Daha titiz bir spatula ile karıştırma ile karıştırma gerekli olabilir. İçinde karşılaştırma, pasif bir karıştırma birim kullanmak daha iyi karıştırma sırasında bioink hücrelere karıştırma oranını korur ve homojen bir karıştırma gerçekleştirilir sağlar. Ayrıca, örnek bir endişe geleneksel karıştırma teknikleri ile nereye bioink Petri yemekler, tüpler ve onların yüksek viskozite nedeniyle karıştırma araçları bırakılabilir kayıptır. Hücre canlılığı karıştırma birimi ile karıştırma için yüksek (> % 90) 1, 2 veya 3 kez. Pasif karıştırma ünitesi kullanılmıştır karıştırma yaklaşık 1 dakika yavaş sabit karıştırma hızda götürdü. Bir spatula ile karıştırma yüksek canlılık 30 ve 60 s, 90'daha büyük için karıştırma sonra sergilenen iken s karıştırma diğer gruplara göre canlılığı önemli bir azalma sonuçlandı (77,9 ± % 14, p < 0,05) (Şekil 2c). Bu aşırı karıştırılması nedeniyle bu hücreleri hasara neden olabilir. Uzun vadeli canlı/ölü 14 gün ve kültürünün 28 gün sonra boyama ek şekil 1' de gösterilen. Hücreleri 14, gün geçtikçe yayılıyor başlar ve son derece gün 28 tarafından yayılır ve iyi canlılık gösteriyor.

Sonra kültür, kıkırdak ve cilt doku analogları Histoloji ile analiz edildi. Analiz kıkırdak yapıları itibariyle 0, 14 ve 28 gün, bir miktar ve bir Alcian mavi leke (şekil 3a-3_c) gösterildiği şekilde GAGs kapsamını gösterir. Gün 14 boyama konumlara hücrelere proksimal sınırlı iken leke yokluğunda gün 0, fark edilir. Ancak, gün kültür tarafından 28, Alcian mavi bir chondrocytic ECM oluşumu gösteren yapı bulunur. Bioprinted deri yapılarını histolojik boyama kollajen ile ben bir Masson'ın Trichrome leke (Resim 3d-3f) kullanarak analiz edildi. Benzer şekilde kıkırdak yapılarını, gün 0 örnekleri yok kollajen birikimi sergiledi. Tarafından gün 14 Kültür, kollajen önemli mevduat hücrelerin etrafındaki ve yapı yüzey boyunca kaydedildi. Yoğun kollajen katmanları yapı yüzeyi ve toplu içinde bulunamadı gibi bu daha fazla gün 28, tarafından geliştirilmiş oldu.

Resim 1 : Pasif karıştırma birim sistemi. (bir) 1 mL şırınga hücre süspansiyon, bioink, (c) dağıtım birimi, (d) pasif karıştırma ünitesi, (e) ile (b) 12 mL şırınga dolum kartuş, (f) Meclisi bioink şırınga (1) ve hücre için süspansiyon şırınga (2) dağıtım birimi, pasif karıştırma birimi ek şırınga (3), (g) eki, kadın-erkek radarı kilit Bağlayıcısı (4) ve ek dolum kartuş (5) sonuna tamamlar derleme, (h ) karıştırma ünitesi (6), (ı) hazırlamak için dağıtım birimi sıkıştırmak hücre süspansiyon ile bioink mix ve dolum kartuş (7) dağıtmak için dağıtım birimi üzerinde itmeye devam edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Hücre canlılığı görüntüleri ve analiz. Temsilcisi görüntüleri canlı (yeşil) ve ölü (kırmızı) insan fibroblast birim 1, 2 veya 3 kez karıştırma pasif ile karıştırdıktan sonra gösterilen (bir) veya spatula 30, 60 veya 90 saniye (b) ve 1 gün için 3D kültür. 4 X büyütme görüntülere gösterilir. Ölçek çubuklar gösterir 200 µm. (c) yüzde ortalama canlılık insan fibroblast, birim veya spatula ve 3D kültür için 1 gün karıştırma pasif ile karıştırdıktan sonra. Hata çubukları, ortalama, standart sapma gösterir * 0,005. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: doku belirli hücre dışı matriks ifade. Bioprinted kıkırdak yapılarını 14 ve (c) 28 gün 0, (b) Alcian (bir) mavi kullanan glikozaminoglikan lekeli. 5 X büyütme oranında yakalanan görüntüleri. Bioprinted cilt yapıları lekeli kollajen için ben gün 0, (e) 14, Masson'ın Trichrome (d) kullanan ve (f) 28. 5 X büyütme oranında yakalanan görüntüleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Takıma giren şekil 1: hücre canlılığı gün 14 (bir) ve gün 28 (b). Ölçek çubuğu 200 µm, yeşil hücreleri canlı başvurduğu, kırmızı ölü hücrelere başvurur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu el yazması gösterildiği gibi pre-cellularized bioinks bioprinted ya da kıkırdak imal veya 4 haftaya kadar kültürlü analogları cilt için vardı. Birimi teknik karıştırma pasif kullanarak karıştırma sonra hücre canlılığı geleneksel karıştırma yöntemleri yüksekti. Ayrıca, karıştırma birimini kullanarak karıştırma işlemi basitleştirilmesi adımlar işleme sayısını en aza indirir ve karıştırma ölçüde daha iyi tutarlılık sağlar. Sonuçta, her iki hücre dağıtım ve yapıları ve deneysel grupları arasında bioink içinde daha iyi tekrarlanabilirlik sonuçlanır. ECM bileşenleri GAGs ve kollajen gibi belirli doku birikimi kıkırdak ve cilt analogları için kültür sırasıyla 4 hafta sonra gözlendi. Bu karıştırma tekniği ve farklı doku hedefleri imal etmek seçilmiş yapı geometri esnekliğini gösterir. Kıkırdak ve cilt analogları imalatı her iki nanocellulose-aljinat bioink ve kullanımı bioprinting tekniği farklı mühendislik doku hedefleri için esneklik sergiledi. Çalışmanın sonuçları aşağıdaki iki bileşeni ele alınacak: (1 pasif birimi teknik ve kıkırdak ve cilt analogları içindeki hücreleri (2 davranışını karıştırma.

Geliştirilmesi ve optimizasyonu için bir bioink bir hücre süspansiyon karıştırma bir teknik bu yapıları imalatı için fevkalade. Geleneksel düşük viskozite hidrojel malzemesi, tehdit yazdırmadan önce bir bioink pre-cellularization altında bioinks yüksek viskozite sonuçlandı. Bir bioink içine hücre şirketleşme geleneksel yöntemine alternatif olarak, tek adımlı bir hücre süspansiyon viskoz bir bioink karıştırma için bir protokol geliştirilen ve tartışıldı. Ayrıca, doku yapıları imalatı karıştırma Bu teknikte pratik uygulama değerlendirilmiştir. Bu tek adımlı karıştırma yaklaşımı geleneksel karıştırma teknikleri dahil kontrollü karıştırma oranı, yüksek ve düzensiz kesme vurguluyor, indirilmesi birçok avantajı vardır ve örnek ortadan kaldırmak için kapalı bir sistem kapatın damarları karıştırma. Ancak, bu teknik avantajları cep/bioink karıştırma için geleneksel yöntemler üzerinde emin olmak için birkaç önemli adımlar bulunmaktadır. Hücre şırınga hücrelerde askıya ve iyi karıştırma önce karışık sağlamak için önemlidir. Çok büyük, kaldırma ve transfer hücrelerin arasında bir zaman aralığı içinde belgili tanımlık tenkıye ve başlangıç karıştırma işlemi düzensiz karıştırma ve dağıtım yazdırılan bir filament içine neden olur tortu hücrelere neden olabilir. Sedimantasyon izlenebiliyor, basit inversiyon (2 - 3 kez), Eğer hemen önce karıştırma pasif karıştırma ünitesi montaj hücreleri resuspend ve karıştırma önce tekdüze dağılım sağlamak için yeterli olduğunu. Bu da şırıngaları hava kabarcıkları ortadan kalkar veya önceden karıştırma oranı sabit kalmasını sağlamak için simge durumuna küçültülmüş önemlidir. Büyük hava kabarcıkları karıştırma önce bioink kartuş kalırsanız, çözüm ayrıntılı karıştırma sağlamak için ek bir süre karıştırma birimi üzerinden çalıştırılması önerilir. Hava kabarcığı kalırsa, baskı kartuşu/şırınga nazik dokunarak kalan hava kabarcıkları yerinden. Birden çok malzeme (birkaç karıştırma birimleri veya malzeme) karıştırma daha karmaşık yapıları için gerekli ise, buna ek olarak, karışık olması bioinks/hücre süspansiyonlar konsantrasyonları karıştırmak yoluyla, uygun sulandrarak sonra emin olmak için ayarlanması gerekir son konsantrasyonu hala elde edilir.

Diğer karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, pasif karıştırma ünitesi bioinks cellularize için yeni bir yaklaşımdır. Karıştırma veya bir spatula veya başka bir araç ile karıştırarak çift şırınga gibi diğer karıştırma teknikleri pasif karıştırma birim toplu işlemleri ve kullanıcılar arasında karıştırma daha fazla tutarlılık sağlar. Bir spatula karıştırma gibi el ile karıştırma teknikleri doğası kapsamını ve karıştırma oranı büyük kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon sonuçlanır. Ayrıca, birim ve çift şırınga karıştırma karıştırma pasif gibi kapalı sistemler bir Petri kabına veya tüp içinde karıştırma el ile karşılaştırıldığında küçük hiçbir örnek kaybı olması.

Bu el yazması fabrikasyon her iki doku analogları bioink tek bir türü ve bir veya iki hücre tipleri oluşuyordu. Ancak, farklı hücre tipleri ile farklı bioinks bölgelerinde içeren mimarileri oluşan doku analogları bioprinting daha fazla fizyolojik doku yapıları^{20,21imalatı için gerekli olabilir, 22}. Daha bioinks benzersiz besteleri ile özel veya işlevleri birlikte farklı kompozisyonlar veya işlevleri^{23var multimaterial bioinks oluşturmak için varolan bioinks çeşitli karıştırma aracılığıyla oluşturulabilir, 24}. Bu gibi cilt için cilt altı katman veya nerede bioink kompozisyon^25,26 bir degrade gelişimini sağlamak gerekli olabilir bölge bir doku kemik kıkırdak doku geçiş bölgeleri, özellikle önemli olabilir Bu kritik bölgelerde yerel doku²⁷' bulundu. Ayrıca, bir karıştırma birim büyüme faktörleri ve morfojenlerdeki bioprinting önce bioinks içine karıştırmak için yararlanılabilir. Örnek kaybı kapalı karıştırma sistemi ile ortadan kaldırılması nerede örnek kaybı son onların konsantrasyon bioprinted yapý içinde bir değişiklik neden olabilir, pahalı ve düşük konsantrasyon biyoaktif faktörler, kullanım için çekici olduğunu özellikle degradeler katılmaktadırlar.

Mekanik olarak duyarlı hücre tipleri hasar riski bu çalışmada kullanılan birim karıştırma pasif dahil olmak üzere herhangi bir karıştırma tekniği ile bir kısıtlamadır. Örneğin, kök hücre böyle izole kemik iliği veya embriyo veya İndüklenmiş pluripotent kök hücreler Bunlar mekanik hasar^28,29için daha duyarlı. Karıştırma işlemi karıştırma sürecine dahil kesme Kuvvetleri nedeniyle hücrelerinde anormal mekanik gerilmeler kazandırır ve canlılığı³⁰korumak için dengelenmelidir. İyi canlılık (Şekil 2) birincil fibroblastlar ve bu çalışmanın kondrosit kullanımıyla sonuçlanan iken, daha fazla çalışmaları güvenli karışım ve oranlarının daha duyarlı hücre tipleri için belirlemek gereklidir. O zamana kadar bu karıştırma canlılığı en üst düzeye çıkarmak için sürekli bir yavaş sıklığı altında yapılması tavsiye edilir. Buna ek olarak, bu çalışmada seçilen hücre yoğunluğu önceki çalışmalar¹üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Bu hücre yoğunluğu tüm hücre türleri için ideal olmayabilir.Özellikle, daha yüksek bir konsantrasyon hücreleri karıştırma hücre canlılığı ve doku oluşumu^31,32artırabilir artan hücre-hücre kişiler'neden olabilir. Benzer şekilde, pasif karıştırma birim hücre pulcuklarının veya diğer hücre toplamları³³ bioinks karıştırma için uygun olabilir.

Olarak önerilen ve gösterdi bu çalışmada, bir pasif karıştırma birim sistemi hızla viskoz bir bioink bir hücre süspansiyon karışımı olabilir. Hücrelere mekanik hasar için risk hala kalırken, yaklaşım ve kullanıcılar arasında tek bir çalışma içinde karıştırma daha fazla tutarlılık sağlar. Pre-cellularized bioinks bu yaklaşımı kullanan her iki kıkırdak imal ve 4 haftaya kadar kültürlü ve doku belirli ECM işaretlerini birikimi gösterdi analogları deri kullanılmıştır. Gelecekteki çalışmaları birimi sistem üzerinden standart bioinks daha karmaşık doku analogları imalatı için özel bioinks karışım karıştırma pasif kullanımı ele alınacak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
STARTINK Kit	CELLINK	SK0001	Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure
Live/Dead Kit	Life Technologies	L3224	Kit for the analysis of cell viability after mixing
Masson's Trichrome	Sigma Aldrich	HT15-1KT	Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs
Alcian Blue	Sigma Aldrich	B8438-250ML	Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs
INKREDIBLE+ bioprinter	CELLINK	Gen1+	Printer utilized in the study
DMEM with Glutamax	Thermofisher	10566016	Media for culture of the cells
10% fetal bovine serum	Thermofisher	A3160402	Media supplement
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063	Media supplement
live cell imaging solution	thermofisher	A14291DJ	component utilized using live/dead imaging
inverted microscope	Olympus	IX73	microscope utilized
a digital color camera	Olympus	XC10	microscope camera utilized
cellSens imaging software	Olympus	n/a	stock software with the microscope
ImageJ	NIH	n/a	open source image analysis software
GraphPad Prism 7	GraphPad	n/a	software for statistical analysis
Slic3r software (v1.2.9)	Slic3r	n/a	open-source software to convert .stl file to gcode
primary adult human dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	cell source for fibroblasts