연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

요약

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

초록

Bioprinting 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 구문 신속 하 고 재현성 제조 강력한 기술입니다. 이 연구에서는 연골과 피부 유사 체 소설 수동 단위 기술 혼합을 이용 하 여 bioink pre-cellularization 후 조작 했다. 이 기술은 높은 점성 bioink에 세포 현 탁 액의 혼합에 관련 된 단계를 단순화 하는 목적으로 개발 되었다. Bioprinting를 통해 입금 하는 필 라 멘 트의 해상도 셀 영역의 셀 없이 증 착 또는 바늘을 방해할 수 있습니다 큰 세포 덩어리의 보존을 피하기 위해 인쇄 전에 배포에 균일의 보증을 필요로 합니다. 우리는 빠르게 연골과 피부 유사 체의 bioprinting 전에 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 하는 기능을 보여 줍니다. 두 조직 아날로그 최대 4 주 동안 배양 수 있습니다. 조직학 분석 시연 세포 생존 능력 및 조직의 특정 세포 외 기질 (ECM) 마커 있다 (개 그), 콜라겐 등의 난 각각.

서문

최근 몇 년 동안, 3 차원 (3D) bioprinting 기술 연구원, 기술 조직 유사 체의 제조에 더 널리 활용 될 수 있도록 더 접근 되고있다. Bioprinting 생물 의학 연구의 다각적인 조직 구문 신속 하 고 반복 가능한 제조를 촉진 하 여 혁명을 약속 드립니다. Bioprinting 기술의 핵심 3 차원에서 생체 재료 (bioinks 라고도 함)의 증 착을 정확 하 게 제어 하는 능력에 낳는다. 매트릭스 구성, 생리 활성 요소, 및 기본 조직 구조 정리 더 정확 하 게 수 있는 셀의 별개의 영역으로 복잡 한 장비의 세대 수 있습니다.

Bioprinting은 연골¹, 피부²,³, 근육 및 뼈⁴를 포함 하 여 많은 조직의 응용 프로그램에 대 한 구조의 제조에 이용 되었습니다. 이 조직 때문에 그들의 본질적인 전기 마이크로-아키텍처 레이어, 레이어 증 착을 통해 재현 부에 대 한 적합 한 bioprinting에 대 한 매력이 있습니다. 특히, 피부 bioprinting 같은 레이어, 레이어 증 착 기술을 통해 제조를 위해 적당 한 잘 정의 된 다층된 구조⁵를 소유한 다. 또한, bioprinting 구조는 필요한 해 부 치수를 생성 하기 위해 이용 될 수 있다와 형태는 조직 복구를 제거. 환자 특정 크기와 모양⁶ 생체 재료를 생성 하는 기능 등 많은 조직의 부분 수리에 대 한 수요를 해결 하기 위해 시작할 수에 국한 되지 않는 뼈 결함, 연골 손상 및 피부 장애의 정도에서 변화 한다 환자-환자입니다.

이 연구에서 두 조직 아날로그 (관절 연골과 피부) pre-cellularized bioinks bioprinting를 통해 조작 했다. 셀 서 스 펜 션 도전이 될 수 있다 세포 생존 능력을 보존 하는 동안 균일 한 셀 배포를 보장할 수 있는 bioink의 적절 한 혼합을 보장 합니다. Bioinks bioprinting 통해 압출에 적합 자주 높은 점성 그리고 균질 성 혼합 되도록 혼합 하는 광범위 한 필요. 셀에 기계적 손상 거친 혼합 조건 하에서 발생 하 고 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 연구 결과 잉크젯 인쇄 프로세스 동안 대부분 세포 죽음 혼합^7,8등 준비 하는 동안 발생 하는 것으로 나타났습니다. 전통적인 혼합 교 반⁹ 낮은 점도 bioinks 잉크젯 인쇄¹⁰적합에 대 한 충분 한 될 수도 있지만, 높은 점도 bioink로 셀의 혼합 압출 bioprinting를 위해 더 적당 한 더 어렵습니다. 해결이 필요, 혼합 노즐의 사용 더 인쇄 과정¹¹동안 bioinks의 혼합에 대 한 인기가 되고있다. 이들이 믹서는 또한 널리 이용 되어 마이크로 연구 중요 한¹²가 낮은 레이놀즈 수와 액체의 혼합에. bioink으로 세포 현 탁 액을 혼합 하는 연속 혼합 공정 활용 인쇄 과정에서 균일성에 대 한 수 것입니다. 그러나, 이후 셀 정지는 bioink에 비해 낮은 점도가지고, 인쇄 과정^9,,1314중 셀의 침전 방지에 어려움 발생 합니다. 또는, 인쇄 하기 전에 bioink로 셀의 혼합이 문제를 해결 수 있습니다.

최소화 하기 위해 세포 죽음을 bioink으로 혼합 하는 동안, 우리는 최소한의 단계에서 bioink 셀 바꿀 수동 섞는 단위에 따라 기술을 개발. 혼합 장치를 통해 자료의 흐름을 통해 생성 된 혼란 혼합 reproducibly 조화 두 가지 구성 요소가 함께^15,16에 충분 하다. 이 방법은 주로 어떤 bioink는 압출 bioprinting 적합으로 어떤 세포 현 탁 액의 혼합을 단순화 하기 위해 개발 되었다. 혼합 과정에서 단계 수 혼합 사용자-사용자 변형 제거를 최소화 했다. 과도 한 혼합 단계 셀 관련 하는 경우에 특히 시간이 걸릴 하 고 모든 bioinks, 적용 되지 않습니다 될 수 있습니다. 보조, 우리 독립적인 무 균 유지와 샘플 손실을 최소화 하는 혼합 공정 개발 목적.

이 원고, 혼합 세포 현 탁 액 bioink 수동 처리를 최소화 하 고 높은 세포 생존 능력 및 유니폼 배포 단위 기술 혼합을 사용 하 여 보여 줍니다. 이러한 pre-cellularized bioinks 다음 bioprint 연골 또는 피부 최대 6 주에 대 한 교양을 각각 하나 또는 두 개의 셀 종류와 구성에 활용 됩니다. 활용 하는 bioink 이전 bioprinting¹에 대 한 적합성 표시는 alginate nanocellulose 조화입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Chalmers 대학의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

참고: 모든 단계 살 균 biosafety 내각 내에서 수행할 수 있습니다.

1. 소모품, Bioink, 및 세포의 준비

1. 두 개의 주사기를 얻을, bioink (그림 1b)에 대 한 다른 주사기는 한 주사기 (그림 1a) 셀 서 스 펜 션입니다.
2. 살 균 수동 혼합 단위그림 1(c) 듀얼 주사기 Luer 잠금 연결을 통해 결합 될 수 있다 얻을.
3. 볼륨 제어 속도로 동시에 두 개의 무 균 주사기에서 돌출 수 분배 장치를 (그림 1의d)를 가져옵니다.
   참고:이 연구에 활용 하는 혼합 비율 10:1입니다. 따라서, 10:1 혼합 단위에 따라 12 mL 주사기와 1 mL 주사기를 사용 합니다.
4. (그림 1e) 살 균 카트리지 및 직접에 bioink 및 세포 현 탁 액을 혼합 하는 살 균 여성 여성 Luer 잠금 커넥터를 가져옵니다.
5. 얻거나는 bioink 세포 현 탁 액과 혼합에 대 한 준비.
   참고:이 프로토콜에 기반으로 하는 nanocellulose/alginate bioink 이용 되었다. 이 bioink는 포스트 인쇄 살 균 100 m m CaCl₂ 솔루션의 추가 통해 상호 연결 된.
6. 0.5 %trypsin / EDTA 용액을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 trypan 블루 제외 방법¹⁷를 사용 하 여 셀의 총 수를 계산 합니다.
   참고:이 프로토콜에서 인간의 섬유 아 세포 했다 활용 됩니다.
7. 어떤 셀 밀도 최종 인쇄 된 구문에서 원하는 결정 합니다. 이 대상 최종 셀 밀도 달성 하기 위해 희석 해야 합니다 수확된 셀의 농도 다음 방정식을 사용 하 여 계산 합니다.
   참고:이 프로토콜에서 최종 셀 밀도 5 x 10⁶ 셀/mL의 이용 되었다.
   1. 원하는 셀 농도 실험에 대 한 선택: C_셀 (셀/mL).
   2. Bioink 필요, V_bioink, 원하는 구문의 총 수에 따라 금액 계산:
      V_bioink = V_구성 × N_Contructs
      참고: 예를 들어 구문 당 bioink의 볼륨은 100 µ L. 30 구조, 인쇄 하는 경우 필요한 bioink 볼륨 3 mL입니다.
   3. 필요한 셀의 수를 계산.
      N_셀 C_셀 (1.1 × V_biolink) =
   4. Resuspend 1/10^번째 는 bioink의 볼륨에서에서 (N_셀) 셀:
      V_{세포 현 탁 액} = 0.1 × V_biolink
      참고: 예를 들어, 경우 V_bioink V_{세포 현 탁 액} 3 mL = = 0.1 × 3 = 0.3 mL

2. 세포 현 탁 액 및 Bioink의 혼합

1. 셀 서 스 펜 션 주사기로 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
2. 다른 주사기에는 bioink를 전송 하거나 포함 하는 bioink 주사기를 얻을.
3. Bioink 주사기 플런저를 후퇴 하 고 분배 장치에 주사기를 삽입 합니다. 세로로 Luer 잠금 커넥터와 위쪽 (그림 1f1) 단위를 배치 합니다.
4. Bioink 주사기로 비슷한 길이를 다시 셀 주사기의 플런저를 당겨 하 고 분배 장치 (그림 1f2)에 삽입 합니다.
5. Luer 잠금 커넥터 (그림 1f3) 복잡 하 게 혼합 단위를 모두 주사기를 연결 합니다.
6. 돌출 주사기에 공기를 분배 장치에 밀어 혼합 시스템을 프라임. 못쓰게 솔루션 Luer 잠금 (그림 1g4)에 도달 하기 전에 중지 합니다.
7. 애 벌 칠, 후 충전 카트리지 Luer 잠금 커넥터 (그림 1g 5)를 통해 혼합 단위의 끝에 연결 합니다. 충전 카트리지에서 플런저 하단 첨부 파일 이전에 있는지 확인 합니다.
8. 천천히 카트리지 (그림 1i7)에 함께 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 분사 장치 (그림 1h6) 압축.
9. Bioink-셀 혼합 혼합 후 연결할 피펫으로 멸 균 팁 충전 카트리지 아래쪽에 플런저를 밀어. 셀/bioink 혼합물은 혼합에 다시 압출 하지 있도록 압축 될 때까지 분배 하십시오.
10. 카트리지 뚜껑을 부드럽게 작업 대에 카트리지 (피스톤 끝)의 상단에 어떤 공기 방울을 이동 하려면 누릅니다.
    참고:이 시점에서 셀/bioink 혼합은 인쇄에 대 한 준비. 다음 섹션에서는 특정 응용 프로그램 및 인쇄 절차 개요 것입니다.

3. 수동 주걱 혼합에 비해 혼합 단위를 사용 하 여 세포 생존 능력의 결정

1. 80% 합류에서 0.5%의 트립 신/EDTA 용액으로 인간의 섬유 아 세포 (통로 7)를 분리, 개수, 및 충분 한 세포 밀도 bioink와 혼합 후 최종 농도 달성 하기 위해 문화 매체에서 resuspend (1시 10분 셀: bioink 비율) 5 x 10의 ⁶ 셀/mL입니다.
2. 혼합 셀 중 수동 단위 기술 (단계 2)를 혼합 사용 하 여 bioink 또는 세포 생존 능력에 두 기술의 효과 평가 하는 주걱을 통해.
3. 수동 단위 기술 1, 2, 또는 3 번 100 m m CaCl₂를 사용 하 여 교차 연결에 대 한 금형에 분배 하기 전에 혼합을 사용 하 여 bioink로 세포를 혼합.
   참고: 추가 혼합을 수행 하는 카트리지 보다는 주사기에 직접 셀/bioink를 혼합. 다음 혼합 셀 주사기 구성 하지 않고 이전 프로토콜에 따라 혼합 장치를 통해 리믹스.
4. 혼합 주걱을 통해 30, 60, 90 또는 미 전송의 기간에 대 한 (각 혼합 시간)에 대 한 혼합물 100 mM CaCl₂를 사용 하 여 교차 연결에 대 한 금형에 수동 기계를 사용 하 여 별도 bioink로 세포를 혼합.
5. Cross-linking 문화와 표준 조건 하에서 완료 후에 잘 접시에 샘플을 전송.
6. 문화의 1 일 후 씻어 구문 (n = 그룹 당 3-4) 30 분에 대 한 혈 청 무료 세포 배양 매체에 얼룩 얼룩 솔루션 구문에서 셀 (4 µ M Calcein 오전, 1 µ M 브로민 homodimer-1) 30 분.
   1. 두 개의 추가 번 세척 하 고 37 ° c.에서 1 h의 총에 대 한 혈 청 무료 세포 배양 매체에서 샘플을 품 어

라이브 셀 이미징 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.

FITC와 텍사스 레드 필터와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 10 배 확대에 디지털 컬러 카메라를 통해 이미지 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

세포 생존 능력의 정량화에 대 한 각 구성에서 3 개의 이미지를 임의로 선택 합니다.

생존 세포의 총 수를 라이브 셀의 비율에 따라 계산 합니다. Tukey의 다중 비교 테스트 뒤 일방통행 ANOVA 통해 데이터를 분석 합니다.

4. 단일 셀 유형으로 연골 아날로그 Bioprinting

1. 원하는 조직 아날로그의 3D 모델을 그립니다. Gcode 파일 bioprinting에 변환 하 고 bioprinter¹에 Gcode 파일 로드.
   참고:이 프로토콜에 크기 4.8 x 4.8 x 0.9 m m³ 평방 구조는 STL 파일로 내보낼 했다. 다음 설정을 사용 하 여 격자 구조의 Gcode 파일 생성: 레이어 두께, 0.3 m m; infill 패턴, 직선; infill 밀도, 25%; 속도, 10 m m/s입니다.
2. 분리 하 고 기본 인간의 코 chondrocytes (hNC) 환자 참조 된 프로토콜¹에서 cryopreserve.
3. 해 동 및 cryopreserved hNCs를 확장 하 고 37 ° c.에 표준 문화 매체를 사용 하 여 단층 문화에 한 번 확장 80-90% 합류 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션에서 세포를 분리 하 고 trypan 블루 제외 프로토콜을 사용 하 여 계산. 모든 실험은 통로 2에 hNCs를 사용 하 여 실시 했다.
4. 100 x 10⁶ 셀/mL 이내 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스, 그리고 준비는 bioink 혼합 50 µ g/mL ascorbic 산 보충 문화 매체의 300 µ L에는 hNCs를 resuspend.
5. 블렌드 nanocellulose/alginate에 hNC 세포 현 탁 액 단위 프로토콜 9 x 10⁶ 셀/mL의 최종 셀 농도를 10:1 bioink:cell 정지 비율로 혼합 수동 bioink 다음을 기반으로 합니다.
6. 그는 bioprinter 살 균 되 자외선 노출과 닦기를 통해 아래로 70% 에탄올으로 확인 합니다. 층 류 흐름에 캐비닛을 배치 하 여 불 임을 유지 합니다.
7. Bioink/셀 서 스 펜 션의 혼합을 포함 하는 카트리지를 살 균 인쇄 노즐을 연결 하 고는 bioprinter에 삽입.
8. 수동으로 또는 프린터에 특정 프로토콜에 의해는 bioprinter를 보정.
9. Bioprint 격자 구조 셀-라덴 구문 다음 인쇄 매개 변수를 사용 하 여: 25 G 25 kPa의 압력에 원뿔 노즐. Bioprint 셀-무료 구조 (셀을 포함 하는 셀 매체와 혼합) 컨트롤입니다.
10. 구문을 구문 100 m m CaCl₂ 5 분 린스의 이온 솔루션을 추가 하 여 상호 링크 하 고 표준 문화 조건 (37 ° C, 5% CO₂, 그리고 95% 상대 습도)에서 문화 매체에서 품 어. 두 번째 또는 세 번째 매일 미디어를 변경 합니다.
11. 2-4 주에 조직학 분석을 위해 샘플을 수집 합니다. Alcian 블루 얼룩¹⁸를 사용 하 여 개 그 생산에 대 한 샘플을 얼룩.

5. 2 개의 세포 유형으로 피부 아날로그 Bioprinting

1. 원하는 조직 아날로그의 3D 모델 그리고 bioprinting Gcode 파일로 변환. Gcode 파일은 bioprinter에 로드 합니다.
   참고:이 프로토콜에 크기 4.8 x 4.8 x 0.9 m m³ 평방 구조는 STL 파일로 내보낼 했다. Gcode 파일은 다음 설정을 사용 하 여 격자 구조의 생성: 레이어 두께, 0.3 m m; infill 패턴, 직선; infill 밀도, 25%; 속도, 10 m m/s입니다.
2. Bioprinting에 대 한 bioink에 혼합에 대 한 셀을 준비 합니다. 피부 유사 체의 제조에 대 한 2 개의 세포 유형 활용 했다. 두 세포 유형 bioink와 bioprinting로 혼합 했다.
   1. 기본 HDF를 얻을. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스와 50 µ g/mL ascorbic 산 보충 DMEM 성장 매체에서이 세포를 유지 합니다. 80-90% 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션 및 카운트와 합류에 셀을 분리 합니다.
   2. 분리 하 고 기본 hNC 환자 참조 된 프로토콜¹에서 cryopreserve. 해 동 한 단층 문화에서 cryopreserved hNCs를 확장 합니다. 80-90% 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션 및 카운트와 합류에 셀을 분리 합니다.
3. 100 x 10⁶ 셀/mL 성장 미디어 내에 두 종류를 resuspend. 믹스 미디어의 300 µ L에서 100 x 10⁶ 셀/mL의 최종 총 농도 달성 하기 위해 1:1 비율로 함께 셀 정지.
4. 블렌드 HDF 및 nanocellulose/alginate에 hNC의 50: 50 세포 현 탁 액 단위 프로토콜 9 x 10⁶ 셀/mL의 최종 셀 농도를 10:1 bioink:cell 정지 비율로 혼합 수동 bioink 다음을 기반으로 합니다.
5. bioprinter 살 균 되 또는 무 균 유지 캐비닛 층 흐름에 배치 됩니다 확인 하십시오.
6. Bioink/셀 서 스 펜 션의 혼합을 포함 하는 카트리지를 살 균 인쇄 노즐을 연결 하 고는 bioprinter에 삽입.
7. bioprinter 중 하나를 수동으로 보정 또는 프린터에 특정 프로토콜.
8. Bioprint 격자 구조 셀-라덴 구문 다음 인쇄 매개 변수를 사용 하 여: 25 G 25 kPa의 압력에 원뿔 노즐. Bioprint 셀-무료 구조 (셀을 포함 하는 셀 매체와 혼합) 컨트롤입니다.
9. 구문을 구문 100 m m CaCl₂ 5 분 린스의 이온 솔루션을 추가 하 여 상호 링크 하 고 표준 문화 조건 (37 ° C, 5% CO₂, 그리고 95% 상대 습도)에서 문화 매체에서 품 어. 두 번째 또는 세 번째 매일 미디어를 변경 합니다.
10. 2-4 주에 조직학 분석을 위해 샘플을 수집 합니다. 콜라겐에 대 한 샘플의 얼룩이 나 Masson의 trichrome 얼룩¹⁹를 사용 하 여 생산.

결과

이 원고는 결과 두 개의 섹션으로 나누어집니다. 첫째, 세포 생존 능력 후 기계적인 방법 또는 수동 혼합 단위 혼합 분석 했다. 다음, 연골 및 피부 구문은 경작 되었고 관련 조직학 표식에 대 한 분석.

셀 유통 동질적인 두 경우 모두에서 나타났다. 그러나, 주걱 (그림 2b)를 사용 하 여 손으로 혼합의 행동 수동 혼합 단위 (그림 2는)와 혼합 하는 것 보다 더 많은 차이 있다. 범위, 속도, 그리고 주걱으로 혼합 기술을 매우 사용자에 따라 달라 집니다. 그러나, 수동 섞는 단위와 bioink로 세포를 혼합 혼합 표준화 하 고 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 합니다. 또한, 30, 60, 90 s 혼합 시간 5 월 bioink의 대량으로 많은 양의 세포의 혼합에 대 한 충분 한 수 없습니다. 주걱으로 혼합을 통해 보다 엄격한 블렌딩 할 수 있습니다. 비교, 수동 혼합 단위를 활용 하 여 더 나은 혼합 하는 동안 bioink에 셀의 혼합 비율을 유지 하 고 균질 혼합 수행 되도록 보장. 또한, 샘플 손실 어디 bioink 남아 있을 수 있습니다 뒤에 접시, 튜브, 및 그들의 높은 점도 인해 혼합 도구에서 전통적인 혼합 기술로 관심사 이다. 세포 생존 능력은 섞는 단위와 혼합에 대 한 높은 (> 90%) 1, 2, 또는 3 번. 수동 혼합 단위 이용 되었다 때 일정 한 속도로 천천히 혼합 약 1 분을 했다 혼합. 30 그리고 60 s 90 보다 큰에 대 한 혼합 후 높은 생존 능력을 전시 주걱으로 혼합 하는 동안 다른 그룹에 비해 생존에 큰 감소 귀착되 었 다 혼합의 s (77.9 ± 14%, p < 0.05)그림 2(c). 이 과도 한 혼합 세포에 손상을 일으키는 원인일 수 있습니다. 장기 라이브/죽은 얼룩 14 일 및 문화의 28 일 후 보충 그림 1에 표시 됩니다. 셀 하루 14, 확산 시작 높은 하루 28, 확산 하 고 좋은 생존을 나타냅니다.

문화, 후 연골과 피부 조직 아날로그 조직학 통해 분석 되었다. 0, 14, 그리고 28 일에 연골 구문 분석에서는 수량에 Alcian 블루 얼룩 (그림 3a-3_c)를 통해 같이 개 그의 범위 증가. 하루에 14 얼룩은 위치에 있는 셀에 인접 하는 동안 얼룩의 부재는 날 0, 것으로 나타났습니다. 그러나, 문화의 하루 28, Alcian 블루 chondrocytic ECM의 형성을 보여주는 구조에 걸쳐 발견 된다. Bioprinted 피부 구조는 조직학 얼룩 콜라겐의 Masson의 Trichrome 얼룩 (그림 3d-3 층)을 활용 하 여 내가 통해 분석 되었다. 연골 구조와 마찬가지로, 0 샘플 전시 아니 콜라겐 증 착. 문화의 하루 14, 콜라겐의 상당한 예금 셀 주위 및 구성의 표면을 따라 지적 했다. 이 조밀한 콜라겐 레이어 구조 표면에 및 대량 내 발견 했다 더 하루 28, 강화 되었다.

그림 1 : 혼합 단위 시스템 수동. 세포 현 탁 액, (b) 12 mL 주사기 (e), (d) 수동 혼합 단위, (c) 분배 단위, bioink 카트리지, (f) 어셈블리 bioink 주사기 (1) 및 셀의 작성에 대 한 (는) 1 mL 주사기 서 스 펜 션 주사기 (2) 분배 단위, 수동 혼합 단위 주사기 (3), 여성 여성 Luer 잠금 커넥터 (4)의 첨부 파일 (g)와 충전 카트리지 (5)의 첨부 파일의 끝에 부착 완료 (h, 어셈블리 ) 총리는 혼합 단위 (6), (나)를 분배 단위를 압축 분배 단위는 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 하 여 충전 카트리지 (7)으로 분배에 밀어 계속. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 세포 생존 이미지 및 분석. 수동 단위 1, 2, 또는 3 배 혼합과 혼합 후 라이브 (녹색)와 죽은 (레드) 인간의 섬유 아 세포를 보여주는 대표 이미지 (a) 또는 30, 60, 또는 90 초 (b)에 대 한 주걱과 1 일 3D 문화. 4 배 확대에 이미지 표시 됩니다. 규모 막대 표시 200 µ m. (c) % 평균 생존 인간의 섬유 아 세포의 1 일 단위 또는 주걱 및 3D 문화를 혼합 하는 수동과 혼합 후. 오차 막대의 평균, 표준 편차를 표시 * 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 조직 특정 세포 외 매트릭스 증 착. 14, 그리고 (c) 28 Bioprinted 연골 구조 있다 0, (b) Alcian (a)에서 파란색을 활용 하 여 대 한 스테인드. 5 배 확대에서 캡처 이미지입니다. 콜라겐에 대 한 Masson의 Trichrome (d)를 사용 하 여 0, (e) 14, 난 스테인드 Bioprinted 피부 구조와 (f) 28. 5 배 확대에서 캡처 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 14 (a), 일과 일 28 (b)에서 세포 생존 능력. 눈금 막대는 200 µ m, 그린 라이브 셀 참조, 레드 죽은 세포를 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

에서와 같이이 원고, pre-cellularized bioinks bioprinted 중 연골을 조작 또는 아날로그 최대 4 주 동안 배양 된 피부를 했다. 수동 단위 기술 혼합을 사용 하 여 혼합 한 후 세포 생존 능력 전통적인 혼합 방법 보다는 더 높았다. 또한, 혼합 장치를 사용 하 여 혼합 프로세스의 단순화 처리 단계 수를 최소화 하 고 혼합의 정도에서 더 나은 일관성에 대 한 있습니다. 궁극적으로, 두 셀 유통 구조 및 실험적인 그룹 bioink, 시간과 더 나은 재현성 결과. 조직의 특정 ECM 등의 구성 요소 개 그 콜라겐의 난 문화의 4 주 후 각각 연골과 피부 유사 체에 대 한 관찰 되었다. 이 혼합 기술과 다른 조직 대상을 조작 하 선택한 구조 기하학의 유연성을 나타냅니다. 연골과 피부 유사 체의 제조 전시 독특한 설계 조직 목표에 대 한 nanocellulose-alginate bioink와 bioprinting의 두 사용의 유연성. 우리는 아래의 연구의 두 가지 구성 요소를 설명 합니다: (1) 수동 단위 기술, 그리고 (2) 연골과 피부 유사 체 내의 셀의 동작을 혼합.

개발과 bioink에 세포 현 탁 액의 혼합에 대 한 기술 최적화 이러한 구조의 제조에 중요 했다. 전통적인 낮은 점도 히드로 재료, 달리는 bioinks의 높은 점도 인쇄 하기 전에 bioink의 pre-cellularization에 어려움에 결과. bioink에 셀 설립의 전통적인 방법 대신, 점성 bioink에 세포 현 탁 액의 원스텝 혼합에 대 한 프로토콜 개발 및 논의. 또한, 조직 구조의 제조에서 혼합이 기술의 실용적인 응용 프로그램 평가 했다. 이 한 단계 혼합 방법은 전통적인 혼합 기술 포함 제어 혼합 비율, 높은 및 불규칙 한 전단 응력의 최소화를 통해 몇 가지 장점이 고 샘플을 제거 하는 닫힌된 시스템 혼합 용기에 닫습니다. 그러나,이 기술은 세포/bioink 혼합에 대 한 전통적인 방법에 비해 장점이 되도록 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 셀 셀 주사기에 중단 하 고 잘 혼합 하기 전에 혼합 긴요 하다. 너무 큰 주사기에 해제 및 셀의 전송 사이의 시간 간격의 시작 혼합 공정 발생할 수 있습니다 고르지 혼합 및 인쇄 된 필 라 멘 트로 유통 될 토사에 셀. 경우 침전 관찰, 간단한 반전 (2-3 회)의 혼합 직전 수동 혼합 단위 어셈블리는 resuspend 세포와 혼합 전 균일 한 분포를 보장 하기에 충분. 그것도 주사기에서 공기 방울 제거 또는 최소화 혼합 비율이 일정 하 게 유지 되도록 사전에 중요 한. 큰 공기 방울 혼합 이전 bioink 카트리지에 남아, 경우에 솔루션을 통해 실행 혼합 단위는 추가 시간 철저 하 게 혼합 되도록 하는 것이 좋습니다. 공기 방울 남아 있으면 인쇄 카트리지/주사기의 부드러운 도청 잔류 공기 방울 치환 수 있습니다. 또한, 여러 재료 혼합 (여러 혼합 단위 또는 자료)은 필요한 경우 더 복잡 한 구조에 대 한, 혼합 수를 bioinks/세포 현 탁 액의 농도 조정 해야 합니다, 적절 한 혼합을 통해 희석 후 되도록 최종 농도 아직도 얻을 수 있다.

다른 혼합 기술에 비해 수동 혼합 단위 bioinks cellularize에 대 한 새로운 접근 이다. 혼합, 또는 주걱 또는 다른 도구와 함께 감동 듀얼 주사기 같은 다른 혼합 기술, 달리 수동 혼합 단위 배치 및 사용자가 혼합에 더 일관성을 수 있습니다. 수동 혼합 기법, 주걱 혼합, 등의 자연의 혼합의 속도에 더 큰 사용자-사용자 변화에 발생합니다. 또한, 단위 및 듀얼 주사기 혼합 혼합 수동 폐쇄 시스템 매뉴얼 페 트리 접시 또는 튜브에서 혼합에 비해 더 작은 샘플 손실이 있다.

Bioink의 단일 유형 및 1 개 또는 2 개의 세포 유형 모두 조직 아날로그가이 원고에 조작에 의하여 이루어져 있다. 그러나, 다른 세포 유형으로 뚜렷한 bioinks의 영역을 포함 하는 아키텍처의 구성 조직 아날로그의 bioprinting 더 많은 생리 적 조직 구조^{20,21의 제작에 필요한 있을 수 있습니다. 22}. 더 독특한 구성으로 bioinks를 전문화 또는 기능 다양 bioinks 있는 고유한 구성 또는 기능^{23, 창조 하는 함께 기존 bioinks의 여러 종류의 혼합을 통해 생성 될 수 있습니다. 24}. 이 피하 층 또는 bioink 구성^25,26 의 기온 변화도의 개발을 보장 하기 위하여 필요한 수 조직 지역 뼈 연골 피부와 같은 조직 전환 영역에서 특히 중요 한 있을 수 있습니다. 기본 조직²⁷에서 발견이 중요 한 영역입니다. 또한, 혼합 단위 성장 요인 및 bioprinting 이전 bioinks에 morphogens 혼합 활용 될 수 있습니다. 닫힌된 혼합 시스템으로 샘플 손실의 제거는 비싸고 낮은 농도 생리 활성 요소의 사용에 대 한 매력이 어디 샘플 손실 bioprinted 구문 내 그들의 최종 농도 변경에서 될 수 있습니다, 특히 그라디언트 관련 됩니다.

수동이이 연구에 활용 하는 단위를 혼합을 포함 하 여 어떤 혼합 기술로 제한 기계적으로 민감한 세포 유형에 손상의 위험입니다. 예를 들어 같은 줄기 세포를 고립 된 골 또는 태아, 또는 유도 만능 줄기 세포에서 기계적 손상^28,29더 받습니다. 혼합의 행위 셀 혼합 공정에 관련 된 전단 세력 때문에 비정상적인 기계적 스트레스를 부여 하 고 그들은 생존³⁰을 유지 하기 위해 균형 해야 합니다. 기본 섬유 아 세포와이 연구에서 chondrocytes 사용 결과 좋은 생존 (그림 2), 하는 동안 더 많은 연구는 안전 혼합 비율 및 더 민감한 셀 형식에 대 한 비율을 결정 하는 데 필요한. 그때까지, 그 생존 능력을 극대화 하기 위해 꾸준한 느린 속도에서 수행 혼합 것이 좋습니다. 또한,이 연구에서 선택한 셀 밀도 이전 연구¹에 따라 결정 했다. 이 셀 밀도 모든 셀 형식에 적합 하지 않을 수 있습니다.특히, 높은 농도에서 세포를 혼합 세포 생존 능력 및 조직 형성^31,32향상 될 수 있습니다 증가 셀 연락처 발생할 수 있습니다. 비슷한 맥락에서 수동 혼합 단위 셀 spheroids 또는 다른 셀의 집계³³ bioinks로 혼합에 적용할 수 있습니다.

로 제안 하 고 혼합 단위 시스템 수동 점성 bioink으로 빠르게 세포 현 탁 액 혼합이 연구에서 설명. 셀에 기계적 손상에 대 한 위험이 여전히 남아 있다, 그러나 접근 내 단일 연구와 사용자가 더 많은 일관성을 수 있습니다. 이 접근을 이용 하 여 pre-cellularized bioinks 두 연골을 조작 하 여 최대 4 주 동안 배양 되었고 조직 특정 ECM 마커의 시연 아날로그 피부 사용 되었다. 미래 연구는 단위 시스템에서 더 복잡 한 조직 유사 체의 제조에 대 한 표준화 된 bioinks 전문된 bioinks 혼합을 혼합 하는 수동의 활용에 집중할 것 이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
STARTINK Kit	CELLINK	SK0001	Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure
Live/Dead Kit	Life Technologies	L3224	Kit for the analysis of cell viability after mixing
Masson's Trichrome	Sigma Aldrich	HT15-1KT	Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs
Alcian Blue	Sigma Aldrich	B8438-250ML	Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs
INKREDIBLE+ bioprinter	CELLINK	Gen1+	Printer utilized in the study
DMEM with Glutamax	Thermofisher	10566016	Media for culture of the cells
10% fetal bovine serum	Thermofisher	A3160402	Media supplement
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063	Media supplement
live cell imaging solution	thermofisher	A14291DJ	component utilized using live/dead imaging
inverted microscope	Olympus	IX73	microscope utilized
a digital color camera	Olympus	XC10	microscope camera utilized
cellSens imaging software	Olympus	n/a	stock software with the microscope
ImageJ	NIH	n/a	open source image analysis software
GraphPad Prism 7	GraphPad	n/a	software for statistical analysis
Slic3r software (v1.2.9)	Slic3r	n/a	open-source software to convert .stl file to gcode
primary adult human dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	cell source for fibroblasts