מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

Summary

פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.

Abstract

Immunoassays מבוססי חרוז להעסיק אותו עיקרון כמו כריך immunoassays. לכידת חרוזים, אשר יכול להיות מובחן על-ידי גודל ועוצמת קרינה פלואורסצנטית allophycocyanin פנימי (APC), הן מצומדת כדי נוגדנים ספציפיים analyte מסוים. בשלב הבא, פאנל הנבחר של לכידת מוגדר חרוז ערכות מודגרת עם דגימה ביולוגית המכילה analytes יעד ספציפי הנוגדנים לכידת. זיהוי נוגדנים biotinylated קוקטייל נוסף, מה שמוביל להיווצרות לכידת חרוז-analyte-זיהוי נוגדנים כריכים.

לבסוף, streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) נוסף, אשר נקשר biotinylated זיהוי נוגדנים, מתן אות ניאון עוצמות בפרופורציה כמות analyte מאוגד. PE ניאון האות של אזורים ספציפיים analyte חרוזים זה לכמת באמצעות cytometry זרימה, ריכוזי analytes מסוים נקבעים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים ועקומת סטנדרטי המופקים וזמינותו.

בניסוי זה, אנו משתמשים בעכבר T helper ציטוקין פאנל בו זמנית לכמת את הריכוז של מטרות ציטוקין נפרד 13 supernatants תרביות רקמה שנאסף העכבר splenocytes בתרבית בתנאים מופחתים שונים.

Introduction

בתפקיד שלהם כמו מולקולות איתות מסיסים, ציטוקינים מתווכים התהליכים multifactorial ומתואמת במיוחד המפקחים על תגובות חיסוניות המארח. הם באים לידי ביטוי בכל שלבי תהליך דלקתי, מייזום לרזולוציה, ולווסת את רשת באינטראקציה מורכבת הכוללת סינתזה משלהם וזו של קולטנים הסלולר שלהם¹. רשת תקשורת זו היא שכבתית עם המורכבות שהוא מעבר הגומלין סינרגטי או אויבת שעשויים להתקיים בין רכיבים בודדים. אכן, ציטוקינים רבים ידועים לחלוק פונקציות מיותרות או לפחות חופפים באופן חלקי^2,3.

גישות ביולוגיה מערכות משולבות בו זמנית לכמת analytes ציטוקין מרובים כיום מספקים הבנה מקיפה יותר ויותר של cytokinomes ייחודי זה שננהל את תגובות מערכת החיסון שבבסיס המחלה מרובים מדינות^4,5. מדינות אלה מחלות נע בין דלקת כללית סרטן, תנאים נוירו-ניוונית של מחלות לב וכלי דם^6,7,8,9.

רשתות כאלה ציטוקין יכולה להיחקר ביעילות באמצעות LEGENDplex מבוססי חרוז immunoassays. מבחני אלה מבוססים על אותו עיקרון כמו כריך Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה), והשתמש פלורסצנטיות מקודד microspheres עם נוגדנים הלכידה המחוברים covalently פני השטח שלהם. נוגדנים אלה הם ותשמרו על פני שטחים הרבה יותר קטן מאשר אלה הנדרשים על-ידי תבניות אליסה מסורתית. דבר זה מאפשר כזה מבחני להתבצע עם הרבה פחות נפח דגימה, בעוד באותו הזמן הפחתת שאינם ספציפיים מחייב מתן מרובב ניתוח של מספר analytes.

וזמינותו שמתואר פרוטוקול זה מנצל את הטכנולוגיה הזו כדי quantitate עד 13 מטרות בו זמנית. נתונים assay זו יכולה להיות מושגת באמצעות מגוון רחב של זרימה זמין נפוץ cytometers, בניגוד מבחני זמינים אחרים לא דורשת השימוש במכשור ספציפי assay ייעודי. עם קטלוג המתרחב של לוחות analyte מאומתים, מבחני אלה היו בשימוש מספר מחקר ביו-רפואי שוטף פרויקטים^10,11,12,13.

כדי להדגים את נוחות ואת השירות של הפורמט assay, בניסוי זה שאנו משתמשים בעכבר כדי המסייע ציטוקין פאנל כדי quantitate 13 להפריד בין ציטוקינים ריכוזים של תרביות רקמה supernatants המתקבל splenocytes עכבר תרבותי תחת מרובות תנאים מופחתים. בנוסף תרביות רקמה supernatants, וזמינותו זו גם ניתן לבצע באמצעות הדוגמאות סרום או פלסמה.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי המלצות NIH הנכלל במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי IACUC-BioLegend.

איור 1: לסנן צלחת Assay הליך סיכום. הפרוטוקול עבור ביצוע וזמינותו באמצעות מסנן פלטות מיוצג דיאגרמה המתארת assay מפתח רכיבים ושלבים הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. ביולוגי הכנת הדוגמא

הערה: האתר האנטומי שבחרת ואת נפח של איסוף דם נשאר לשיקול דעתו הבלעדי של כל חוקר בודדים, לא ישפיעו על התוצאה של וזמינותו. עם זאת, ברגע שהם מתקבלים, דוגמאות צריך להיות מטופל לפי השלבים המפורטים להלן-

1. הכנה של הדוגמאות סרום
   1. לאסוף את נפח הדם לתוך צינור אוסף המועדף הרצוי ולאפשר להיקרש במשך לפחות 30 דקות
   2. Centrifuge המדגם 10 דקות ב g x 1,000 בטמפרטורת החדר.
   3. להסיר בסרום ואת וזמינותו מיד או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן דגימות-≤-20 ° C.
2. הכנה של דגימות פלסמה
   1. לאסוף האחסון הרצוי של דם באמצעות חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מצופה צינורות איסוף דם.
   2. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 בטמפרטורת החדר בתוך 30 דקות של אוסף.
   3. להסיר פלזמה ואת וזמינותו מיד, או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן דגימות-≤-20 ° C.
3. הכנה של תרביות רקמה Supernatant דגימות
   1. Centrifuge המדגם 10 דקות ב g x 1,500 ב 4 ° C כדי להסיר תאים ופסולת.
   2. לאסוף תגובת שיקוע ואת וזמינותו מיד או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן ב ≤-20 ° C.
4. מפשיר של קפוא דגימות ביולוגיות
   1. לחלוטין להפשיר כל דגימות ביולוגיות בעבר קפואים על קרח, ו מערבולת בקצרה לפני השימוש. להימנע יותר מ- 2 מחזורים ההקפאה/ההפשרה.
      הערה: הדגימות בשימוש פרוטוקול זה התקבלו על ידי culturing splenocytes העכבר BALB/c (1 x 10 ⁶ תאים ב- C ° 37 + 5% CO ₂ בתנאים שונים: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL מצופים צלחת) + αCD28 (1 µg/mL מסיסים), ובחום (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). תרבות supernatants היו שנאספו לאחר 48 שעות ומעובדים כמתואר בסעיף 1.3.

2. הכנה ריאגנט

חרוזים טרום מעורב

1. חרוזים Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized
   1. Sonicate בקבוקים עבור 1 דקות באמבט sonicator בטמפרטורת החדר, ועל מערבולת אז 30 s לפני השימוש. אם אין אמבטיה sonicator זמין, להגדיל את מערבולת הזמן מינימלית 1
2. הכנה של שטיפת מאגר
   1. מאגר שטיפת הבא ה-x 20 (20 x PBS עם 1% Tween-20) מסופק עם הקיט בטמפרטורת החדר, מערבולת להכניס מלחי כל פתרון.
   2. לדלל 25 מ ל 20 x מאגר לשטוף עם יונים 475 מ ל מים. חנות החלק בחיוב בין 2 ° C ל- 8 ° C עד לחודש אחד.
3. הכנה של מטריקס B (עבור שימוש עם סרום, דגימות פלסמה בלבד)
   1. להוסיף mL 5.0 המאגר Assay (PBS עם 1% BSA) כלול בערכה של הבקבוק המכיל lyophilized מטריקס B. אפשר לפחות 15 דקות עבור reconst מלאה itution, ואז מערבולת לערבב היטב. ניתן לאחסן שאריות B מטריצה משוקם ב ≤-70 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד עד.

3. הכנת תקן

הערה: כל analyte בחלונית זו יש ריכוז רגיל העליון של 10,000 pg/mL.

1. 250 להוסיף µL Assay המאגר כדי לשקם את lyophilized העכבר Th ציטוקין סטנדרטי קוקטייל. לערבב על ידי בקצרה vortexing ולאפשר את המבחנה תשב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
2. להעביר את קוקטייל סטנדרטי צינור פוליפרופילן microcentrifuge הנקרא " C7 ". זה ישמש בתור העליון רגיל.
3. תווית 6 צינורות פוליפרופילן microcentrifuge C6, C5, C4, C3, C2 ו C1-
4. µL 75 להוסיף מאגר Assay לכל אחד הצינורות האלה.
µL
5. 25 העברה של C7 סטנדרטי העליון צינור C6 ולערבב היטב על ידי vortexing. . זה יהיה תקן C6.
6. המשך ביצוע טורי דילולים 1:4 על-ידי שימוש pipet החדש של עצה לכל שפופרת להוסיף µL 75 Assay המאגר בצינור הבא הנמוך רגיל ואחריו vortexing 25 µL של תקן הקודם כדי להשיג סטנדרטים C5, C4, C3 , C2 ו C1. שימוש Assay מאגר תקן 0 pg/mL (C0).

4. לטעום דילול

הערה: ניסויים פיילוט ראשוני שימוש assay הזה עם דילולים רבים העשויים להידרש כדי לקבוע את הגורם דילול המתאים ביותר עבור מסוימת של דגימות ביולוגיות. גורם לדילול ראוי יהיה לייצר ריכוז שהחישובים המדגם שנמצאים בתוך גבולות של העקומה סטנדרטי. השלבים הבאים נועדו כהנחיות, ייתכן שיקבע מדעית בהתאם לסוג דגימה.

1. Dilute סרום או פלזמה דוגמאות קיפול כפול עם מאגר Assay (למשל-לדלל 50 µL מדגם עם 50 µL Assay המאגר) צינורות פוליפרופילן microcentrifuge.
   הערה: אם עוד יותר מדגם דילול נדרשת, דילולים צריך להיעשות עם מטריקס B במקום assay המאגר כדי להבטיח מדידה מדויקת. הוספת הדוגמאות סרום או פלזמה ללא דילול תגרום דיוק וזמינותו נמוכה, עלול לסתום את הצלחת מסנן. מטריקס B מורכב סרום העכבר במאגר של מטרות assay אנדוגני. הוא שימש דגימת נסיוב או פלסמה diluent כדי למנוע תופעות מטריקס, אשר ידועים משפיעים על רגישות אנליטית immunoassays.
2. מבחן תא דגימות supernatant תרבות ללא דילול.
   הערה: הרמות של analyte יכול להשתנות במידה רבה מן הדגימה כדי מדגם. במידת הצורך, לדלל דגימות supernatant באמצעות הכנה טרי בינוני התרבות התא המתאים או מאגר Assay שלהם.

5. Assay הליך

הערה: וזמינותו יכול להתבצע לוחות פוליפרופילן לסנן, מיקרו FACS צינורות או microplates V-התחתון. ההליך assay מסנן צלחת מומלץ בשל טוב הדגימה כדי מדגם עקביות assay חוסן, קלות הטיפול. הליך זה דורש יחידת סינון ואקום לרחצה (שסופק על-ידי משתמש הקצה).

1. לאפשר ריאגנטים כל לחמם לטמפרטורת החדר (20-25 ° C) לפני השימוש.
2. סט הלוחית מסנן כיסוי הפוכה בכל עת במהלך השלבים הדגירה וההתקנה assay, כך התחתון של הלוח אינו נוגע כל המשטחים שכן היא עלולה לגרום דולף.
3. לקחת את הצלחת זקוף במהלך ההליך assay כולו, כולל את השלבים כביסה, כדי להימנע מאובדן חרוזים.
4. לקחת את הצלחת כהה או עטוף ברדיד אלומיניום עבור כל שלבי הדגירה.
5. לרוץ כל הסטנדרטים ודוגמאות ככפילות, מסודרים בצלחת סדר רציפים.
6. מראש להרטיב את הצלחת מסנן על-ידי הוספת µL 100 1 x מאגר לשטוף כל טוב ולתת לו לשבת 1 דקות בטמפרטורת החדר (אם משתמשים microplate מסנן המדרגה).
7. הסר מאגר אמצעי אחסון על-ידי שימוש של יריעה ואקום (5-10 s). לא יעלה על 10 " Hg של ואקום. שטיפת עודפי חשופה מאגר מהחלק התחתון של הלוח על ידי לחיצה על הצלחת על ערימת מגבות נייר נקי. מקם את הצלחת על גבי העטיפה צלחת הפוכה.
   הערה: השלבים 5.1-5.2 עשוי להיות מושמט אם מבצע את הבדיקה באמצעות של צינורות FACS V-התחתון microplate או מיקרו-
8. עבור דגימות supernatant התרבות תאים, להוסיף 25 µL Assay מאגר כל בארות. להוסיף 25 µL ברמה כל הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL של כל מדגם הבארות דגימה.
9. למדידת הדוגמאות סרום או פלסמה, להוסיף 25 µL של מטריצה B הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL Assay מאגר הבארות הדגימה. להוסיף 25 µL ברמה כל הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL של כל סרום מדולל או פלאזמה מדגם הבארות דגימה.
10. מערבולת מיקס חרוזי 30-ס' 25 להוסיף µL של חרוזים מעורב כדי כל טוב, רועד חרוז בקבוק לסירוגין כדי להימנע חרוז ליישוב. עוצמת הקול הסופי צריך להיות µL 75 כל היטב לאחר התוספת של חרוזים.
11. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום. מניחים את הצלחת על צלחת מטרף, לאבטח, ללחוץ על 500 סל ד עבור 2 h בטמפרטורת החדר. כדי למנוע דליפה, אינן חלות על לחץ אוויר חיובי חותם צלחת-
12. ללא היפוך, למקם את הצלחת יריעה ואקום, חלים ואקום כמו קודם ולהוסיף µL 200 1 x שטיפת מאגר כל טוב.
13. להסיר את התוכן של הבארות צלחת assay על ידי סינון ואקום. כתם שטיפת עודפי מאגר מתחתית לצלחת עם רכיב pad סופג או מגבות נייר. חזור על שלב זה עוד פעם אחת.
    הערה: אם וזמינותו מתבצע באמצעות FACS microplate או מיקרו של V-התחתון צינורות דלג על שלבים 5.12 ו 5.13. במקום centrifuge את הצלחת-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן תסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
14. להוסיף 25 µL של נוגדנים זיהוי (ראה טבלה של החומרים) כל טוב.
15. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת טריים. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום-
16. למקם את הצלחת על צלחת מטרף וללחוץ על 500 סל ד לשעה בטמפרטורת החדר.
17. בלי לשאוב, להוסיף 25 µL של SA-PE ריאגנט ישירות אל כל טוב. ללא דילול של ריאגנט הכרחי.
18. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת טריים. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום-
19. למקם את הצלחת על צלחת מטרף וללחוץ על 500 סל ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
20. חזור על שלב 5.13 הנ ל.
21. µL להוסיף 200 1 x שטיפת מאגר לכל טוב. מחדש להשעות את החרוזים על מטרף צלחת עבור מינימלית 1
22. משתמש של pipet רב-ערוצי, להעביר דגימות מהצלחת מסנן FACS צינורות כדי לקרוא דוגמאות על cytometer זרימה.
    הערה: נפח דגימה עשוי להיות עלה מ 200 µL ל 300 µL על-ידי הוספת של µL 100 תוספת של 1 x מאגר לשטוף כל שפופרת כדי למנוע את הדגימה מוסיף להתייבש. אם ניתן לאחסן דגימות הכרחי 4 ° C מוגן מפני אור וניתח ביום המחרת. עם זאת, אחסון מדגם ממושך יכול להוביל אות מופחת.

6. זרימה Cytometer הגדרת

הערה: על מנת להפיק נתונים אמין, cytometer זרימת חובה להגדיר אותה כהלכה לפני רכישת נתונים. תהליך זה ישתנו עבור משתמשים בודדים מסוימים בנוגע בהתאם לתצורת של המכשיר המסוים שוזמינותו מבוצעת על. תהליך ההתקנה מוכללת cytometer מסוגל למדוד PE ו- APC ומצוידים עם שניהם 488, 633 ננומטר לייזר נדונה להלן.

1. הפעלת זרימת cytometer והשגה של התוכנה על פי היצרן ' s ההוראות שסופקו עם המכשיר-
2. צור מגרש נקודה FSC (פיזור קדימה) על ה-x וציר האס (לצד פיזור) עבור ציר ה-y. הגדרת FSC ואת האס למצב לינארי.
3. ליצור מגרש נקודה שנייה עם PE על ציר x ו APC עבור ציר ה-y. זו עלילה להגדיר מצב תצוגה מבוסס יומן.
4. מערבולת הבקבוקון של חרוזים raw הכלולות בערכה ל 30 s מחדש להשעות את החרוזים. אלה חרוזים מכילים צבע פנימי של APC, מורכבות של שתי האוכלוסיות גודל.
5. µL 400 העברה של חרוזים raw ל צינור FACS.
6. להגדיר קצב הזרימה cytometer זרימה נמוכה.
7. להפעיל את החרוזים raw, בזהירות התאמת מתח ורווח FSC, האס כך שתי האוכלוסיות בגודל של חרוזים אלה הם נפרדו בעליל, קל לשער.
8. להתאים את הסף FSC כדי לא לכלול אירועים לא רצויים (כלומר פסולת או אוויר בועות).
9. מגרש ב- FSC לעומת האס, לצייר שער הכולל כל האוכלוסיות חרוז.
   הערה: החרוזים raw מכילים שתי האוכלוסיות גודל חרוזים, והקטן יותר " חרוזים " וגדול יותר " B חרוז " אזורים.
10. להציג את אוכלוסיות חרוז מגודרת מן העלילה FSC לעומת האס על המגרש נקודה שנייה עם PE על ציר x ו APC עבור ציר ה-y.
11. להתאים את המתח PMT עבור הערוץ פלורסצנטיות APC כך האות APC עבור כל חרוז אוכלוסיות יש של עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) שנמצאת בין עונה 1 פרק 10 ¹ ו- 5 x 10 ³.
12. מערבולת הבקבוקון של PE ההתקנה חרוזים ב-30 s מחדש להשעות את החרוזים.
13. µL 400 העברה של PE חרוזים על צינור FACS.
14. החלף החרוזים raw צינור מ- cytometer זרימה עם PE חרוזים שפופרת.
15. כוון את המתח צינור (PMT) האופטיקה PE פלורסצנטיות ערוץ בהגדרות כך MFI של חרוזים PE נופל בין הטווח ספציפיים רבים מצאו רשום על המבחנה חרוזים PE.
    הערה: החרוזים ההתקנה PE להכיל חרוזים של גודל האוכלוסייה אחת (" חרוזים " בלבד).

7. חדרי קירור והקפאה

הערה: ההליכים המדויק המשויך רכישת נתונים על מכשיר מסוים יכול להשתנות, תלויים cytometer ' s תצורה מפרטים, ממשק התוכנה ששימשה. ההוראות הבאות נועדו ולכן לסמן את הפעולות הנדרשות מהסוגיא בחולין וזמינותו ללא קשר cytometer המועסקים וזמינותו.

1. לאמת קצב הזרימה cytometer עדיין מוגדר לנמוך.
2. להגדיר את מספר האירועים חרוז כדי לרכוש עד כ 300 לכל analyte. עבור 13-plex לוח זה משווה להשגת 3,900 אירועים בשילוב של שתי האוכלוסיות גודל חרוז (A + B חרוזים).
3. מערבולת כל דגימה עבור 5 s לפני ניתוח.
דוגמאות
4. לקריאה. בעת קריאת דגימות, להגדיר את cytometer זרימה במצב התקנה קודם ולחכות עד חרוז האוכלוסייה התייצב לפני המעבר למצב רכישת.
5. להשתמש בשמות פשוטים עם מספור רציף עבור קבצי נתונים כדי להקל על ניתוח נתונים.
6. לייצא רק את האירועים מגודרת (A + B חרוז אזורים) במקום אירועים סה כ.
7. לאחסן כל FCS הקבצים באותה תיקיה עבור כל וזמינותו. אם הפעלת מבחני מרובים, ליצור תיקייה נפרדת עבור כל assay.

< p class= "jove_title" > 8. המשך ניתוח נתונים

הערה: FCS הקבצים שנוצרו ב- cytometer הזרימה צריך להיות מנותח באמצעות תוכנת ניתוח של נתונים, אשר ניתן להוריד בחינם ¹⁴.

1. להתקין את תוכנת ניתוח נתונים ב- PC-
2. להעביר את כל הקבצים assay FCS למחשב שמכיל את תוכנת ניתוח.
3. לחבר את הדונגל מפתח רשיון (כלול בערכה) ליציאת USB של המחשב.
4. להפעיל את תוכנת ניתוח נתונים.
5. לחץ על הכחול " הוסף קבצים " הכפתור ממוקם בחלק העליון של המסך.
6. נווט אל התיקיה שמכילה את הקבצים FCS וזמינותו ב מוקצפים חלון שמופיע.
7. לחץ, גרור כל הקבצים assay FCS למעלה חלון פופ כדי להציג את תוכנה. כל הקבצים עכשיו אמור להופיע ברשימה.
8. לחץ הירוק " הבאה " הלחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה. שמאל לחץ והחזק כדי לגרור הקטן עיקול רגיל כחול כפתורים (C7 ל C0) לקבצים שלהם-FCS המתאימה מתוך הרשימה כדי להגדיר את עקומת סטנדרטי.
9. לחץ הירוק " הבאה " הלחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה כדי לפתוח חסימה למעלה חלון פופ-
10. בצד שמאל של החלון המגביל הזן את השמות של שני ה-A ו- B חרוז אזורים assay מטרות analyte ומזהה חרוז המשויך שלהם (נמצא במדריך המצורף וזמינותו) עולה.
11. בחרו בכלי המגביל מהחלק העליון של למעלה חלון פופ ולהשתמש בו כדי לצייר 2 שערים בהמשך העלילה FSC לעומת האס, בסביבה החרוזים A אחת, שנייה סביב החרוזים B.
12. לסקור את APC לעומת PE פיזור מתווה המופיעים להלן העלילה FSC לעומת האס המופיעות. יהיו להקות analyte 6 ב החרוזים A (מגרש השמאלי) ולהקות analyte 7 ב החרוזים B (נכון עלילה).
    הערה: השערים עלול לצייר באופן ידני על-ידי בחירת הכלי מחק בראש ולחיצה כדי למחוק נתון שער. הכלי המגביל ייתכן ואז נבחר ויש להשתמש כדי להחיל באופן ידני שער האזור הרצוי הלהקה.
13. לחץ הירוק " אישור " כפתור כדי לסגור למעלה חלון פופ המגביל ולחזור לרשימת הקבצים FCS.
14. להגדיר כל דילולים שנעשו על דגימות ביולוגיות בזכות לחיצה על קובץ נתון, בחירת " דילול לקפל " מן התפריט, והוא קלט הערך הנכון.
15. לחץ הירוק " לרוץ " לחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה כדי להפיק את עקומות סטנדרטי עבור וזמינותו ולחשב את ריכוזי דגימות ביולוגיות לא ידוע.

תוצאות

פרוטוקול זה מדגים איך פלטפורמה מבוססת-חרוז מתכלה יכול לשמש בו זמנית quantitate ציטוקין פרופילים של דגימות ביולוגיות באמצעות cytometer של זרימה. הדגימות הביולוגיים בשימוש בדוגמה זו היו תא supernatants התרבות של splenocytes העכבר זה היה בעבר מודגרות בתנאים הפעלת שונים, למרות התבנית assay אומתה גם לשימוש עם הדוגמאות סרום או פלסמה.

הנתונים המופקים וזמינותו משמשים לבניית עקומות סטנדרטי עבור כל analytes מרובבת בלוח. התוכנה ניתוח נתונים מסווג את כל analyte מסוים בהתבסס על גודל חרוז ייחודי APC בעוצמה, מכמת אותם באמצעות כתב PE. טווחים דינאמיים, כמו גם את רגישות וזמינותו מודגמות כאשר המותוות בקנה מידה יומן-יומן איור2 א. התוכנה משתמשת בנתונים assay וסיפק באלגוריתם התאמה 5-פרמטר עקומה כדי לחשב במדויק לא רק את ריכוזי analytes המשתמש דגימות ביולוגיות, אלא גם את הגבולות של זיהוי הן גבוהות ונמוכות בסוף כל רגיל עקומות (טבלה 1 ). התבנית שמתואר פרוטוקול זה מספק גם דיוק assay חזקה מאוד. איור 2B ו 2 ג נתונים מוצגים המתארים את ההשתנות אינטרה-וזמינותו של כל analyte. שני ריכוזים חלבון תקן נפרד (גבוה ונמוך) נותחו ב assay אחד עם משכפל 16 עבור כל דגימה. איור 2C ו- 2D לייצג ההשתנות הבין-וזמינותו של היעד analytes בין שלושת מבחני עצמאית. כמו עם הניסויים דיוק אינטרה-assay, גבוה ונמוך ריכוזים סטנדרטי נותחו עם 3 משכפל בכל אחד מן הניסויים עצמאית. השתנות מינימלי ירידה בריכוז מחושב של חלבונים היעד ברור לחלוטין

כדי להדגים את התועלת של מבחני cytometric מבוססי חרוז בחקירתו של פרופילי ביטוי ציטוקינים, העכבר splenocytes היו מודגרות בתנאים הפעלת שונים. בנוסף פקד unstimulated, התאים היו מתפשט גם עם התקליטים, נוגדנים anti-CD3/אנטי-CD28, או phorbol פעילים-12 13-אצטט ionomycin. תא תרבות supernatants נאספו 48 שעות מאוחר יותר, לבדיקה באמצעות לוח ציטוקין העוזר של העכבר כדי. כמת תוצאות ניסוי זה מוצגים באיור 3, והוא תחום בבירור ההשפעה של גירוי תנאים על ריכוזי ציטוקין.

הממצאים המתוארים לעיל אופייניות, כל עוד הנסיין יש מעבדה טכניקה כדלקמן פרוטוקול assay שסופקו. מקורות של שגיאה בתבנית זו assay יכול להיווצר סטיות בתקופות דגירה, ריאגנט כרכים, הכביסה, או הגדרות PMT ב cytometer זרימה להשתמש בה כדי לנתח את הדגימות. איור 4A פיזור מגרש מ assay מוצלחת מראה 2 אוכלוסיות נפרדות חרוז מוגדרים בבירור. זה יכול בניגוד ל 4B איור, שבו הדבקות כביסה ופרוטוקול המסכן הובילו אגרגטים חרוז אשר לטשטש שתי האוכלוסיות. בנוסף, כפי שמעידים ההריסות ברביע השמאלי התחתון, cytometer הכולל אירועים יוצאו עבור ניתוח במקום התבנית המועדפת מגודרת אירועים בלבד. Cytometer ראוי להגדיר חיוני להפקת נתונים אמינים ב assay הזה. ב- PMT המתאים באיור 4C לאפשר הגדרות הרזולוציה של כל אחד analytes 6 בערוץ סיווג APC. הגדרות PMT תגרום לנתונים הדומה לזה המוצג בתוך 4D איור שבו התעלה APC יש חרוז אוכלוסיות בעלות עוצמות סיווג חופפים. זה יהפוך וזמינותו מאז זה יהיה בלתי אפשרי לחשב ריכוזים analyte ללא אוכלוסיות ברורה של חרוזים וזמינותו.

איור 2: תקן עקומת טווחים ודיוק Assay. (א) עיקול רגיל נציג שנוצר על ידי שימוש בלוח ציטוקין המסייע בעכבר כדי. יש להפעיל עיקול רגיל עם כל וזמינותו. (בג) אינטרה-assay דיוק. שתי דגימות עם ריכוזים שונים של חלבונים היעד (גבוה ונמוך) נותחו ב assay אחד עם משכפל 16 עבור כל דגימה. הנתונים מיוצגים אומר + סטיית תקן. (D-E) דיוק assay אינטר. שתי דגימות עם ריכוזים שונים של חלבונים היעד (גבוה ונמוך) נותחו ב שלושה מבחני עצמאית עם משכפל 3 עבור כל דגימה. הנתונים מיוצגים אומר + סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: כימות של נציג תוצאות. עכבר splenocytes (1 x 10⁶ תאים) היו תרבותי ב- C ° 37 + 5% CO₂ בתנאים שונים: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL מצופים צלחת) + αCD28 (1 µg/mL מסיסים), ובחום (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). תרבות supernatants היו שנאספו לאחר 48 שעות ואז לכמת באמצעות לוח ציטוקין העוזר של העכבר כדי. פרופילי ביטוי ציטוקינים דיפרנציאלית בתגובה לגירוי התנאים הם נראים בבירור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: נובעת מוצלחת לעומת מבחני כושל. (א) מבחני מוצלח יהיה אוכלוסיות חרוז נפרדות עבור האוכלוסיות ננו-ספירה. (B) מבחני כושל תהיה הפרדה אוכלוסייה ענייה, חרוז, אגרגטים מדי האירועים שנאספו. (ג) מבחני מוצלח יש מוגדרים בבירור עוצמות בערוץ קרינה פלואורסצנטית מיון אשר קל שער ולכמת. (ד) מבחני לא מוצלח גרוע הפרידו בעוצמות סיווג אשר חופפים מספר אוכלוסיות חרוז, מקשה על כימות. הרבה שגיאות אלה ניתן למנוע דרך הדבקות זהיר פרוטוקול וזמינותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

	עיקול רגיל			רגישות (pg/mL)
Analyte	הנוסחה בכושר	קורות חיים	R2	Min.	. מקס.
IFN-Γ	5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)	1.77%	0.99	2.1	18105.0
IL-5	5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)	1.32%	1	1.9	14514.0
TNF-Α	5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)	1.48%	0.99	1.9	20109.0
IL-2	5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)	1.34%	1	1.9	25109.0
IL-6	5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)

td>1.70% 0.99 2.0 7022.0 IL-4 5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36) 1.36% 1 2.0 13273.0 IL-10 5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61) 1.81% 0.99 2.2 5190.0 IL-9 5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45) 1.82% 1 1.9 12602.0 IL-17A 5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32) 0.99% 1 2.0 12285.0 IL-17F 5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34) 0.92% 1 2.0 14841.0 IL-21 5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11) 0.79% 1 9.0 12943.0 IL-22 5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39) 1.16% 1 2.0 6408.0 IL-13 5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45) 1.11% 1 2.1 16728.0

טבלה 1: תקן פריסטלטיות ורגישות Assay. התוכנה ניתוח נתונים שימשה ליצירת עקומות סטנדרטי עבור analytes כל הכלול מולטיפלקס וזמינותו. ניתוח ממוחשב זה חל על עיקול 5-פרמטר חזקים הולם האלגוריתם בתקני סדרת דילול מ וזמינותו, ומשמש גם להגדיר רגישות assay באמצעות לגבולות התיאורטיים של זיהוי.

Discussion

התבנית assay שמתואר פרוטוקול זה יכול לספק כימות חזקים של המתווך מסיסים פרופילים בדגימות ביולוגיות שסופקו הנסיין יש מעבדה טכניקה ונדבקת הפרוטוקול המומלץ.

ישנם מספר שלבים מרכזיים שיש לבצע על מנת להבטיח תוצאות אמינות. קודם כל, הסטנדרטים רקומביננטי תתאפשר צריך להשרות במאגר assay במשרה מלאה מומלץ, ואחרי בדילול רק צינורות פוליפרופילן צינורות פוליסטירן יכול לקדם את דבקותה של החלבונים לקיר של הצינורות, אשר יכול להוביל אותות נמוכה בעת יצירת העקומה סטנדרטי. שנית, ראוי רועדת בזמן הדגירה צעדים הוא קריטי. בלי עצבנות נכונה, מאפייני איגוד של חרוזים assay יכול להיות קשות הפריע. בנוסף לכך, הכביסה הנכונה בין השלבים הדגירה נדרש גם. הנסיין לוודא כי עודף ריאגנטים יוסרו מן הבארות לפני התחלת השלב בפרוטוקול. חייב להיות מוטבת מכשירים הגדרות עבור cytometer זרימה המשמש לחקור את החרוזים assay גם כן. בפרט, PMT הגדרות התוקף שתישמר כדי להבטיח הפרדה נאותה חרוז וטווחים דינמי רחב על העיקולים סטנדרטי. סוף סוף, רגע לפני שעוברים ניתוח על cytometer, חרוזים חייב להיות vortexed כדי להבטיח הבולם תקין וכדי למנוע היווצרות של אגרגטים אשר יכול להטות את תוצאות.

פרוטוקול זה פוטנציאלי יכול להיות שונה כדי לנתח רקמת homogenates, כמו גם את סוגי דגימה שנדונו בכתב היד, בתנאי החוקר הוא מוכן למטב את פרוטוקול פירוק שלהם לפני ביצוע מבחני צלחת גדולה, מלאה. הטכניקה בפועל כמובן משתנה בהתאם לסוג הרקמה; אולם, באופן כללי הפרוטוקול צריך להשתמש מאגר ה-pH נייטרלי המכיל פיזיולוגיים ריכוזי מלחים יוניים, ללא חומרים כימיים denaturing, רצוי ללא חומרי ניקוי. אם מה שהוא עושה חייב לשמש, יש לשמור ריכוזים דטרגנט ללא יונית לכל הפחות (למשל לא יותר מ 1%). המאגר צריך להכיל גם מעכבי פרוטאז מספיקות כדי למנוע השפלה הפרוטאוליטי של חלבונים היעד. ללא קשר פרוטוקול פירוק שמשמש, כדאי centrifuged את ההכנות האחרונות להסיר את החלקיקים לפני ניתוח.

בנוגע למגבלות assay, ריכוזי analyte מטרות סוגי דגימה ביולוגית יכול להשתנות במידה רבה. על מנת לכמת כראוי analyte ריכוזים, הם חייב ליפול בתוך הערכים העליונים והתחתונים עבור העקומה סטנדרטי. אקסטרפולציה של ערכים של העקומה אינה בהכרח אמין ואני לא ממליצה. החוקרים ולכן חייב למטב דילולים שלהם דגימות מסוימת בניסויים פיילוט לפני הפעלת וזמינותו של פלייט-מלא. בנוסף, הכנת דגימות ביולוגיות. זהירות כדי להיות לבדיקה הוא בעל חשיבות עליונה להצלחה של פורמט זה וזמינותו. דוגמאות הן lipemic, hemolyzed או מכילים חלבון פסולת להשפיע את האינטראקציות נוגדן אנטיגן המגדירים לעקרון הליבה של זה מתכלה, רינדור לתוצאות uninterpretable.

זה וזמינותו היא משמעותית ביחס שיטות קיימות כימות מכמה סיבות. מתי יפעל כראוי, התבנית assay יכול quantitate analytes עד 13 מתוך מדגם שימוש באמצעי אחסון עד כה קטנים יותר יידרשו כדי לנתח את הדגימה באמצעות מבחני אליסה מסורתי. תבנית זו assay גם אינו דורש מכשור ייעודי על מנת לבצעו. זהו יתרון לעומת אחרים immunoassays מבוססי חרוז זמינים מסחרית כמו וזמינותו ניתן להפעיל באמצעות מספר כלשהו של זרימה נפוץ cytometers.

חקירה מדעית התפקיד שיחק על ידי גורמים מופרשים ציטוקינים רשתות בריאות, מחלות מתרחב. התבנית assay תיאר כתב יד זה יכול להיות כלי רב ערך עבור חוקרים המבקשים להכיר את התופעות רבת ומורכבים. תוכניות מחקר ביו פעיל מתחילים לחקור את התפקיד של ציטוקין רשתות לא רק אזורים כגון מוכללת דלקת⁶, אלא גם בתוך ההקשר של מצבי מחלה ספציפית כגון טרשת עורקים, סרטן, neuroinflammation ^1516,,17. אין ספק, החקירה ימשיכו לגדול באזורים אלה מתרחב החיפוש אחר הריפוי לטפל אלה מצבים כרוניים. הצורך כימות מדויק ואמין של המתווכים מסיסים הקשורים עם מחלות אלו יישארו עדיפות מחקר ביקורתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor	Beckman Coulter	366816	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel	BioLegend	740005	Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format
Anti-mouse CD28 antibody	BioLegend	102112	Clone 37.51, low endotoxin, azide free format
Vacuum Pump	EMD Millipore	WP6111560	For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Vacuum Manifold	EMD Millipore	MSVMHTS00	For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Sterile Disposable Reagent Reservoirs	Fisher Scientific	07-200-130	Or equivalent
Polypropylene MicroFACS Tubes	Fisher Scientific	11-842-90	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
Pipette Kit	Fisher Scientific	14-388-100	Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL)
Multi-Channel Pipette	Fisher Scientific	FA10011G	capable of dispensing 5 μL to 200 μL
Microplate Shaker	Fisher Scientific	88880023	Or equivalent
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75002410	Or equivalent
FACS tubes	Fisher Scientific	NC9885747	12 x 75 mm round bottom
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Branson B200 Ultrasonic Cleaner	Sigma-Aldrich	Z305359	Or equivalent
Microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505	1.5 mL polypropylene tubes
Flow Cytometer	Various	Various	Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm
96-Well Polypropylene Plate	VWR	82050-662	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)