JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.

Abstract

הקפסולה רב-סוכר של קריפטוקוקוס neoformans היא הגורם העיקרי התקפה אלימה ולמד ביותר בדרך כלל ההיבטים של שמרים החולני הזה. גודל קפסולה יכולה להשתנות בין זנים, יש את היכולת לצמוח במהירות כאשר הציג בפני תנאים מזין מלחיץ או נמוך, יש כבר בקורלציה חיובית עם זן התקפה אלימה. מסיבות אלו, הגודל של הקפסולה הוא עניין רב לחוקרים neoformans ג . הצמיחה של הקפסולה ג neoformans הנגרמת במהלך הבדיקה פנוטיפי כדי לעזור להבין את ההשפעות של טיפולים שונים על שמרים או גודל ההבדלים בין זנים. כאן נתאר באחת השיטות סטנדרטי של קפסולה אינדוקציה והשווה שני המקובלים שיטות של צביעת ומדידת קוטר קפסולה: אינדיה אינק (i), כתם שלילי, בשימוש יחד עם מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו (ii) שיתוף מכתים עם צבעי פלורסנט הן של דופן התא והן את הקפסולה ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו מראים איך מדידה של קוטר קפסולה מדגימות שהוכתמו אינדיה אינק יכול להיות אוטומטי באמצעות ניתוח תמונות חישובית.

Introduction

משפיע על רבע מיליון אנשים כל שנה, וכתוצאה מכך 180,000 יותר מקרי מוות מדי שנה, קריפטוקוקוס neoformans הוא שמרים פתוגניים, תאיים, סוכן סיבתי של cryptococcosis1,2, 3. שנפגעו הם חולי HIV-חיוביות במדינות עניות שאין להם גישה מוכן לטיפול תרופתי, עושים אותם רגישים בחריפות המחלה4,5,6. נתוני ה-CDC מציינים כי ב אפריקה שמדרום לסהרה, neoformans ג הורג יותר אנשים שחפת מדי שנה, יותר מדי חודש יותר מכל התפרצות אבולה רשומה1. תוואי החשיפה השכיחה ביותר מתרחשת משאיפת נבגים מיובש השגורה הסביבה7. עם כניסתו אל הריאות, ישנם מספר גורמים התקפה אלימה אשר תורמים להצלחת neoformans ג בתוך אנשים נגועים. הקפסולה רב-סוכר נחשבת הגורם של החיידק העיקרי התקפה אלימה, כמו זנים acapsular אינן מידבק8.

הקפסולה cryptococcal מורכבת של שלושה מרכיבים עיקרון: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), ו- mannoproteins (MPs)9. בעוד MPs הם קלים יחסית רכיב הקשורים דופן התא של הקפסולה, הם immunogenic, יכול לקדם מענה בעיקר פרו דלקתיים9,10. לעומת זאת, GXM ו GalXM לעשות את החלק הארי של הקפסולה (> 90% לפי משקל) ויש תופעות לדיכוי המערכת החיסונית11. בנוסף השפעותיו immunomodulatory, הגדלה מהירה של ה קפסולה ויוו יוצר מחסום מכני בליעה על ידי המארח תאים phagocytic (קרי, נויטרופילים ומקרופגים)12. הקפסולה neoformans ג ו הסינתזה שלו הם מורכבים, אבל באופן כללי, הגדלת קוטר קפסולה הוא מתואם עם התקפה אלימה מוגברת6,13,14. נתון זה, חשוב לחוקרים neoformans ג שניתן יהיה במהירות ובדייקנות לכמת מדידות כמוסה.

תא neoformans ג והן כמוסה רב-סוכר שלה הם מבנים דינמיים ולהראות שינויים לאורך זמן15. הקפסולה יכול שינוי צפיפות, בגודל הרכבה בתגובה לשינויים17,1816,סביבת המחשב המארח. ברזל נמוך או רמות מזין, חשיפה סרום, ה-pH אנושי פיזיולוגי ו CO מוגבר2 ידועים ליזום צמיחה קפסולה16,18,19,20. יתרה מזאת, חוקרים יש הראו שינויים מבניים וכתוצאה מכך הבדלים משמעותיים immunoreactivity במהלך זיהום, ההלוואות יתרון כדי neoformans ג על המארח שלו21,22. דבר זה ידוע כי הארכיטקטורה של הקפסולה neoformans ג נותחה במגוון דרכים. מיקרוסקופ אלקטרונים, לדוגמה, חשפה כי הקפסולה יש מטריצה הטרוגנית עם שכבת צפיפות אלקטרונים הפנימית מתחת לשכבה החיצונית, יותר חדיר23. פיזור אור ושימוש של מלקחיים אופטיים אפשרו החוקרים להבהיר עוד יותר את מאפייני macromolecular24. ניתוח התוצאות של שתי מדידות פיזור אור סטטיים ודינמיים, אנו יודעים כי הקפסולה רב-סוכר יש מורכבות מסעף מבנה23. מלקחיים אופטיים שימשו כדי לבחון את הנוקשות של המבנה, כמו גם להעריך את תגובתיות של נוגדן24. אולם, ניתוח מועסקים לעיתים קרובות ביותר של הקפסולה neoformans ג הוא מידת גודלו.

כדי לכמת את גודל קפסולה, חוקרים משתמשים מה צריך להיות מדידה פשוטה: הקוטר ליניארי של הקפסולה. מיקרוסקופ דיגיטלי משמשים כדי ללכוד תמונות של neoformans ג מספר תאים (בדרך כלל מאות) צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט. הגודל של כל תא בגוף, כמוסה שמסביב נמדד. הנתונים נאספים, קוטר ממוצע של הקפסולה מחושבת על-ידי חיסור הקוטר לגוף התא של הקוטר התא כולו (תאי גוף + כמוסה). עד לנקודה זו, מדידות אלה נעשו באופן ידני. בעוד בדרך כלל מדויק, בשיטה זו יש חסרונות לחוקרים. ערכות נתונים גדולות יכול לקחת ימים או אפילו שבועות כדי לנתח באופן ידני. כי מדידות אלה נעשים באופן ידני, סובייקטיביות, טעות אנוש משפיעה על התוצאה.

ניתוח אוטומטיות תמונות חישובית הפך כלי הכרחי עבור חוקרים בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית של התא, המאפשר ניתוח מהיר ואמין יותר של תמונות ביולוגי 25,26,27. טכניקות ניתוח תמונה מדויקת יש צורך לכרות כמותיים של מה הם לעיתים קרובות ערכות נתונים מורכב ועמוק. עם זאת, כמה מדידות, במיוחד את המדידה של הקפסולה ג neoformans , היה קשה להפוך לאוטומטי. זיהוי במדויק את הממשק בין התא לבין קפסולה, אשר בדרך כלל מופיע כעיגול כהה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, יכול להיות בעייתי לפתור באמצעות סף פשוטה. יתרה מזו, neoformans ג תאים בתרבות נוטים להתאחד ואת פילוח מדויק של התאים הוא הכרחי עבור מדידות מדויקות.

מטרת הפרויקט היתה להמחשת (i) אחד מהפרוטוקולים סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג, (ii) השוואה וחדות אינדיה אינק ולפתח פלורסצנטיות צביעת דגים קפסולת מידות קוטר, (iii) פשוט, שיטות למדידת קוטר הקפסולה באמצעות תמונות של הודו דיו צבעונית תאים באמצעות ניתוח תמונה של התוכנה, ו, (iv) להעריך על יתרונותיה וחסרונותיה של מדידת קוטר קפסולה באופן ידני באמצעות תוכנה אוטומציה. לנו למצוא את זה אחת מהשיטות מכתימים שני, פלורסנט תיוג של דופן התא, כמוסה, בעוד אורכת זמן רב, סיפק את התוצאות הכי עקבי בין ניסויים. עם זאת, שתי השיטות אפשרו לנו להבחין בהצלחה בין מעבדה קלינית neoformans ג זנים מפגין אחר קפסולת גדלים. יתר על כן, הצלחנו להפוך לאוטומטי את המדידה של קוטר קפסולה של הודו דיו צבעונית תמונות גיליתי שזו אלטרנטיבה מעשית מדידה ידנית של הקפסולה.

Protocol

הערה: neoformans ג . חיידק אבטחה ברמה 2 (BSL-2), בעובדים לזה לנקוט אמצעי זהירות נאותה. נהלים מפורטים על איך כדי בבטחה בעבודה עם פתוגנים BSL-2 ניתן למצוא באתר המרכז לבקרת מחלות של (CDC) באתר, אך חשוב לציין כי כל אדם לבוא במגע עם neoformans ג כראוי בקיצור בטיפול סוכני פתוגניים, רצוי שתלבש המתאים ציוד מגן אישי (PPE), בדרך כלל לטקס או nitrile כפפות. עוד יותר, רוטורים-צנטריפוגות צריך להחתם כדי למנוע חשוד דגימות ונוזלים יש לנקות באופן מיידי באמצעות פתרון של 10% מלבין28.

1. אינדוקציה כמוסה

הערה: כל השלבים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת.

  1. תרבות neoformans ג בשמרים peptone דקסטרוז (YPD) מרק (pH 6.5 + /-0.2), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד שהם נמצאים בשלב של יומן (כ ח 18-36).
  2. צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C, לשטוף שלוש פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS).
  3. השתמש של hemocytometer (או מונה הניתן תא אוטומטית) כדי למנות את התאים resuspend ב 2 x 105 תאים/2 מ ל תקשורתי חיוני מזערי של Dulbecco (DMEM).
  4. כדי לעודד את הקפסולה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 18 h.
    הערה: השילוב של העדר של חומרים מזינים בתקשורת ואת נוכחותם של CO2 מגרה צמיחה כמוסה neoformans ג .
  5. שלאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו (לעיל) והסרה של כל 5-10 µL supernatant. במקביל, לקצור מדגם האו ם המושרה תא המתאימים עבור כל זן שברצונך למדוד. להשתמש כפקדים שלילי.
    הערה: כדורי התא יהיה קטן מאוד, עלול להיות קשה לראות. היה זהיר בעת כ רפה בעברית תגובת שיקוע.
  6. כתם דיו הודו (סעיף 2.1) או צבעי פלורסנט (סעיף 2.2).

2. צביעת

  1. צביעת עם רק אינדיה אינק
    1. כדי להכתים את השמרים עם דיו הודו, resuspend בגדר, תגובת שיקוע הנותרים ולהוסיף 4μL (בערך חצי) של הבולם תא, 4μL של הודו דיו על זכוכית מיקרוסקופ. בעדינות לערבב ולהימנע קצף.
    2. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.
  2. צביעת עם רק צבעי פלורסנט
    1. כתם השמרים עם צבע פלורסנט-resuspend בגדר תא ב- PBS µL 50 עם 1% אלבומין שור (BSA).
    2. דגירה התרבות עם אמצעי אחסון שווה של Calcofluor לבן (CFW) (1 µg/mL), mAb כמוסה 18B7 (ראה טבלה של חומרים) מצומדת כדי AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C שלאחר הדגירה, תשאף תגובת שיקוע.
    4. Resuspend תא גלולה ב- PBS 10 µL עם 1% אלבומין שור (BSA).
    5. פיפטה 8 µL של התא השעיה על זכוכית מיקרוסקופ.
    6. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.
  3. צביעת עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
    1. להשוות יותר ישירות את היעילות של דיו הודו מכתים לזה של צבעי פלורסנט, שיתוף כתם האוכלוסייה באותו תא עם שני סוגים של הכתם. לשם כך, תחילה תדגור תאים עם הקפסולה פלורסנט והן הכתם דופן התא, לפי שלבים 2.2.1 - 2.2.3
    2. בשלב הבא, פיפטה נפחים שווים (4 µL) של תא fluorescently ויטראז'ים ההשעיה, דיות על זכוכית. מערבבים בעדינות.
    3. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לאטום את הקצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.

3. התמונה רכישה/מיקרוסקופ

  1. הדמיה תאים מוכתמים אינדיה אינק.
    1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (100 X הגדלה).
    2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי.
      הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לכל הפחות, כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית). לניסויים אלה, נרכשו תמונות בעומק של 16 סיביות עם פעמים חשיפה ממוטבת כדי למקסם את הניגוד בתמונה תוך מזעור הטשטוש הנגרמת על ידי תנועות קטנות של התאים.
  2. הדמיה תאים צבעונית עם צבעי פלורסנט
    1. כדי דמות בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, פתח המיקרוסקופ תוכנות ליצירת תמונות ובחר המתאימים עירור, פליטה אורכי הגל עבור fluorophores בשימוש (CFW ו AF488 מתרגשים באמצעות 405nm את האורות 488 ננומטר, בהתאמה). לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי.
      הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לפחות כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית).
    3. רוכשים סדרת תמונות z-מחסנית התאים כדי להבטיח כי הקוטר קפסולה המרבי עבור כל תא בתוך שדה נתון מתקבל.
      1. תוכנת שליטה של מיקרוסקופ, לחץ על שורת "z-מחסנית" כדי לפתוח את לוח הבקרה "z-מחסנית", ולאחר מכן בחר באפשרות "ראשון/אחרון" בפינה השמאלית העליונה של החלונית.
      2. השתמש הפקד בסדר-המוקד על המיקרוסקופ להתמקד ברמה שמתחת הרחב של תא יחיד שמרים, הקפסולות עבור כל בתוך שדה הראייה הנוכחי, לחץ על "הגדר הראשונה".
      3. להשתמש בפקד מיקוד פיין להתמקד מעל לנקודת הרחב ביותר של גוף התא באותו התא, של הקפסולה עבור כל התאים בתוך שדה הראייה הנוכחי ולחץ על "קבע אתמול".
      4. לאחר מכן, לחץ על "להתחיל ניסוי" בכרטיסיה "רכישת" לרכוש המחסנית-z עבור המיקום הנוכחי. חזור על התהליך-תפקידים מרובים עד z-אוסף תמונות של מינימום של 50 תאים להיות רכש.
        הערה: לניסויים אלה, חריר קונאפוקלית נקבע ל- 1.0, AU ו- z-סדרות חופפים של 10-20 פרוסות כיסוי 0.7 מיקרומטר נרכשו על המיקומים שנבחרו. AU = יחידת אוורירי.
    4. בשלב הבא, להמיר כל סדרה z-מחסנית לתחזיות העוצמה המקסימלית (MIP) באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה.
      הערה: מיליוני הוראות בשניה פרוייקט העוצמה הגבוהה ביותר-כל המטוס של תמונה מוערמים29. יצירת מיליוני הוראות בשניה מאפשרת לייצר ייצוג דו-ממדי של תמונות התואמות התאים המרבי, קוטר כמוסה בתוך הערימה תלת-ממד שנלכדו.
  3. הדמיה תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
    1. לרכוש תמונות באמצעות widefield (40 X הגדלה) או מיקרוסקופ קונפוקלי (63 X או 100 X הגדלה). עבור תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ widefield מצויידים הבמה מבוקרת מחשב, שמן טבילה אובייקטיבי.
      הערה: המיקרוסקופ בשימוש צריך להיות נשלט באמצעות תוכנת הדמיה של CFW. קרינה פלואורסצנטית נרגש דרך מסנן עירור 340-380 nm, ויש הנפלטים אור שיזוהו דרך מסנן מכשול nm 435-485 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 400 ננומטר. זריחה AF488 יכול להיות שמחים דרך מסנן עירור 465-495 ננומטר, האור הנפלט יכול להתגלות דרך מסנן מכשול nm 515-555 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 505-nm.
    2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי עבור כל שיטת ההגדלה.

4. ידני מדידה של קפסולה

  1. עבור תאים צבעונית עם דיו הודו או כתמים פלורסנט, להשתמש תוכנת המדידה תא כדי באופן ידני למדוד כמוסה ותא קוטר (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, עבור אל 'קובץ' > 'פתח תמונה' > "מדידה" ושימוש הסמן כדי לצייר קו ישר דרך נקודת הרחב ביותר של התא כולו (קוטר סה כ).
  2. לאחר מכן, לחץ שוב על "מידה", לצייר קו ישר דרך הגוף תא (גוף התא קוטר).
    הערה: מדידות הם שנשמר באופן אוטומטי אל התאים.
  3. חזור על תהליך זה עבור כל התאים (מינימום של 50/קבוצה).
  4. כדי לשמור תמונות, ברגע שהם נמדדים, לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" ותן שם את התמונות כראוי.
  5. בחר את הקבצים לאחרונה נמדד, ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני.
  6. לחשב את הקוטר קפסולה הממוצע באמצעות המשוואה: ([קוטר הכולל] - [גוף התא קוטר]).

5. ממוכנות מדידה של קפסולה

הערה: למדידה אוטומטית מוצלחת, להשתמש בתמונות 16 סיביות עם רמה גבוהה של ניגוד, אשר מתמקדים כראוי יחד עם תוכנה ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). כאשר הדמיה neoformans ג למדידה קפסולה, חשוב להתמקד על הטבעת כהה על הגבול בין התא לבין כמוסה. פעולה זו מאפשרת לתוכנה כראוי ניסחו את התא ואת כמוסה.

  1. היפוך וליצור עותק של כל הודו דיו צבעונית תא תמונות בעזרת תוכנה לעריכת תמונות המתאימות (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, לחץ על 'קובץ' > 'פתח' כדי לפתוח הודו דיו צבעונית תמונות ולאחר מכן "לשלוט" + "אני" כדי להפוך את התמונה. לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" כדי לשמור את התמונה ההפוכה.
  2. כדי לייבא המקורי והן הפוך תמונות לתוך התוכנה לחץ על "קובץ" > "רצף לייבא" > "טען תמונה" > "הגדרת רצף (ידנית)" > "מידות (ערוץ)" > "יבא" > "החל".
    הערה: neoformans ג תא וגופי קפסולות ניתן לזהות, רעולי פנים באמצעות אלגוריתמים מסוימים - המכונה 'מתכונים' - המצורף לתוכנה.
  3. להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה לשם זיהוי של מסיכה בגוף התא ולאחר מכן לחץ על "החל". בתמונה ההפוכה, הטבעת כהה את הגבול של התא neoformans ג הופך בהיר יותר הקפסולה שמסביב.
  4. להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה כדי לפלח את הגופות תא neoformans ג מ קפסולות שלהם ולאחר מכן לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "גוף התא" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".
    הערה: המתכון מורכב של מספר תמונות צעדים עיבוד: רקע להסרת, זיהוי אובייקט, האובייקט ההפרדה וסינון משנה.
  5. הבא, להשתמש במתכון "התפשטות תאים" על התמונה המקורית ויוכל להסתיר את הקפסולה ולאחר לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "קפסולה" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".
  6. באמצעות את המתכון, 'כמוסת מחיצה', ליצור מסכה חדשה על גבי התמונה המקורית מחיצות קפסולות סמוכים אחד מהשני. כדי לעשות זאת, לחץ על "הקפסולה מחיצה" מתוך התפריט הנפתח מתכון. בתיבה מחיצה כמוסה, לבחור המסכה ספירת עכשיו ששמן שונה "(5.5)" קפסולה עבור אזור כמוסה. בחר המסכה ספירת עכשיו ששמם "גוף התא" אנוסים תאים (5.4). לבחור "אורגינל" עבור ערוץ קלט, ו- "יצירת מסכת קפסולה Partitioned. לחץ על "החל
    הערה: המתכון יוצר התא ואת קוטר קפסולה, המוגדר כממוצע של הצירים הארוכים והקצרים מעבר למרכז של התא, כמוסה, וכן אזור מדידות של זיהוי מסכות. למצוא את הפלט הממוקמים תחת הכרטיסיה גיליון אלקטרוני בתוכנה זו. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות (מינימום של 50 תאים/קבוצה). הפרמטרים של המתכון יכול להיות מכוון כדי למטב את גילוי של תמונות בודדות או אופטימיזציה עבור איתור אצווה של תמונות מרובות. מדידות נוספות ניתן לחשב לפי מתכון ואפיון מקיף של התא לבין המורפולוגיה של הקפסולה.
  7. ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני של בחירה עבור ניתוח נוסף.

תוצאות

כדי להמחיש אינדוקציה קפסולה תא מכתים, הדמיה, טכניקות מדידה, היינו שלושה זנים של neoformans ג: המעבדה משותף, מאופיין היטב להתאמץ, H99S30ושני זני קלינית מבודדת בעבר קוטר קפסולה לא ידוע, B18 ולא B5231.

זרימת העבודה של אינדוק...

Discussion

במשך עשרות שנים, כבר הקפסולה והמוקד העיקרי של המחקר הן mycologists והן קלינאים מעוניין neoformans ג cryptococcosis בשל תפקידה כגורם מרכזי התקפה אלימה על המחלה. באמצעות מיקרוסקופ כדי למדוד את ההבדלים בגודל קפסולה בין זנים, תחת גידול שונים תנאים יכול לספק מידע חשוב על המחלה ועל התגובות לגירויים שונים (

Disclosures

המחבר, Hoyin לאי, הוא מנהל המוצר ב DRVision אשר מפרסם התוכנה ניתוח התמונה האוטומטי, Aivia.

Acknowledgements

אנו מודים לתוכנית הדוקטורט החיים מולקולרית (MOBI), המחלקה לביולוגיה-התיכון טנסי המדינה האוניברסיטה (MTSU) על מתן המימון למחקר זה. הפרויקט גם מומן בחלקו על ידי מענק לפרויקטים מיוחדים מוענק D.E.N. על ידי קרן MTSU.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Capsule Induction
C. neoformans cellsThe clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvateGE Life SciencesSH30022.01
6-well platesFalconCL5335-5EA
Shaking incubatorThermo Scientific MaxQ6000
CO2 incubatorFisher ScientificIsotemp
CentrifugeThermo ScientificLegend XTR
Staining
MicrocentrifugeThermo ScientificLegend Micro 21R
India inkFisher Scientific14-910-56
Calcofluor whiteSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9418
Superfrost microscope slidesFisher Scientific12-550-143
Glass coverslipsCorning2855-18#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oilCargille 16484
Light microscope with immersion oil objectiveZeissZeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope cameraZeissZeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objectiveZeissLSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope softwareZen 2009
Confocal microscope cameraNikonNikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging softwareNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing softwarePhotoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurementAxiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurementAivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet softwareExcel (Microsoft)

References

  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132Neoformans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved