Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

Resumo

A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.

Resumo

A cápsula de polissacarídeo de Cryptococcus neoformans é o factor de virulência primário e um dos mais comumente estudados aspectos desta levedura patogênica. Tamanho da cápsula pode variar amplamente entre estirpes, tem a capacidade de crescer rapidamente quando introduziu a estressantes ou baixas condições de nutrientes e tem sido positivamente correlacionado com a virulência da cepa. Por estas razões, o tamanho da cápsula é de grande interesse para pesquisadores de c. neoformans . O crescimento da cápsula de c. neoformans é induzido durante os testes fenotípicos para ajudar a compreender os efeitos de diferentes tratamentos nas diferenças entre cepas de levedura ou tamanho. Aqui descrevemos um dos métodos padrão da cápsula da indução e comparar dois métodos aceites de coloração e medir o diâmetro da cápsula: (i) a tinta indiana, uma mancha negativa, usado em conjunto com microscopia de luz convencional e (ii) co-coloração com corantes fluorescentes da parede celular e cápsula seguido por microscopia confocal. Finalmente, mostramos como a medição do diâmetro da cápsula de amostras manchadas de tinta da Índia pode ser automatizado usando análise computacional de imagens.

Introdução

Afetando um quarto de milhão de pessoas todos os anos e resultando em mais de 180.000 mortes por ano, o Cryptococcus neoformans é uma levedura patogénica, intracelular e o agente causador da criptococose,^{1,2, 3}. mais atingidas são os pacientes HIV-positivos em países pobres que não têm acesso à terapia anti-retroviral, tornando-os suscetíveis aguda para a doença^4,5,6. Dados do CDC indicam que na África subsahariana, c. neoformans mata mais pessoas do que a tuberculose anualmente e mais a cada mês do que qualquer surto de Ebola no registro¹. A via mais comum de exposição ocorre de inalar esporos dessecados que são comuns no ambiente⁷. Ao entrar nos pulmões, existem vários fatores de virulência que contribuem para o sucesso de c. neoformans dentro de indivíduos infectados. A cápsula de polissacarídeo é considerada fator de virulência primário do micróbio, acapsular cepas não são virulentas⁸.

A cápsula criptocócica é composta de três componentes do princípio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteins (MPs)⁹. Enquanto o MPs são um componente relativamente menor associada a parede celular da cápsula, são imunogênicas e podem promover uma resposta principalmente pro-inflamatórios^9,10. Em contraste, GXM e GalXM compõem a maior parte da cápsula (> 90% em peso) e tem efeitos imunossupressores¹¹. Além de seus efeitos imunomoduladores, o rápido alargamento da cápsula na vivo cria uma barreira mecânica à ingestão por células fagocíticas (isto é, neutrófilos e macrófagos) do hospedeiro¹². A cápsula de c. neoformans e sua síntese são complexas, mas em geral, maior diâmetro da cápsula está correlacionado com maior virulência^6,13,14. Diante disso, é importante para os investigadores de c. neoformans ser capaz de rapidamente e com precisão quantificar as medições da cápsula.

Tanto a célula de c. neoformans e sua cápsula de polissacarídeo são estruturas dinâmicas e mostram as mudanças ao longo do tempo,¹⁵. A cápsula pode mudar em conjunto em resposta a alterações na host ambiente^16,17,18, tamanho e densidade. Baixo ferro ou os níveis de nutrientes, a exposição ao soro, o pH fisiológico humano e aumento de CO₂ são conhecidos para iniciar o crescimento da cápsula^16,18,19,20. Além disso, pesquisadores demonstraram alterações estruturais, resultando em diferenças significativas na imunorreatividade durante uma infecção, emprestando uma vantagem para c. neoformans sobre seu hospedeiro^21,22. Isto é sabido porque a arquitetura da cápsula de c. neoformans foi analisada em uma variedade de maneiras. Microscopia eletrônica, por exemplo, revelou que a cápsula tem uma matriz heterogêneo com uma camada interna de elétron-densas debaixo de uma camada externa, mais permeáveis²³. Dispersão da luz e o uso de pinças ópticas permitiram pesquisadores elucidar ainda mais suas propriedades macromolecular²⁴. Analisar os resultados de ambas as medições estáticas e dinâmicas de espalhamento de luz, sabemos que a cápsula de polissacarídeo tem um complexo de estrutura ramificação²³. Pinça óptica têm sido utilizada para testar a rigidez da estrutura, bem como avaliar sua reatividade de anticorpos²⁴. No entanto, de longe o mais frequentemente empregado análise da cápsula de c. neoformans é a medida do seu tamanho.

Para quantificar o tamanho da cápsula, os pesquisadores utilizam o que deveria ser uma simples medição: o diâmetro linear da cápsula. Microscópios digitais são usados para capturar imagens de várias células de c. neoformans (geralmente centenas) manchadas com tinta nanquim ou corantes fluorescentes. O tamanho de cada corpo celular e cápsula circundante é medido. Os dados são compilados, e o diâmetro médio da cápsula é calculado subtraindo-se o diâmetro do corpo celular do diâmetro celular (corpo celular + cápsula). Até este ponto, estas medições foram feitas manualmente. Enquanto geralmente exato, este método tem desvantagens para os investigadores. Grandes conjuntos de dados pode demorar dias ou até semanas para analisar com a mão. E porque essas medições são feitas manualmente, subjetividade e erro humano podem afetar o resultado.

Análise de imagem computacional automatizado tornou-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores em muitas áreas da biologia celular molecular, permitindo a análise mais rápido e mais confiável de imagens biológicas ^25,26,27. Técnicas de análise de imagem precisas são necessárias informações quantitativas de que muitas vezes são conjuntos de dados complexos e imensos o meu. No entanto, algumas medidas, especialmente a medição de c. neoformans cápsula, foram difíceis automatizar. Identificar com precisão a interface entre a parede celular e cápsula, que geralmente aparece como um anel escuro quando imaginada por microscopia de contraste de fase, pode ser problemático para resolver usando um simples limite. Além disso, as células de c. neoformans em cultura tendem a aglutinar-se e segmentação exata das células é necessária para medições precisas.

O objetivo deste projeto foi (i) ilustram um dos protocolos padrão para a indução da cápsula em c. neoformans, (ii) compara e contrasta Nanquim e fluorescência de coloração como dizem respeito para a cápsula de medições de diâmetro, (iii) desenvolver simples, métodos computacionais para medir o diâmetro da cápsula usando imagens da Índia tinta manchada células usando um software de análise de imagem e, (iv) avaliam as vantagens e limitações de medir o diâmetro da cápsula manualmente e usando o software de automação. Podemos achar que os dois métodos de coloração, fluorescentes de rotulagem da parede celular e cápsula, enquanto mais demorados, forneceu os resultados mais consistentes entre experiências. No entanto, ambos os métodos permitiram-nos com sucesso a distinguir entre o laboratório e clínica c. neoformans cápsula de cepas exibindo diferentes tamanhos. Além disso, fomos capazes de automatizar a medição do diâmetro da cápsula de tinta manchada imagens e achei que se tratava de uma alternativa viável para medição manual da cápsula.

Protocolo

Nota: C. neoformans é um patógeno de biossegurança nível 2 (BSL-2) e pesquisadores que trabalham com ela devem tomar as devidas precauções. Detalhada de procedimentos sobre como para com segurança trabalho com patógenos BSL-2 pode ser encontrado no Center for Disease Control (CDC) site, mas é importante notar que todas as pessoas que entram em contacto com o c. neoformans devem ser devidamente treinadas em manipulação os agentes patogénicos e deve usar sempre equipamento de protecção adequado (EPI), geralmente de látex ou luvas de nitrilo. Além disso, rotores em centrífugas devem ser selados para evitar clorofórmio de amostras e todos os derramamentos limpados imediatamente, usando uma solução de água sanitária 10%²⁸.

1. cápsula indução

Nota: Todas as etapas devem ser executadas na temperatura de quarto a menos que indicado o contrário.

1. Cultura de c. neoformans em caldo de dextrose (YPD) levedura peptona (pH 6.5 + /-0,2) e incubar a 37 ° C, com agitação até que estejam em fase de registro (aproximadamente 18-36 h).
2. Centrifugar as células a 870 x g por 5 min a 21 ° C e lavar três vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).
3. Use um hemocytometer (ou um contador de célula automatizada) para contar as células e ressuspender a 2 x 10⁵ células/2 mL em media de essenciais mínimos de Dulbecco (DMEM).
4. Para induzir a cápsula, incube a 37 ° C e 5% CO₂ para 18 h.
   Nota: A combinação de ausência de nutrientes na mídia e a presença de CO₂ estimula o crescimento da cápsula de c. neoformans .
5. Pós-incubação, recolher as células por centrifugação (como acima) e remover todos, mas 5-10 µ l sobrenadante. Ao mesmo tempo, colha uma amostra de un-induzido célula correspondente para cada tensão a ser medido. Usá-los como controles negativos.
   Nota: As pelotas de célula serão muito pequenas e podem ser difícil de ver. Tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante.
6. Manchar com tinta nanquim (seção 2.1) ou corantes fluorescentes (seção 2.2).

2. coloração

1. Coloração com apenas tinta nanquim
   1. Para manchar o fermento com tinta nanquim, resuspenda o pellet em restante sobrenadante e adicionar 4μL (aproximadamente metade) de suspensão de células e 4μL de tinta nanquim em uma lâmina de vidro de microscópio. Delicadamente, misture e evitar a formação de espuma.
   2. Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.
2. Coloração com apenas corantes fluorescentes
   1. Para manchar o fermento com um corante fluorescente, Ressuspender as células em 50 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).
   2. Incubar a cultura com um volume igual de Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e cápsula mAb 18B7 (ver Tabela de materiais) conjugada com AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) por 30 min a 37 ° C.
   3. Centrifugar as células a 870 x g durante 5 min à pós-incubação de 21 ° C e aspire o sobrenadante.
   4. Resuspenda o pellet celular em 10 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).
   5. Pipete 8 µ l de suspensão de células sobre uma lâmina de vidro de microscópio.
   6. Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.
3. Coloração com tinta da Índia e corantes fluorescentes
   1. Para mais directamente comparar a eficácia de Nanquim mancha ao de corantes fluorescentes, co manche a mesma população de células com ambos os tipos de mancha. Para fazer isso, primeiro Incube as células com uma cápsula fluorescente e a mancha da parede celular, conforme os passos 2.2.1 - 2.2.3.
   2. Em seguida, pipetar volumes iguais (4 µ l) da suspensão de células coradas fluorescentemente e tinta nanquim numa lâmina de vidro. Misture suavemente.
   3. Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.

3. imagem aquisição/microscopia

1. Células de imagem manchada com tinta nanquim.
   1. Adquira imagens usando um microscópio de luz padrão (ampliação de 100 X).
   2. Imagem de um mínimo de 50 células por condição.
      Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantidos a um mínimo, como estes são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado). Para estas experiências, imagens foram adquiridas em uma profundidade de 16 bits com tempos de exposição otimizados para maximizar o contraste da imagem, minimizando o desfoque causado por pequenos movimentos das células.
2. Imagem de células coradas com corantes fluorescentes
   1. Para as células de imagem por microscopia de fluorescência, abra o software de imagem de microscópio e selecione os apropriado da excitação e emissão de comprimentos de onda para o fluorophores usado (CFW e AF488 são animado usando o 405nm e luzes de 488 nm, respectivamente). Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência.
   2. Imagem de um mínimo de 50 células por condição.
      Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantido no mínimo como estas são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado).
   3. Adquira uma série de imagem de z-pilha das células para garantir que o diâmetro máximo da cápsula para cada célula dentro de um determinado campo é obtido.
      1. No software de controle do microscópio, clique na barra "z-pilha" para abrir o painel de controle "z-pilha" e, em seguida, seleccione a opção "Primeiro/último" no canto superior esquerdo do painel.
      2. Use o controle de foco fino no microscópio para se concentrar em um nível que está abaixo do ponto mais largo de uma célula de levedura única e as cápsulas para todos dentro do campo de visão atual e clique em "Definir primeiro".
      3. Use o controle de foco fino para foco acima do ponto mais largo do corpo celular da mesma célula e da cápsula para todas as células dentro do campo de visão atual e clique em "Definir ontem".
      4. Clique em "Iniciar o experimento" na guia "Aquisição" para adquirir a z-pilha para a posição atual. Repita o processo em várias posições até imagens de z-pilha mínima de 50 células foram adquiridas.
         Nota: Para estas experiências, a pinhole confocal foi definido como 1.0 AU e uma sobreposição z-series de 10-20 fatias cobrindo 0,7 µM cada foram adquiridos nas posições selecionadas. AU = unidade arejada.
   4. Em seguida, converta cada série z-pilha em projeções de intensidade máxima (MIP) usando software de análise de imagem apropriado.
      Nota: MIPs projetam a maior intensidade em cada plano da imagem empilhados²⁹. Criação de MIPs permite produzir uma representação 2D de imagens que correspondem a célula máxima e o diâmetro da cápsula dentro da pilha 3D capturado.
3. Células de imagem manchada com tinta nanquim e corantes fluorescentes
   1. Adquirir imagens usando widefield (ampliação de 40 X) ou um microscópio confocal (63 X ou ampliação de 100 X). Para células manchadas com tinta nanquim e corantes fluorescentes, capture imagens usando um microscópio widefield equipado com um palco controlado por computador e objectivo de imersão de óleo.
      Nota: O microscópio em uso deve ser controlado usando um software de imagem CFW. fluorescência que é excitado através de um filtro de excitação 340-380 nm e emitida a luz deverá ser detectada através de um filtro de barreira 435-485 nm reflectido a partir um espelho dicroico 400 nm. AF488 fluorescência pode ser excitada por um filtro de excitação 465-495 nm, e a luz emitida pode ser detectada através de um filtro de barreira 515-555 nm reflectido a partir um espelho dicroico 505 nm.
   2. Um mínimo de 50 células por condição para cada método de coloração de imagem.

4. manual medição da cápsula

1. Para células manchadas com tinta nanquim ou fluorescentes manchas, usar um software de medição de célula para manualmente medida cápsula e célula de diâmetro (ver Tabela de materiais). Para fazer isso, vá em "Arquivo" > "Abrir imagem" > "Medida" e use o cursor para desenhar uma linha reta através do ponto mais largo da célula inteira (diâmetro total).
2. Em seguida, clique novamente em "Medida" e desenhar uma linha reta através do corpo celular (diâmetro do corpo da célula).
   Nota: As medições são salvos automaticamente para as células.
3. Repita este processo para todas as células (mínimo de 50/grupo).
4. Para salvar imagens, uma vez que eles são medidos, clique em "Arquivo" > "Salvar como" e nomeie as imagens apropriadamente.
5. Selecione os arquivos recentemente medidos e exportar dados para um software de planilha eletrônica.
6. Calcule o diâmetro médio da cápsula usando a equação: ([diâmetro total] - [corpo celular de diâmetro]).

5. automáticos de medição da cápsula

Nota: Para a medição automatizada bem sucedida, usar imagens de 16 bits com um alto nível de contraste e que estão focados corretamente junto com um software de análise de imagem apropriada (consulte a Tabela de materiais). Quando a imagem de c. neoformans para medição da cápsula, é importante concentrar-se no anel escuro na fronteira entre a parede celular e cápsula. Isso permite que o software corretamente delinear da célula e cápsula.

1. Inverter e criar uma cópia de toda Índia tinta manchada imagens de célula, usando um software de edição de imagem apropriado (consulte a Tabela de materiais). Para fazer isso, clique em "Arquivo" > "Open" para abrir a Índia tinta manchada imagens e depois "Control" + "I" para inverter a imagem. Clique em "Arquivo" > "Salvar como" para salvar a imagem invertida.
2. Para importar o original e invertido imagens no software clique em "Arquivo" > "Importar sequência" > "Carregar imagem" > "Definir sequência (manualmente)" > "Dimensões (canal)" > "Importar" > "Aplicar".
   Nota: Os corpos de células de c. neoformans e cápsulas podem ser identificadas e mascarados usando algoritmos específicos - conhecidos como 'Receitas' - incluídas no software.
3. Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para detectar e mascarar o corpo da célula e, em seguida, clique em "aplicar". A imagem invertida, o anel escuro, definir os limites da célula de c. neoformans torna-se mais brilhante do que a cápsula circundante.
4. Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para segmentar os corpos de células de c. neoformans de suas cápsulas e, em seguida, clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Corpo celular" clicando na guia rotulada "máscara de contagem".
   Nota: A receita é composta de várias etapas de processamento de imagem: remoção, detecção de objeto, separação do objeto e filtragem de subconjunto de fundo.
5. Em seguida, usar a receita de 'Proliferação celular' na imagem original para detectar e mascarar a cápsula e clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Cápsula" clicando na guia rotulada "máscara de contagem".
6. Usando a receita, 'Cápsula partição', crie uma nova máscara na imagem original para particionar cápsulas adjacentes entre si. Para fazer isso, clique em "Partição de cápsula" no menu suspenso de receita. Na caixa de partição de cápsula, escolha a máscara de contagem agora renomeado "Cápsula" (5.5) para a região da cápsula. Escolha a máscara de contagem agora renomeado "Corpo celular" para células Crypto (5.4). Escolha "Original" para o canal de entrada e "criar máscara para Partitioned cápsula. Clique em "Apply
   Nota: A receita gera células e diâmetro da cápsula, definido como a média dos eixos mais longas e mais curtos atravessando o centro da célula e cápsula e medições de área de máscaras de deteção. Encontre a saída que está localizada na guia planilha neste software. Repita este processo para todas as imagens (mínimo de 50 células/grupo). Parâmetros da receita poderiam ser ajustados para otimizar a deteção de imagens individuais ou otimizados para a deteção de lote de várias imagens. Medidas adicionais podem ser calculadas pela receita para a caracterização completa da célula e morfologia da cápsula.
7. Exporte dados para um software de planilha de escolha para posterior análise.

Resultados

Para ilustrar a indução da cápsula, coloracao celular, imagens e técnicas de medição, usamos três estirpes de c. neoformans: Coe o laboratório comum, bem caracterizado, H99S³⁰e duas cepas isoladas clinicamente de anteriormente diâmetro da cápsula desconhecido, B18 e B52³¹.

O fluxo de trabalho de indução da cápsula, coloração e aquisição de imagens usando t...

Discussão

Durante décadas, a cápsula tem sido um grande foco de pesquisa para os micologistas e clínicos interessados em c. neoformans e criptococose devido ao seu papel como um fator de virulência principais para o patógeno. Usando microscopia para medir diferenças no tamanho da cápsula entre estirpes e sob crescimento diferente condições podem fornecer informações importantes sobre o patógeno e suas respostas aos diversos estímulos (ou seja, diferentes condições ambientais, tratamentos com drogas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)			This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01
6-well plates	Falcon	CL5335-5EA
Shaking incubator	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 incubator	Fisher Scientific		Isotemp
Centrifuge	Thermo Scientific		Legend XTR
Staining
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
India ink	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488			A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)			PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-143
Glass coverslips	Corning	2855-18	#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition
Immersion oil	Cargille	16484
Light microscope with immersion oil objective	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective	Zeiss		LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.
Confocal microscope software	Zen 2009
Confocal microscope camera	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.
Widefield imaging software	Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software	Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement	Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement	Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software	Excel (Microsoft)