Размер имеет значение: Измерение диаметра капсулы в Cryptococcus neoformans

Резюме

Полисахаридной капсулы является фактором первичного вирулентности Cryptococcus neoformans, и его размер коррелирует с вирулентности штамма. Капсула диаметр измерения используются в фенотипических тестирования и оценки терапевтической эффективности. Здесь представлен стандартный метод капсула индукции, и сравниваются два методы окрашивания и измерения диаметра.

Аннотация

Полисахаридной капсулы Cryptococcus neoformans является фактором первичного вирулентности и один из самых часто изучал аспекты этой патогенных дрожжей. Капсула размер может широко варьироваться между штаммами, обладает способностью быстро расти, когда стресс или низкой питательных условий и был положительно коррелирует с вирулентности штамма. По этим причинам размер капсулы представляет большой интерес для исследователей, C. neoformans . Рост C. neoformans капсула индуцируется во время тестирования фенотипические чтобы помочь понять последствия различных методов лечения на дрожжи или размер различия между штаммами. Здесь мы описываем один из стандартных методов капсула индукции и сравнить два признанных методов окрашивания и измерительная капсула диаметр: (i) чернила Индии, отрицательные пятно, используется в сочетании с обычными светлую микроскопию и (ii) совместно окрашивание с Краски люминесцентные, флуоресцентные клеточной стенки и капсула, следуют confocal микроскопии. Наконец, мы покажем, как измерение капсул диаметром от окрашенных чернил Индии образцы могут быть автоматизированы с помощью анализа вычислительных изображений.

Введение

Влияющих на четверть миллиона человек каждый год и в результате более чем 180 000 смертей ежегодно, Cryptococcus neoformans является патогенным, внутриклеточный дрожжей и возбудителя криптококкоза^{1,2, 3}. наибольшей являются ВИЧ позитивных пациентов в бедных странах, которые не имеют доступ к антиретровирусной терапии, что делает их крайне восприимчивы к болезни^4,5,6. Данные из CDC показывают, что в Африке к югу от Сахары, C. neoformans убивает больше людей, чем туберкулеза, ежегодно и более каждый месяц, чем любой вспышки лихорадки Эбола на запись¹. Наиболее распространенные пути воздействия происходит от вдыхания сморщившимися споры, которые являются обычным явлением в среду⁷. При входе в легкие, существует несколько факторов вирулентности, которые внести вклад в успех C. neoformans в инфицированных лиц. Полисахаридной капсулы считается фактором первичного вирулентности микроба, acapsular штаммы являются не вирулентные⁸.

Криптококковый капсула состоит из трех компонентов принцип: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) и mannoproteins (MPs)⁹. Хотя м/с являются относительно незначительными клеточной стенки связанный компонент капсулы, они иммуногенность и может способствовать в основном про воспалительной реакции^9,10. В отличие от GXM и GalXM составляют основную часть капсулы (> 90% по весу) и иммуносупрессивные последствия¹¹. В дополнение к его иммуномодулирующие эффекты быстрое расширение капсулы в естественных условиях создает механический барьер для употребления, принимающих фагоцитирующих клеток (то есть, нейтрофилы и макрофаги)¹². C. neoformans капсулу и его синтеза являются сложными, но в целом, увеличение диаметра капсулы коррелирует с повышенной вирулентности^6,,1314. Учитывая это, важно для C. neoformans исследователей иметь возможность быстро и точно подсчитать капсула измерений.

C. neoformans ячейки и ее полисахаридной капсулы являются динамические структуры и показать изменения за время¹⁵. Капсулы можно изменить плотность, размер и Ассамблея в ответ на изменения в принимающей среде^16,17,18. Инициировать капсулы рост^16,18,,1920известны низкой железа или уровни питательных веществ, воздействие сыворотки, человеческого физиологических рН и увеличение CO₂ . Кроме того исследователи показали структурные изменения, что привело к значительным различиям в иммунореактивности во время инфекции, кредитование преимущество C. neoformans над его пребывания^21,22. Это известно, потому что архитектура C. neoformans капсулы были проанализированы в различных способами. Электронная микроскопия, например, показал, что капсула имеет гетерогенной матрицы с электронно плотные внутренний слой под более проницаемым слоем²³. Рассеяние света и использование Оптический пинцет позволили исследователям для дальнейшего выяснения его макромолекулярных свойства²⁴. Анализируя результаты из обоих измерений статического и динамического рассеяния света, мы знаем, что полисахарид капсулы имеет сложной разветвленной структуры²³. Оптический пинцет были использованы для тестирования жесткость структуры, а также оценить его антитела реактивности²⁴. Однако на сегодняшний день наиболее часто занятых анализ C. neoformans капсулы является измерение его размер.

Для количественного определения размера капсулы, исследователи используют, что должно быть простой измерения: линейный диаметр капсулы. Цифровые микроскопы, используются для захвата изображения нескольких C. neoformans клеток (как правило сотни) окрашенных чернил Индии или флуоресцентными красителями. Размер каждой клетки тела и окружающего капсулы измеряется. Данные компилируются, и средний диаметр капсулы рассчитывается путем вычитания клетки тела диаметром от диаметра всей клетки (клетки тела + капсула). До этого момента эти измерения были сделаны вручную. Хотя в целом точной, этот метод имеет недостатки для исследователей. Большие наборы данных может занять дни или даже недели, чтобы анализировать вручную. И потому, что эти измерения выполняются вручную, субъективности и человеческой ошибки могут повлиять на результат.

Анализ автоматизированной вычислительной изображений стал незаменимым инструментом для исследователей во многих областях молекулярной клеточной биологии, позволяя более быстрый и надежный анализ биологических изображения ^25,,2627. Методы анализа точных изображений необходимо добывать количественную информацию от того, что часто сложных и огромных наборов данных. Однако некоторые измерения, особенно измерения C. neoformans капсула, были трудно автоматизировать. Точно определить интерфейс между клеточной стенки и капсула, которая обычно появляется как кольцо тьмы, когда imaged при фазово контрастной микроскопии, может быть хлопотно для разрешения с помощью простой порог. Кроме того C. neoformans клеток в культуре, как правило, слипаются и точная сегментация клеток необходима для точных измерений.

Цель этого проекта заключалась в (i) иллюстрируют один из стандартных протоколов для капсула индукции в C. neoformans, (ii) сравнить и сопоставить чернил Индии и флуоресценции окрашивание как они относятся к капсуле диаметром измерения, (iii) разработка простой, вычислительные методы для измерения капсул диаметром, с использованием изображений чернил Индии, окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений и, (iv) оценить преимущества и ограничения измерения диаметра капсулы вручную и с помощью программного обеспечения автоматизации. Мы обнаружить, что из двух пятная методов, люминесцентные маркировки клеточной стенки и капсула, пока больше времени при условии наиболее последовательных результатов между экспериментов. Однако, оба метода позволило нам успешно проводить различие между лаборатории и клинической C. neoformans экспонируется различных штаммов капсулы размеров. Кроме того мы смогли автоматизировать измерения капсул диаметром от чернил Индии, окрашенные образы и обнаружил, что это была жизнеспособной альтернативой ручного измерения капсулы.

протокол

Примечание: C. neoformans патогена 2-го уровня биобезопасности (BSL-2) и исследователей, работающих с ним должны принимать соответствующие меры предосторожности. Подробные процедуры на как для безопасной работы с патогенами BSL-2 можно найти на центр по контролю заболеваний (CDC) веб-сайт, но это важно отметить, что все люди, соприкасаясь с C. neoformans должны быть надлежащим образом подготовлены в обработке патогенных агентов и должны всегда носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), как правило латекса или перчатки из нитрила. Кроме того роторы на центрифуг должны быть закрыты для предотвращения аэрозолизации образцов и любых разливов, очистке, немедленно с помощью отбеливателя 10% раствор²⁸.

1. капсула индукции

Примечание: Если не указано иное, все действия следует выполнить при комнатной температуре.

1. Культура C. neoformans в дрожжи Пептон Декстроза (YPD) бульон (рН 6,5 +/-0.2) и инкубировать при 37 ° C с тряски до тех пор, пока они находятся в фазе журнала (около 18-36 ч).
2. Центрифуга клетки на 870 x g 5 минут при температуре 21 ° C и промойте три раза-фосфатный буфер (PBS).
3. Используете Горяева (или счетчик автоматизированных клеток) для подсчета клеток и Ресуспензируйте в 2 x 10⁵ клеток/2 мл в Дульбекко в минимальных основных СМИ (DMEM).
4. Чтобы побудить капсулу, Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ для 18 h.
   Примечание: Сочетание отсутствие питательных веществ в средствах массовой информации и наличие CO₂ стимулирует C. neoformans капсулы рост.
5. После инкубации, урожай клетки путем центрифугирования (см. выше) и удаления всех, но 5-10 мкл супернатант. В то же время урожай соответствующий образец ООН индуцированных клеток для каждого напрягаться, чтобы быть измерены. Используйте их как негативный контроль.
   Примечание: Гранулы ячейки будет очень мала и может быть трудно увидеть. Будьте внимательны при аспирационных супернатант.
6. Пятно с тушью (раздел 2.1) или Краски люминесцентные, флуоресцентные (раздел 2.2).

2. Окрашивание

1. Окрашивание с только чернила Индии
   1. Пятно дрожжей с тушью, Ресуспензируйте гранулы в оставшихся супернатант и добавить 4μL (около половины) суспензии клеток и 4μL чернил Индии на стекло микроскопа. Осторожно смешать и избегая образования пены.
   2. Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.
2. Окрашивание только флуоресцентными красителями
   1. Пятно дрожжи с флуоресцентной краской, Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
   2. Инкубировать культуры с равным объемом Calcofluor белый (CFW) (1 мкг/мл) и 18B7 капсула МАБ (см. Таблицу материалы) конъюгированных с AlexaFluor488 (AF488) (10 мкг/мл) за 30 мин при температуре 37 ° C.
   3. Центрифуга клетки на 870 x g за 5 мин при 21 ° C после инкубации и удалить супернатант.
   4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мкл PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
   5. Пипетка 8 мкл суспензии клеток на стекло микроскопа.
   6. Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.
3. Окрашивание с тушью и флуоресцентных красителей
   1. Более непосредственно сравнить эффективность чернил Индии, окрашивание, флуоресцентных красителей, совместно пятна же популяции клеток с обоими типами пятно. Чтобы сделать это, сначала Инкубируйте клетки с Люминесцентная капсула и клеточной стенки пятно, согласно шаги 2.2.1 - 2.2.3.
   2. Далее Пипетка равных объемах (4 мкл) суспензии дневно окрашенных клеток и тушью на стеклянное скольжение. Аккуратно перемешайте.
   3. Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.

3. изображение приобретение/микроскопия

1. Imaging клеток окрашенных чернил Индии.
   1. Получение изображений с помощью стандартных световой микроскоп (100 крат).
   2. Изображение как минимум 50 ячеек на условие.
      Примечание: Количество ячеек на поле будет меняться, и это приемлемым. Важно, однако, что перекрытие клетки быть сведены к минимуму, как это трудно измерить (как вручную, так и с автоматизированного программного обеспечения). Для этих экспериментов изображения были приобретены на глубине 16 бит с временем экспозиции, оптимизирован для максимальной контрастность изображения при сведении к минимуму размытие, возникшее при небольших движений клеток.
2. Imaging клетки окрашивали флуоресцентных красителей
   1. Для изображения клетки по микроскопии флуоресцирования, откройте Микроскоп, обработки изображений и выберите соответствующие волны возбуждения и выбросов в флуорофоров используется (CFW и AF488 рады с помощью 405nm и 488 нм огни, соответственно). Получение изображений с помощью микроскопа флуоресценции.
   2. Изображение как минимум 50 ячеек на условие.
      Примечание: Количество ячеек на поле будет меняться, и это приемлемым. Важно, однако, что перекрытие клетки храниться как минимум, как это трудно измерить (как вручную, так и с автоматизированного программного обеспечения).
   3. Приобрести изображения серии z стек клеток для обеспечения максимального диаметра капсулы для каждой ячейки в пределах данной области.
      1. В программном обеспечении управления микроскопом нажмите на панели «z стека», чтобы открыть панель управления «z стека», а затем выберите параметр «Фамилия» в левом верхнем углу панели.
      2. Используйте элемент штраф фокус на микроскопе сосредоточиться на уровне, который ниже точки широкого единого дрожжевых клеток и капсулы для всех в рамках текущего поля зрения и нажмите кнопку «Задать первый».
      3. Используйте элемент штраф фокус сосредоточиться над широкой точки тела клетки из той же клетке и капсулы для всех ячеек в пределах текущего поля зрения и нажмите кнопку «Установить последний».
      4. Затем нажмите «Начать эксперимент» на вкладке «Приобретение», чтобы приобрести z стека для текущей позиции. Повторите этот процесс на несколько позиций, до тех пор, пока изображения z стек как минимум 50 клеток были приобретены.
         Примечание: Для этих экспериментов, конфокальная Пинхол был равным 1.0 АС и перекрывающихся z серии 10-20 фрагментов, охватывающих 0.7 мкм были приобретены в выбранной позиции. АС = светлые блок.
   4. Далее конвертировать каждой серии z стека в максимальной интенсивности прогнозы (МИП) с помощью программного обеспечения для анализа соответствующего изображения.
      Примечание: MIPs проекта наибольшей интенсивностью в каждой плоскости сложены изображения²⁹. Создание MIPs позволяет производить 2-D представление изображения, которые соответствуют максимальной клеток и капсул диаметром в пределах захваченных 3-D стека.
3. Визуализации ячейки окрашенных чернил Индии и флуоресцентных красителей
   1. Получение изображений с помощью widefield (40 кратном) или конфокального микроскопа (63 X или 100 крат). Для клеток окрашенных чернил Индии и флуоресцентные краски захвата изображения с помощью widefield микроскопом с компьютерным управлением стадии и цель погружения нефти.
      Примечание: Микроскоп в использование должно контролироваться с помощью изображений программного обеспечения CFW. флуоресцирование, что спешит через фильтр возбуждения 340-380 Нм и испускаемого света должно быть обнаружено через фильтр барьер Нм 435-485, отраженный от 400 Нм дихроичное зеркало. AF488 флюоресценции может быть взволнованным через фильтр возбуждения 465-495 нм, и испускаемого света может быть обнаружена через фильтр барьер 515-555 Нм, отраженный от 505 нм дихроичное зеркало.
   2. Изображение как минимум 50 ячеек на условие для каждого метода окрашивания.

4. ручное измерение капсулы

1. Для клеток окрашенных чернил Индии или флуоресцентные пятна, использовать программное обеспечение измерения ячейку вручную мера капсулу и клеток диаметра (см. Таблицу материалы). Для этого перейдите в меню «Файл» > «Открыть изображение» > «Мера» и используйте курсор, чтобы нарисовать прямую линию через точку максимально всей ячейки (диаметр).
2. Далее снова нажмите кнопку «Мера» и нарисовать прямую линию через тело клетки (клетки тела диаметр).
   Примечание: Измерения автоматически сохраняются на клетки.
3. Повторите этот процесс для всех клеток (минимум 50/группы).
4. Для сохранения изображений, как только они измеряются, нажмите кнопку «Файл» > «Сохранить как» и соответствующим образом имя изображения.
5. Выберите файлы, недавно измеренных и экспортировать данные в программу электронных таблиц.
6. Рассчитать средний диаметр капсул, используя уравнение: ([Диаметр] - [диаметр клетки тела]).

5. автоматизированное измерение капсулы

Примечание: Для успешного автоматизированного измерения, использовать 16-битные изображения с высоким уровнем контрастности и что ориентированы должным образом наряду с программного обеспечения для анализа соответствующего изображения (см. Таблицу материалы). При визуализации C. neoformans капсула измерения, важно сосредоточить внимание на темные кольца на границе между клеточной стенки и капсулы. Это позволяет программное обеспечение, чтобы правильно определить ячейки и капсулы.

1. Инвертировать и создайте копию всех чернил Индии, окрашенных клеток изображения с помощью соответствующего программного обеспечения редактирования изображений (см. Таблицу материалы). Чтобы сделать это, нажмите кнопку «Файл» > «Открыть» чтобы открыть чернил Индии, витражные изображения и затем «контроль» + «Я», чтобы инвертировать изображение. Нажмите кнопку «Файл» > «Сохранить как», чтобы сохранить перевёрнутое изображение.
2. Для импорта как оригинальные, так и перевернутый изображений в программное обеспечение и нажмите «Файл» > «Импортировать последовательность» > «Загрузка изображения» > «Определить последовательность (вручную)» > «Размеры (канал)» > «Импорт» > «Применить».
   Примечание: C. neoformans клеток органов и капсулы могут быть определены и масках с помощью определенных алгоритмов - называют «рецепты» - включены в программное обеспечение.
3. Использовать «Колонии анализатор (флуоресценции)» рецепт на обращенное изображение для обнаружения и маска тела клетки, а затем нажмите кнопку «Применить». Инвертированное изображение кольцо тьмы, определяющие границы ячейки C. neoformans становится ярче, чем окружающие капсулу.
4. Используйте «Колонии анализатор (флуоресценции)» рецепт на обращенное изображение сегмента C. neoformans клеток тела от их капсулы, а затем нажмите кнопку «Применить». Это создает маску игр. Переименуйте этот Фото Маска «Клетки тела», щелкнув правой кнопкой мыши вкладку «Фото Маска».
   Примечание: Рецепт состоит из нескольких этапов обработки изображений: удаление фона, обнаружения объекта, объект разделения и фильтрация подмножества.
5. Далее использовать «Пролиферации» рецепт на исходное изображение для обнаружения и маска капсулы и нажмите кнопку «Применить». Это создает маску игр. Переименуйте этот Фото Маска «Капсулы», щелкните правой кнопкой мыши вкладку «Фото Маска».
6. С помощью рецепта, «Капсула раздела», создайте новую маску на исходное изображение для разделения смежные капсулы друг от друга. Для этого нажмите «Капсула раздела» в раскрывающемся меню рецепт. В диалоговом окне раздел капсула выберите теперь переименован Фото Маска «Капсулы» (5.5) для региона капсула. Выберите теперь переименован Фото Маска «Клетки тела» для шифрования клетки (5.4). Выберите «Оригинал» для входной канал и «создать маску для секционированные капсулы. Нажмите кнопку «применить
   Примечание: Рецепт генерирует клеток и капсул диаметром, определяется как среднее наименьшим и наибольшим осей, пересекая центр ячейки и капсула и области измерений от обнаружения маски. Найти выход, расположен на вкладке таблицы в этом программном обеспечении. Повторите этот процесс для всех изображений (минимум 50 клеток/группы). Рецепт параметры могут быть настроены для оптимизации обнаружения отдельных изображений или оптимизирован для пакетного обнаружения нескольких изображений. Дополнительные измерения можно рассчитать по рецепту для всеобъемлющей характеристика капсулы по морфологии и ячейки.
7. Экспорт данных в таблицу программного выбора для дальнейшего анализа.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать капсула индукции, окрашивания клеток, изображений и методов измерения, мы использовали три штамма C. neoformans: общей, хорошо изученных лаборатории штамм, H99S³⁰и две клинически изолированные штаммы ранее неизвестные капсула диамет?...

Обсуждение

На протяжении десятилетий капсулы был одним из основных направлений исследований для микологи и клиницисты заинтересованы в C. neoformans и криптококкоз из-за его роль как фактор основных вирулентности возбудителя. С помощью микроскопии для измерения размера капсулы различия штаммов ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)			This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01
6-well plates	Falcon	CL5335-5EA
Shaking incubator	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 incubator	Fisher Scientific		Isotemp
Centrifuge	Thermo Scientific		Legend XTR
Staining
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
India ink	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488			A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)			PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-143
Glass coverslips	Corning	2855-18	#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition
Immersion oil	Cargille	16484
Light microscope with immersion oil objective	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective	Zeiss		LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.
Confocal microscope software	Zen 2009
Confocal microscope camera	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.
Widefield imaging software	Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software	Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement	Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement	Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software	Excel (Microsoft)