Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

Riepilogo

Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.

Abstract

Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.

Introduzione

Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l'agente causativo di dermatosi da criptococco^{1,2, 3}. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia^4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record¹. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente⁷. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti⁸.

Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)⁹. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente^9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi¹¹. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l'ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)¹². La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza^6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.

Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di¹⁵. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell'host ambiente^16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l'esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO₂ sono noti per avviare la crescita capsula^16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un'infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito^21,22. Questo è noto perché l'architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile²³. Dispersione della luce e l'uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari²⁴. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione²³. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell'anticorpo²⁴. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.

Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l'inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l'errore umano può influenzare il risultato.

Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l'analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini ^25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l'interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.

Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell'inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.

Protocollo

Nota: C. neoformans è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) e i ricercatori che lavorano con esso devono prendere le dovute precauzioni. Procedure dettagliate su come sicuro lavoro con agenti patogeni BSL-2 può essere scoperto sul Center for Disease Control (CDC) sito Web, ma è importante notare che tutte le persone che vengono a contatto con il c. neoformans devono essere adeguatamente addestrate nella gestione gli agenti patogeni e dovrebbe sempre indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE), generalmente in lattice o nitrile guanti. Ulteriormente, rotori su centrifughe devono essere sigillati per evitare la nebulizzazione dei campioni e tutte le cadute ripulite immediatamente utilizzando una soluzione di candeggina al 10%²⁸.

1. capsula induzione

Nota: Se non specificato diversamente, tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti a temperatura ambiente.

1. Cultura di c. neoformans in brodo di lievito peptone destrosio (YPD) (pH 6,5 + /-0.2) e incubare a 37 ° C con agitazione fino a quando sono in fase di log (circa 18-36 h).
2. Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a 21 ° C e lavare tre volte con tamponato fosfato salino (PBS).
3. Utilizzare un emocitometro (o un contatore di cellule automatizzato) per contare le celle e risospendere a 2 x 10⁵ cellule/2 mL in media essenziali minimi di Dulbecco (DMEM).
4. Per indurre la capsula, incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ per 18 h.
   Nota: La combinazione di assenza di sostanze nutritive nei media e la presenza di CO₂ stimola la crescita capsula c. neoformans .
5. Post-incubazione, raccogliere le cellule centrifugazione (come sopra) e rimuovendo tutti, ma 5-10 µ l di supernatante. Allo stesso tempo, raccogliere un campione di ONU-indotta delle cellule corrispondenti per ogni sforzo deve essere misurata. Utilizzare questi come controlli negativi.
   Nota: Il pellet cellulare sarà molto piccolo e può essere difficile da vedere. Prestare attenzione quando aspirare il surnatante.
6. Macchiare con l'inchiostro di India (sezione 2.1) o coloranti fluorescenti (sezione 2.2).

2. colorazione

1. Colorazione con solo inchiostro di India
   1. Per macchiare il lievito con l'inchiostro di India, risospendere il pellet nel surnatante restante e aggiungere 4μL (circa metà) della sospensione cellulare e 4μL di inchiostro di China su un vetrino per microscopio. Delicatamente mescolare ed evitare la formazione di schiuma.
   2. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
2. Colorazione con solo le tinture fluorescenti
   1. Per macchiare il lievito con un colorante fluorescente, risospendere il pellet cellulare in 50 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
   2. Incubare la cultura con un volume uguale di Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e capsula mAb 18B7 (Vedi Tabella materiali) coniugato con AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) per 30 min a 37 ° C.
   3. Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a post-incubazione 21 ° C e aspirare il surnatante.
   4. Risospendere le cellule in 10 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
   5. Pipettare 8 µ l di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio.
   6. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
3. Colorazione con inchiostro di China e tinture fluorescenti
   1. Per confrontare più direttamente l'efficacia di inchiostro di India di colorazione a quella di coloranti fluorescenti, co-macchia stessa popolazione cellulare con entrambi i tipi di macchia. A tale scopo, prima di incubare le cellule con una capsula fluorescente e la macchia di parete cellulare, come da procedura 2.2.1 - 2.2.3.
   2. Successivamente, Pipettare volumi uguali (4 µ l) della sospensione cellulare fluorescente macchiato e inchiostro di China su una lastra di vetro. Mescolare delicatamente.
   3. Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.

3. immagine acquisizione/microscopia

1. Cellule di imaging colorato con inchiostro.
   1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a luce standard (ingrandimento 100 X).
   2. Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
      Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo, come questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato). Per questi esperimenti, le immagini sono state acquisite a una profondità di 16 bit con tempi di esposizione ottimizzati per massimizzare il contrasto dell'immagine riducendo al minimo la sfocatura causata da piccoli movimenti delle cellule.
2. Cellule di imaging tinto con coloranti fluorescenti
   1. Per realizzare l'immagine delle cellule mediante microscopia a fluorescenza, aprire il software di imaging di microscopio e selezionare l'appropriato eccitazione e emissione lunghezze d'onda per i fluorofori utilizzati (CFW e AF488 sono eccitati utilizzando il 405nm e 488 nm luci, rispettivamente). Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
   2. Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
      Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo in quanto questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato).
   3. Acquisire una serie di immagini dello stack z delle cellule per garantire che si ottiene il massimo diametro capsula per ogni cella all'interno di un determinato campo.
      1. Del software di controllo del microscopio, fare clic sulla barra "z-stack" per aprire il pannello di controllo "z-stack", quindi selezionare l'opzione "Primo/ultimo" nell'angolo superiore sinistro del pannello.
      2. Utilizzare il controllo di fine-fuoco il microscopio per mettere a fuoco a un livello che è di sotto del punto più largo di una cellula di lievito singolo e le capsule per tutti entro il campo di vista corrente e fare clic su "Primo Set".
      3. Utilizzare il controllo di fine-fuoco per mettere a fuoco sopra il punto più largo del corpo cellulare della cellula stessa e della capsula per tutte le celle all'interno del campo di vista corrente e fare clic su "Imposta l'ultimo".
      4. Quindi, fai clic su "Avviare esperimento" nella scheda "Acquisizione" per acquisire lo z-stack per la posizione corrente. Ripetere il processo in più posizioni fino a quando sono state acquisite immagini dello stack z di un minimo di 50 cellule.
         Nota: Per questi esperimenti, il foro stenopeico confocale è stato impostato su 1.0 AU e una sovrapposizione z-serie di 10-20 fette che coprono 0,7 µM ogni sono stati acquisiti presso le posizioni selezionate. AU = unità arioso.
   4. Successivamente, è possibile convertire ogni serie z-stack in proiezioni di massima intensità (MIP) utilizzando software di analisi di immagine appropriata.
      Nota: La massima intensità a ogni piano dell' immagine impilata²⁹del progetto MIPs. Creazione di MIPs permette di produrre una rappresentazione 2-D di immagini che corrispondono alla massima della cella e capsula diametro all'interno dello stack 3D acquisito.
3. Cellule di imaging macchiato con l'inchiostro di India e tinture fluorescenti
   1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale o widefield (ingrandimento 40x) (63 X o 100 X ingrandimento). Per le cellule colorate con inchiostro di China e tinture fluorescenti, catturare immagini utilizzando un microscopio di widefield equipaggiato con un palco comandato da calcolatore e obiettivo a immersione in olio.
      Nota: Il microscopio in uso dovrebbe essere controllato utilizzando un software di imaging CFW. la fluorescenza che è eccitato attraverso un filtro di eccitazione di 340-380 nm e la luce emessa deve essere rilevata attraverso un filtro di barriera di 435-485 nm riflettuto da uno specchio dicroico 400 nm. AF488 fluorescenza possa essere eccitato attraverso un filtro di eccitazione 465-495 nm, e la luce emessa può essere rilevato attraverso un filtro di barriera 515-555 nm riflettuto da uno specchio dicroico 505 nm.
   2. Immagine un minimo di 50 cellule di ogni metodo di macchiatura per patologia.

4. misura manuale della capsula

1. Per le cellule colorate con inchiostro di China o macchie fluorescenti, utilizzare un software di misurazione di cella al diametro manualmente di capsula e cella di misura (Vedi Tabella materiali). Per fare questo, andare su "File" > "Apri immagine" > "Misura" e utilizzare il cursore per disegnare una linea retta attraverso il punto più largo della cella intera (diametro totale).
2. Successivamente, fare nuovamente clic su "Misura" e disegnare una linea retta attraverso il corpo cellulare (diametro corpo cellulare).
   Nota: Le misure sono salvati automaticamente sulle celle.
3. Ripetere questo processo per tutte le celle (minimo 50/gruppo).
4. Per salvare le immagini una volta che sono misurati, fare clic su "File" > "Salva come" e il nome le immagini in modo appropriato.
5. Selezionare i file appena misurati ed esportare dati in un software di foglio di calcolo.
6. Calcolare il diametro medio capsula utilizzando l'equazione: ([diametro totale] - [Diametro corpo cellulare]).

5. automatici di misurazione della capsula

Nota: Per il successo di misura automatici, utilizzare immagini a 16 bit con un elevato livello di contrasto e che sono correttamente a fuoco insieme a un software di analisi di immagine appropriata (Vedi Tabella materiali). Quando imaging c. neoformans per capsula misurazione, è importante concentrarsi sull'anello scuro al confine tra la parete delle cellule e la capsula. Questo permette al software di delineare correttamente la cella e la capsula.

1. Inverti e creare una copia di tutti i India inchiostro macchiato immagini cellulare utilizzando un appropriato software di fotoritocco (Vedi Tabella materiali). Per effettuare questa operazione, fare clic su "File" > "Apri" per aprire India inchiostro macchiato immagini e quindi su "controllo" + "I" per invertire l'immagine. Fare clic su "File" > "Salva con nome" per salvare l'immagine invertita.
2. Per importare l'originale e invertito immagini nel software, fare clic su "File" > "Importa sequenza" > "Carica immagine" > "Definisci sequenza (manualmente)" > "Dimensioni (canale)" > "Importare" > "Applica".
   Nota: I corpi delle cellule di c. neoformans e capsule possono essere identificati e mascherato utilizzando algoritmi specifici - indicati come 'ricette' - inclusi nel software.
3. Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' l'immagine invertita per rilevare e mascherare il corpo della cella, quindi fare clic su "applica". Nell'immagine invertita, l'anello scuro che definiscono i margini della cella c. neoformans diventa più luminoso della capsula circostante.
4. Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' sull'immagine invertita per segmentare i corpi delle cellule di c. neoformans dalle loro capsule, quindi fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Corpo cellulare" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
   Nota: La ricetta è costituito da più passaggi di elaborazione: sfondo rimozione, rilevamento di oggetti, separazione di oggetto e il filtro di sottoinsieme.
5. Successivamente, utilizzare la ricetta 'Proliferazione' sull'immagine originale per rilevare e mascherare la capsula e fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Capsula" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
6. Utilizzando la ricetta, 'Capsula partizione', creare una nuova maschera sull'immagine originale per partizionare capsule adiacente uno da altro. Per effettuare questa operazione, fare clic su "Capsula partizione" dal menu a discesa di ricetta. Nella finestra di partizione capsula, scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Capsula" (5,5) per capsula regione. Scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Corpo cellulare" per le celle Crypto (5,4). Scegliete "Originale" per il canale di ingresso e "Crea maschera per capsula partizionate. Fare clic su "applica
   Nota: La ricetta crea delle cellule e diametro capsula, definita come la media degli assi più lungo e più breve attraversando il centro della cellula e capsula e misure di zona da maschere di rilevamento. Trovare l'uscita che si trova sotto la scheda di foglio di calcolo in questo software. Ripetere questo processo per tutte le immagini (minimo 50 cellule/gruppo). Parametri di ricetta potrebbero essere sintonizzati per ottimizzare la rilevazione di singole immagini o ottimizzati per il rilevamento di batch di immagini multiple. Ulteriori misurazioni è calcolabile con la ricetta per la completa caratterizzazione della cella e morfologia della capsula.
7. Esportare dati in un software di foglio di calcolo di scelta per ulteriori analisi.

Risultati

Per illustrare la capsula induzione, macchiatura delle cellule, imaging e tecniche di misurazione, abbiamo utilizzato tre ceppi di c. neoformans: ceppo il laboratorio comune, ben caratterizzato, H99S³⁰e due ceppi clinicamente isolati di precedentemente diametro capsula sconosciuto, B18 e B52³¹.

Il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagin...

Discussione

Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l'agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l'agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)			This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01
6-well plates	Falcon	CL5335-5EA
Shaking incubator	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 incubator	Fisher Scientific		Isotemp
Centrifuge	Thermo Scientific		Legend XTR
Staining
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
India ink	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488			A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)			PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-143
Glass coverslips	Corning	2855-18	#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition
Immersion oil	Cargille	16484
Light microscope with immersion oil objective	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective	Zeiss		LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.
Confocal microscope software	Zen 2009
Confocal microscope camera	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.
Widefield imaging software	Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software	Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement	Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement	Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software	Excel (Microsoft)