Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

Résumé

La capsule de polysaccharide est le facteur de virulence primaire à Cryptococcus neoformans, et sa taille est corrélé avec la virulence de la souche. Mesures de diamètre capsule sont utilisées dans les tests phénotypiques et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Une méthode standard d’induction capsule est présentée ici, et on a comparé deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre.

Résumé

La capsule de polysaccharide de Cryptococcus neoformans est le facteur de virulence primaire et un des plus couramment étudié les aspects de cette levure pathogène. Taille de la capsule peut varier considérablement entre les souches, a la capacité de croître rapidement lorsque vorstellen conditions nutritives stressantes ou faibles et a été positivement corrélée avec la virulence de la souche. Pour ces raisons, la taille de la capsule est d’un grand intérêt pour les chercheurs de c. neoformans . La croissance de la capsule de c. neoformans est induite pendant le test phénotypique pour aider à comprendre les effets des différents traitements sur les différences de levure ou de taille entre les souches. Nous décrivons ici une des méthodes standards de capsule induction et comparer deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre de la capsule : (i) de l’encre de Chine, un colorant négatif, utilisé en conjonction avec la microscopie optique conventionnelle et (ii) coloration conjointement avec colorants fluorescents de la paroi cellulaire et capsule suivie par microscopie confocale. Enfin, nous montrons comment la mesure du diamètre capsule des échantillons colorés à l’encre de Chine peut être automatisé en utilisant l’analyse de l’image numérique.

Introduction

Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose^{1,2, 3}. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie^4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne, c. neoformans tue plus de personnes que la tuberculose chaque année et plus chaque mois à une épidémie d’Ebola sur record¹. La voie d’exposition la plus courante se produit à l’inhalation de spores desséchés qui sont monnaie courante dans l' environnement⁷. En entrant dans les poumons, il y a plusieurs facteurs de virulence qui contribuent au succès de c. neoformans chez les individus infectés. La capsule polysaccharidique est considérée comme facteur de virulence primaire de microbe, que capsulée souches non virulentes⁸.

La capsule cryptococcique se compose de trois éléments de principe : glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) et mannoprotéines (MPs)⁹. Alors que les députés sont une composante relativement mineure d’associée à la paroi cellulaire de la capsule, ils sont immunogènes et peuvent favoriser une réponse essentiellement pro-inflammatoire^9,10. En revanche, les GXM et GalXM forment l’essentiel de la capsule (> 90 % en poids) et ont des effets immunosuppressifs¹¹. Outre ses effets immunomodulateurs, l’élargissement rapide de la capsule en vivo crée une barrière mécanique à l’ingestion par l’hôte des cellules phagocytaires (c.-à-d., des neutrophiles et macrophages)¹². La capsule de c. neoformans et sa synthèse sont complexes, mais dans l’ensemble, une augmentation de diamètre capsule est corrélée avec une virulence accrue de^13,6,14. Ceci étant, il est important pour les chercheurs de c. neoformans pouvoir rapidement et précisément quantifier les mesures capsules.

La cellule c. neoformans tant sa capsule de polysaccharide sont des structures dynamiques et montrent des changements au fil du temps¹⁵. La capsule peut changer dans la densité, la taille et l’Assemblée en réponse aux changements dans l’hôte environnement^16,17,18. Faible teneur en fer ou niveaux d’éléments nutritifs, exposition au sérum, le pH physiologique humain et une augmentation du CO₂ sont connus pour ouvrir la capsule croissance^16,18,19,20. En outre, les chercheurs ont montré des changements structurels, ce qui entraîne des différences significatives dans l’immunoréactivité lors d’une infection, prêt un avantage à c. neoformans sur son hôte^21,22. Ceci est connu parce que l’architecture de la capsule de c. neoformans a été analysée dans une variété de façons. Microscopie électronique, par exemple, a révélé que la capsule a une matrice hétérogène avec une couche interne dense aux électrons sous une couche extérieure, plus perméable²³. Diffusion de la lumière et l’utilisation de pinces optiques ont permis aux chercheurs d’élucider davantage ses propriétés macromoléculaires²⁴. Analyse des résultats de ces deux mesures de diffusion de la lumière statique et dynamique, nous savons que la capsule polyosidique a un complexe de la structure ramification²³. Des pinces optiques ont été utilisés pour tester la rigidité de la structure mais aussi à évaluer son anticorps réactivité²⁴. Cependant, l’analyse de loin le plus souvent indépendants de la capsule de c. neoformans est la mesure de sa taille.

Afin de quantifier la taille de la capsule, les chercheurs utilisent ce que devrait être une mesure simple : le diamètre linéaire de la capsule. Microscopes numériques sont utilisées pour capturer des images de plusieurs cellules de c. neoformans (généralement des centaines) colorés avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents. La taille de chaque corps cellulaire et de la capsule environnante est mesurée. Les données sont compilées, et le diamètre moyen de la capsule est calculé en soustrayant le diamètre du corps cellulaire du diamètre à germes entiers (corps cellulaire + capsule). Jusqu'à présent, ces mesures ont été faites manuellement. Bien que généralement exacte, cette méthode a des inconvénients pour les chercheurs. Ensembles de données volumineux peut prendre des jours ou même des semaines pour analyser à la main. Et parce que ces mesures sont effectuées manuellement, la subjectivité et l’erreur humaine peuvent affecter le résultat.

Analyse d’image informatique automatisé est devenu un outil indispensable pour les chercheurs dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire, permettant une analyse plus rapide et plus fiable des images biologiques ^25,26,27. Techniques d’analyse précise de l’image sont nécessaires pour extraire des informations quantitatives de ce qui sont souvent des ensembles de données complexes et immenses. Toutefois, certaines mesures, notamment la mesure de la capsule de c. neoformans , été difficiles à automatiser. Identifier avec précision l’interface entre la paroi cellulaire et de la capsule, qui apparaît généralement comme un anneau sombre lorsqu’imagée par microscopie à contraste de phase, peut être gênante résoudre à l’aide d’un simple seuil. En outre, les cellules en culture de c. neoformans ont tendance à s’agglomérer et segmentation précise des cellules est nécessaire pour des mesures précises.

Ce projet vise à (i) illustrent un des protocoles standards pour capsule induction dans c. neoformans, (ii) comparer et contraster l’encre de Chine et coloration de fluorescence en ce qui concerne pour capsule mesures de diamètre, (iii) développer simple, méthodes de calcul pour mesurer le diamètre capsule à l’aide d’images d’encre teinté de cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse image et, (iv) évaluent les avantages et les limites de mesure diamètre capsule manuellement et à l’aide d’automation de logiciel. Nous conclure que les deux méthodes de coloration, fluorescent d’étiquetage de la paroi cellulaire et de la capsule, alors que plus de temps, a fourni les résultats les plus cohérents entre les expériences. Toutefois, les deux méthodes nous a permis de distinguer avec succès entre le laboratoire et clinique c. neoformans souches présentant différents capsule tailles. En outre, nous avons pu automatiser la mesure du diamètre capsule de l’encre de Chine coloré des images et trouvé que c’était une alternative viable à la mesure manuelle de la capsule.

Protocole

Remarque : C. neoformans est un pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et les chercheurs qui travaillent avec elle doivent prendre des précautions appropriées. Des procédures détaillées sur comment à en toute sécurité travail avec BSL-2 pathogènes se trouvent sur le Center for Disease Control (CDC), site Web, mais il est important de noter que toutes les personnes entrant en contact avec c. neoformans soient correctement formés à la manipulation agents pathogènes et doivent toujours porter approprié équipement de protection individuelle (EPI), généralement au latex ou des gants en nitrile. En outre, rotors sur les centrifugeuses doivent être étanches pour empêcher l’aérosolisation des échantillons et les renversements nettoyés immédiatement à l’aide d’une solution de 10 % de Javel²⁸.

1. capsule Induction

Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées à la température ambiante à moins d’indication contraire.

1. La culture de c. neoformans dans un bouillon de dextrose (DPJ) levure peptone (pH 6.5 +/-0,2) et incuber à 37 ° C sous agitation, jusqu'à ce qu’ils soient en phase logarithmique (environ 18-36 h).
2. Centrifuger à 870 x g pendant 5 min à 21 ° C, les cellules et laver trois fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
3. Utilisez un hémocytomètre (ou un compteur de cellules automatisées) pour compter les cellules et remettre en suspension à 2 x 10⁵ cellules/2 mL dans les milieu essentiels minimal de Dulbecco (DMEM).
4. Pour induire la capsule, incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 18 h.
   Remarque : La combinaison de l’absence d’éléments nutritifs dans les médias et la présence de CO₂ stimule la croissance de capsule de c. neoformans .
5. Après incubation, récolter les cellules par centrifugation (comme ci-dessus) et en enlevant tout sauf 5 à 10 µL surnageant. Dans le même temps, récolter un échantillon non-induite de cellules correspondant pour chaque souche à mesurer. Utilisez-les comme témoins négatifs.
   Remarque : Les boulettes de cellule seront très faible et peuvent être difficiles à voir. Soyez prudent lors de l’aspiration du liquide surnageant.
6. Coloration à l’encre de Chine (Section 2.1) ou des colorants fluorescents (Section 2.2).

2. la coloration

1. Coloration à l’encre de Chine seulement
   1. Pour souiller la levure avec l’encre de Chine, resuspendre le culot dans le surnageant restant et ajouter 4μL (environ la moitié) de la suspension cellulaire et 4μL d’encre sur une lame de microscope de verre. Doucement, mélanger et éviter la formation de mousse.
   2. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.
2. Coloration avec uniquement des colorants fluorescents
   1. Pour souiller la levure avec un colorant fluorescent, resuspendre le culot dans 50 µL PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
   2. Incuber la culture avec un volume égal de Calcofluor blanc (CFW) (1 µg/mL) et 18B7 capsule mAb (voir Table des matières) conjugué à la AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) pendant 30 min à 37 ° C.
   3. Centrifuger à 870 x g pendant 5 min à 21 ° C après incubation des cellules et aspirer le surnageant.
   4. Resuspendre le culot dans 10 µL de PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
   5. Distribuer 8 µL de suspension cellulaire sur une lame de microscope de verre.
   6. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.
3. La coloration à l’encre de Chine et colorants fluorescents
   1. Pour comparer plus directement l’efficacité de l’encre de Chine de coloration à celle des colorants fluorescents, co tacher la même population de cellules avec les deux types de taches. Pour ce faire, tout d’abord Incuber les cellules avec une capsule fluorescent et teinté de paroi cellulaire, comme par les Etapes 2.2.1 - 2.2.3.
   2. Ensuite, distribuer des quantités égales (4 µL) de la suspension cellulaire fluorescent tachées et encre de Chine sur une lame de verre. Mélanger doucement.
   3. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.

3. image Acquisition/microscopie

1. Imagerie de cellules colorées avec l’encre de Chine.
   1. Acquisition d’images à l’aide d’un microscope optique standard (grossissement de X 100).
   2. Un minimum de 50 cellules / état de l’image.
      Remarque : Le nombre de cellules par champ variera, et cela est acceptable. Il est important, cependant, les cellules de ce chevauchement être réduites au minimum, car ceux-ci sont difficiles à mesurer (manuellement ou avec un logiciel automatisé). Pour ces expériences, les images ont été acquises à une profondeur de 16 bits avec des durées d’exposition optimisées pour maximiser le contraste de l’image tout en réduisant le flou causé par les petits mouvements des cellules.
2. Imagerie de cellules colorées avec les colorants fluorescents
   1. Pour les cellules d’images en microscopie à fluorescence, ouvrez le microscope logiciel d’imagerie et sélectionnez les approprié longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour les fluorophores utilisés (CFW et AF488 sont excités à l’aide de la 405nm et 488 nm lumières, respectivement). Acquisition d’images à l’aide d’un microscope à fluorescence.
   2. Un minimum de 50 cellules / état de l’image.
      Remarque : Le nombre de cellules par champ variera, et cela est acceptable. Il est important, cependant, les cellules de ce chevauchement être réduites au minimum, car ceux-ci sont difficiles à mesurer (manuellement ou avec un logiciel automatisé).
   3. Acquérir une série d’image z-pile des cellules pour s’assurer que le diamètre maximal de capsule pour chaque cellule dans un domaine donné.
      1. Dans le logiciel de contrôle de microscope, cliquez sur la barre de « z-pile » pour ouvrir le panneau de configuration « z-pile », puis sélectionnez l’option « Première/dernière » dans le coin supérieur gauche du panneau.
      2. Utilisez le contrôle de l’amende-focus sur le microscope se concentrer à un niveau qui est en dessous du point le plus large d’une cellule de levure simple et les capsules pour tous dans la champ de vue actuel, puis cliquez sur « Définir d’abord ».
      3. Utilisez le contrôle de la mise au point fine pour discussion au-dessus du point le plus large du corps cellulaire de la même cellule et de la capsule pour toutes les cellules dans le champ de vue actuel et cliquez sur « Set ».
      4. Puis, cliquez sur « Commencer l’expérience » sur l’onglet « Acquisition » d’acquérir la z-pile pour la position actuelle. Répétez le processus à plusieurs positions jusqu'à ce que z-empiler les images d’un minimum de 50 cases ont été acquis.
         Remarque : Pour ces expériences, le trou d’épingle confocal était égale à 1.0 UA et un z-series qui se chevauchent de 10 à 20 tranches couvrant 0,7 µM de chaque ont été acquises à la position souhaitée. UA = unité aérée.
   4. Ensuite, convertissez chaque série z-pile dans les projections de l’intensité maximale (MIP) à l’aide de logiciels d’analyse image appropriée.
      NOTE : MIPs du projet la plus grande intensité à chaque plan de l' image empilées²⁹. Création de MIPs permet de produire une représentation 2D des images qui correspondent à la cellule maximale et la capsule diamètre dans la pile 3D capturée.
3. Imagerie de cellules colorées avec l’encre de Chine et colorants fluorescents
   1. Acquisition d’images avec un microscope confocal widefield (grossissement de 40 X) ou (63 X ou à grossissement X 100). Pour cellules colorées avec l’encre de Chine et colorants fluorescents, capturer des images à l’aide d’un microscope widefield avec une scène contrôlée par ordinateur et un objectif à immersion d’huile.
      Remarque : Le microscope utilisé doit être contrôlé à l’aide d’un logiciel d’imagerie CFW. fluorescence qui est excité par un filtre d’excitation de 340-380 nm et émis lumière devrait être détecté à travers un filtre de barrière 435-485 nm réfléchi par un miroir dichroïque 400 nm. AF488 fluorescence peut être excité à travers un filtre d’excitation 465-495 nm, et la lumière émise peut être détectée par un filtre de barrière 515-555 nm réfléchi par un miroir dichroïque 505 nm.
   2. Un minimum de 50 cellules / condition pour chaque méthode de coloration de l’image.

4. Manuel mesure de Capsule

1. Pour les cellules colorées avec l’encre de Chine ou taches fluorescentes, utiliser un logiciel de mesure portable manuellement mesure capsule et cellule de diamètre (voir Table des matières). Pour ce faire, allez dans « Fichier » > « Ouvrir l’Image » > « Mesure » et utiliser le curseur pour dessiner une ligne droite passant par le point le plus large de la cellule entière (diamètre total).
2. Ensuite, cliquez de nouveau sur « Mesure » et dessiner une ligne droite à travers le corps de la cellule (diamètre de corps de la cellule).
   Remarque : Les mesures sont auto-enregistrés sur les cellules.
3. Répétez ce processus pour toutes les cellules (minimum de 50/groupe).
4. Pour sauvegarder les images une fois qu’ils sont mesurés, cliquez sur « Fichier » > « Enregistrer sous » et de nommer les images correctement.
5. Sélectionnez les fichiers nouvellement mesurés et exporter des données vers un tableur.
6. Calculer le diamètre moyen de capsule à l’aide de l’équation : ([Diamètre total] - [diamètre corps cellulaire]).

5. automatisé de mesure de la Capsule

Remarque : Pour la mesure automatisée avec succès, utilisez des images 16 bits avec un haut niveau de contraste et qui portent bien avec un logiciel d’analyse image approprié (voir la Table des matières). Lorsque c. neoformans d’imagerie pour la mesure de capsule, il est important de se concentrer sur l’anneau sombre à la limite entre la paroi cellulaire et de la capsule. Cela permet au logiciel de délimiter correctement la cellule et la capsule.

1. Inverser et créer une copie d’encre toutes colorées des images de cellules à l’aide d’un logiciel de retouche d’image approprié (voir la Table des matières). Pour ce faire, cliquez sur « Fichier » > « Ouvrir » pour ouvrir l’encre de Chine coloré des images et puis « Control » + « I » pour inverser l’image. Cliquez sur « Fichier » > « Enregistrer sous » pour enregistrer l’image inversée.
2. Pour importer l’original et inversé les images dans le logiciel cliquez sur « Fichier » > « Importer la séquence » > « Load Image » > « Définir des séquences (manuellement) » > « Dimensions (canal) » > « Importer » > « Appliquer ».
   Remarque : Les corps cellulaires c. neoformans et les capsules peuvent être identifiés et masqués à l’aide d’algorithmes spécifiques - dénommés « recettes » - inclus dans le logiciel.
3. Utilisez la recette de la « Colonie Analyzer (Fluorescence) » sur l’image inversée de détecter et de masquer le corps cellulaire, puis cliquez sur « appliquer ». Dans l’image inversée, l’anneau sombre définissant la limite de la cellule c. neoformans devient plus lumineux que la capsule environnante.
4. Utilisez la recette de la « Colonie Analyzer (Fluorescence) » sur l’image inversée pour segmenter les corps cellulaires de c. neoformans de leurs capsules, puis cliquez sur « appliquer ». Cela crée un masque de comte. Renommez ce masque comte « Corps cellulaire » par un clic droit sur l’onglet « masque de comte ».
   NOTE : La recette se compose de plusieurs étapes de traitement d’image : suppression, détection d’objet, séparation de l’objet et le filtrage de sous-ensemble de fond.
5. Ensuite, utilisez la recette de « La prolifération des cellules » sur l’image d’origine pour détecter et masquer la capsule et cliquez sur « appliquer ». Cela crée un masque de comte. Renommez ce masque comte « Capsule » en cliquant droit sur l’onglet « masque de comte ».
6. À l’aide de la recette, « Capsule Partition », créez un nouveau masque sur l’image originale pour partitionner des capsules adjacents l’un de l’autre. Pour ce faire, cliquez sur « Capsule Partition » dans le menu déroulant de recette. Dans la boîte de Partition de Capsule, choisissez le masque du comte rebaptisé « Capsule » (5.5) pour la région de la Capsule. Choisir le masque du comte rebaptisé « Corps cellulaire » pour les cellules de Crypto (5.4). Choisissez « Original » pour le canal d’entrée et « Create Mask pour Capsule partitionné. Cliquez sur « appliquer
   NOTE : La recette génère des cellules et diamètre capsule, définie comme la moyenne des plus longues et la plus courtes axes traversant le centre de la cellule et la capsule et les mesures de surface des masques de détection. Trouver la sortie qui se trouve sous l’onglet de la feuille de calcul dans ce logiciel. Répétez ce processus pour toutes les images (minimum de 50 cellules/groupe). Paramètres de la recette pourraient être à l’écoute afin d’optimiser la détection des images individuelles ou optimisés pour la détection par lots de plusieurs images. Mesures supplémentaires peuvent être calculées par la recette pour la caractérisation complète de la cellule et la morphologie de la capsule.
7. Exporter des données vers un tableur de choix pour une analyse ultérieure.

Résultats

Pour illustrer la capsule induction, coloration de la cellule, imagerie et techniques de mesure, nous avons utilisé trois souches de c. neoformans : souche le laboratoire commun, bien caractérisé, H99S³⁰, ainsi que deux souches isolées sur le plan clinique de précédemment diamètre capsule inconnue, B18 et B52³¹.

Le workflow de capsule induction, coloration et acqui...

Discussion

Pendant des décennies, la capsule a été un élément majeur de la recherche pour les mycologues et les cliniciens intéressés par c. neoformans et cryptococcose en raison de son rôle comme un facteur de virulence important pour l’agent pathogène. En utilisant la microscopie à mesurer les différences dans la taille de la capsule entre les souches et en vertu de la croissance de différente conditions peuvent fournir des informations importantes concernant l’agent pathogène et ses réponses aux divers...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)			This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01
6-well plates	Falcon	CL5335-5EA
Shaking incubator	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 incubator	Fisher Scientific		Isotemp
Centrifuge	Thermo Scientific		Legend XTR
Staining
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
India ink	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488			A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)			PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-143
Glass coverslips	Corning	2855-18	#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition
Immersion oil	Cargille	16484
Light microscope with immersion oil objective	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective	Zeiss		LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.
Confocal microscope software	Zen 2009
Confocal microscope camera	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.
Widefield imaging software	Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software	Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement	Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement	Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software	Excel (Microsoft)