שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Summary

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.

Introduction

חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה^1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו^5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.

דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימיקלים. אחד הגורמים העיקריים של דלקת ריאות nosocomial הוא החיידק Pseudomonas aeruginosa. Aeruginosa פ הוא אורגניזם גראם שליליים המשתמשת מערכת הפרשת סוג III להעברת מולקולות אפקטור שונים, הנקרא exoenzymes, ישירות אל הציטופלסמה של היעד תאים^7,8. במהלך זיהום של תאי אנדותל הריאות, exoenzymes המטרה חלבונים תאיים שונים, לרבות צורת אנדותל הקשורים microtubule חלבון טאו^9,10,11,12 , המוביל אל המכשול אנדותל התמוטטות וכתוצאה מכך בצקת ריאות חמורה, ירד תפקוד ריאתי ומוות, לעיתים קרובות,.

כאמור, חולים ששרדו ריאות הראשונית רוממתם שיעורי התמותה ב-12 החודשים הראשונים לאחר הפרשות חולים. מנגנון פוטנציאליים על ההסבר לתופעה זו הוא כי סוג כלשהו של רעל מאריכים נוצר במהלך זיהום ראשוני שמוביל לתוצאות המסכן. שתי תצפיות תומכים האפשרות הזו. ראשית, בתרבית ריאתי אנדותל תאים שטופלו בתחילה aeruginosa פ להיכשל להתרבות במשך שבוע לאחר החיידקים מומתים על ידי אנטיביוטיקה¹³. שנית, מאריכים prions וסוכנים עם מאפיינים פריון הוכחו מחלות האדם ושל בעלי החיים השונים, בעיקר מחלות הקשורות למערכת העצבים ה-^14,15.

שיטות לבחינת פוטנציאל הייצור של סוכנים ציטוטוקסיות חיים ארוכים במהלך זיהום ריאתי לא תוארו. כאן סדרה של מבחני פשוטה במבחנה מתוארים שניתן להשתמש בו עבור חוקרים cytotoxin ייצור ופעילות בעקבות זיהום באמצעות סוכן גורם משותף דלקת ריאות, aeruginosa פ. מבחני אלה צריך להיות להתאמה בקלות לחקור אינדוקציה cytotoxin אפשרי בעקבות זיהום באמצעות חומרים אחרים הגורמים לדלקת ריאות, supernatants שנוצרו גם צריך להיות שימושי עבור חוקרים תופעות של cytotoxins כולה איברים או בעלי חיים. בסופו של דבר, מבחני המפורטות כאן ככל הנראה תהיה יכולת הסתגלות כדי לבדוק נוזלים ביולוגיים בעלי חיים ועל האדם לייצור cytotoxins במהלך דלקת ריאות.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נבחנו, אושרה על ידי גופים מוסדיים ועדת אכפת לי חיה של אוניברסיטת דרום אלבמה, בוצעו בהתאם לתקנות הפדרלי, המדינה, והמקומיים כל. תרבויות העיקרי של עכברוש microvascular אנדותל תאי הריאות (PMVECs) התקבלו מהמתקן תא תרבות הליבה במרכז אוניברסיטת דרום אלבמה עבור ריאות ביולוגיה. תאים הוכנו באמצעות הליכים שתואר לעיל¹⁶.

1. דור של Supernatants ציטוטוקסיות

הערה: כאן, אנו משתמשים שני זנים שונים של aeruginosa פ: PA103, הכולל מערכת הפרשת השלישי סוג שלם מסוגל להעביר את exoenzymes ExoU, ExoT לתאי המטרה במהלך זיהום, ∆PcrV, אשר חסרה סוג מערכת הפרשת השלישי היא לא מסוגל העברת exoenzymes לתאי המטרה בעקבות חיסון.

1. פסים חיידקים על פלטות אגר ווגל-בונר (VB)¹⁷ ולגדול בן לילה ב 37 º C.
   1. כדי להכין צלחות, להפוך את הפתרון מניות הבא (פוגל-בונר מלחי; מניות x 10): למדוד דור 2 MgSO₄, 20 גרם חומצה ציטרית (חומצה חינם), 100 גרם K₂PO₄ו₂פו ' NaH 35 g '₄. להוסיף ddH₂O 1 ליטר, תא לחץ למשך 15 דקות עם פליטה איטי.
   2. הניחו 7.5 גר' אגר 450 מ ל ddH₂O ואת אוטוקלב כמפורט לעיל.
   3. בעקבות autoclaving, מקום שני פתרונות לתוך אמבט מים 50 ° C להתקרר.
   4. להוסיף 50 מ של x VB 10 מניות תמיסת מלח אגר.
   5. הוספת carbenicillin µg 400/mL (עבור הזנים של aeruginosa פ בשימוש) ומערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון.
   6. מקום 5 מ"ל של הפתרון אגר VB לתוך מנות בודדות תרבות סטרילי, לאפשר את אגר לחזק ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד היום של זריעת חיידקים.
   7. ביום של זריעת חיידקים, לחמם צלחת 37 מעלות, ואז לרוץ בעירום חיידקים על צלחת באמצעות לולאה סטרילי. המקום הצלחת ב חממה 37 ° C בלילה
2. לאמת PMVEC טוהר על ידי צביעת חיובית עם פלורסנט Griffonia simplicifolia לקטין, צביעת שלילי עם פלורסנט סליל pomatia לקטין (סמן תאי אנדותל עורקי). התאים aliquot, ההקפאה של חנקן נוזלי.
3. לניסויים, לשמור על תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית, לגדל תאים חממה 37 ° C המכילה 5% CO₂. להשתמש תאים פסוקים 5-15.
   1. בדור של supernatants ציטוטוקסיות, לוחית רישוי 2 x 10⁶ תאים בודדים 150 ס"מ מנות ולגדול 3-4 ימים עד למפגש מושגת. השתמש שתי צלחות לכל ניסוי (ראו להלן).
   2. לניתוח של supernatants ציטוטוקסיות, צלחת צלחת עונה 1 פרק 10⁵ תאים לתוך בארות בודדים של 6-באר ולגדול במשך ארבעה ימים עד למפגש מושגת.
4. כדי לייצר תגובת שיקוע, לשטוף את אחת המנות שני 150 ס"מ של PMVECs מ שלב 1.3.1 בתמיסת באגירה פוספט, trypsinize, ואז לספור את התאים (אנחנו להשתמש מונה הניתן תא אוטומטית, בצע את הפרוטוקול של היצרן; ראה טבלה של חומרים). לשטוף את הצלחת אחרים של PMVECs מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), ואז להדביק עם גם מזן aeruginosa פ -ריבוי של זיהום (MOI) של 20:1. זו מושגת כדלקמן:
   1. עבור aeruginosa פ, כמנת₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL. כדי להכין את הדילול, להוסיף 1 מ"ל HBSS cuvette חד פעמיות 1 מ"ל. לגרד מספיק חיידקים ממני הצלחת זה הוכן בשלב 1.1 עד OD₅₄₀ של 0.25 מושגת כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. השלב הבא יספק חישוב של כמה יהיה צורך חיידקים.
   2. אחרי מספר PMVECs בצלחת תרבות (שלב 1.4 לעיל), לקבוע את המספר המתאים של חיידקים כדי להוסיף למנה השנייה, אי-trypsinized תרבות המכיל את PMVECs. לדוגמה, אם נקבע כי המנה התרבות של PMVECs מכיל 1.3 x 10⁷ תאים, אז היכונו 1.3 x 10⁷ תאים x 20 חיידקים/תא x 1 mL/2 x 10⁸ CFUs = 1.3 mL חיידקים.
   3. לדלל mL 1.3 של חיידקים לתוך HBSS נפח סופי של 20 מ ל, כך השטח כולו של מנה 150 ס"מ יכול להתכסות בנוזלים, ולאחר מכן להוסיף את החיידקים מדולל לצלחת של PMVECs.
   4. דגירה PMVECs מחוסן עם החיידק ב 37 ° C בחממה₂ CO 5% עבור 4-5 שעות, עד פערים ניתן לראות מתבצעת טפט התא כאשר הצלחת נצפית ברמה המיקרוסקופית (ראה איור 1 עבור רמה נאותה של היווצרות פער).
   5. לאסוף את תגובת שיקוע ולאחר מכן צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,000 ומפרידה שולחן כדי להסיר את הלכלוך הסלולר.
      הערה: כל צנטריפוגה מלמעלה בטבלה מסוגל g מספיק ביצירת לכפות הצניפה unlysed תאים, תא גדול שברי יכול לשמש בשלב זה.
   6. שופכים את תגובת שיקוע לתוך מזרק בעל מסנן 0.2 µm מחוברת לקצה, ואז לעבור את תגובת שיקוע דרך המסנן כדי להסיר חיידקים.
   7. השתמש של aliquot של תגובת שיקוע סטרילי כדי לבדוק את cytotoxicity (ראה 2.1) ומקפיאים את שאר תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

2. ניתוח של Supernatants ציטוטוקסיות

1. Cytotoxicity Assay
   1. לגדול PMVECs במנות 6-ובכן עד למפגש. שטיפת בארות פעם עם HBSS, לאחר מכן להוסיף 1.5 מ של תגובת שיקוע מחוטא-מסנן (שנאסף או תאים PA103 - או ∆PcrV-מחוסן) וולס בודדים. להוסיף HBSS סטרילי טוב אחרת כפקד שלילי.
   2. למקם את הצלחת לתוך החממה₂ CO עבור h 21-24, ולאחר מכן לצפות עבור תא הרג/cytotoxicity (ראה שלב הבא). להשתמש supernatants כי התערוכה cytotoxicity לניסויים נוספים, ולמחוק את אלה שאינם מציגים תא ההרג.
   3. כימות של הרג תא
      1. מדד לקטאט דהידרוגנאז (LDH) שחרור תאים מתים באמצעות ערכות Assay LDH זמינים מסחרית של היצרן המליץ הליכים.
      2. לחלופין, לכמת הרג תא ברמה המיקרוסקופית באמצעות תוכנת ImageJ. בשביל זה, להקליט תמונות מיקרוסקופיות ותחומי המנה תרבות המכיל תאים שלמים, ואז לכמת אזורי חסר תאים (מעיד על מוות של תאים ב- טפט) באמצעות מאקרו ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) (ראה הקבצים המשלימים קידוד מותאם אישית ). אם רצונך בכך, לבצע את השלבים מאקרו באופן ידני כפי שמוצג להלן:
         1. קלט תמונות (בפורמט RGB או Tiff) לתוך המאקרו ולהתאים בניגוד ל- 15% רווי פיקסלים. לשכפל תמונות חדות מנוכים ולבצע את הפקודה "לחסר רקע" כדי לקבל תמונה בחדות גבוהה של שטח התא והן את הפער בתוך שדה הראייה.
         2. להחסיר את התמונה הזו התמונה המקורית ולשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית באמצעות המחשבון תמונת הפונקציה "AND". להמיר את התמונה הנובעת שחור (רווחים) ומסכת לבן (תאים) עם הפונקציה הסף (מינימום 0, מקסימום 5), השתמש בפונקציה "בינארי לשחוק את" כדי להסיר רעש מתוך התמונה.
         3. למדוד את היחס בין שחור לבן פיקסלים בתוך התמונה תוצאות המדידה "אזור השבר". מגרש ולבטא את אזורי החלקי עבור כל נקודת זמן הטיפול אחוזים של אזור מרווח מקסימלי.
         4. אמצעים לחשב ולהשוות באמצעות חד-כיווני אנובה עם מבחן לאחר הוק של Tukey, עם ערכי p פחות מ- 0.05 נחשב משמעותי.
   4. השתמש immunoblot ניתוח להקים הנוכחות של עמילואיד, טאו oligomeric Aβ התרבות supernatants. לבצע ניתוח immunoblot באמצעות הליכים סטנדרטיים^10,11,12, מלבד ריכוז supernatants התרבות 10-fold לפחות לפני אלקטרופורזה.
      1. להתרכז תגובת שיקוע, מקום 1-2 מ של תגובת שיקוע לתוך יחידה מסנן צנטריפוגה ממברנה אשר יש ניתוק של משקל מולקולרי של 10 kDa. אז, במקום יחידת מסנן לתוך צנטריפוגה מלמעלה בטבלה צנטריפוגה-2,000 x g עד מידת הריכוז הנדרש מושגת (בד כ 45-60 דקות).
      2. לקבוע את כמות חלבון מרוכז supernatant¹¹ , לטעון כמויות שוות של מדגמים לתוך בארות בודדים של הג'ל.
      3. לבדוק תרביות, להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה ולאחר מכן בדיקה שהכלים עם נוגדן נגד עמילואיד A11, נוגדן אנטי oligomeric טאו T22 או נוגדן anti-Aβ MOAB2 ואחריו נוגדנים משניים המתאים. לפתח את שהכלים באמצעות הליכים chemiluminescence רגיל.
   5. כדי לבצע thioflavin T Assay, השתמש thioflavin T קרינה פלואורסצנטית (ThT) לכמת amyloids ב supernatants. עבור מדידות אלה, השתמש supernatants עיקור-מסנן.
      1. להכין פתרון מניות (50 x) של thioflavin T על ידי השעיית 8 מ ג thioflavin T (ThT) לתוך 10 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). לאחר ערבוב, לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר חלקיקים.
      2. למדידות, להוסיף µL 20 מניות ThT 1 מ"ל של PBS ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל. למקם את הדגימה מדוללת spectrofluorimeter.
      3. למדוד פליטת קרינה פלואורסצנטית בסיסית באמצעות עירור nm 425 וסריקה של פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 450-575 nm במרווחים של 2 ננומטר.
      4. בצע סריקה זמן לשגות באמצעות עירור nm 425 ונרכשה 482 פליטה ננומטר, עם נתונים כל 0.2 s 60 s.
      5. ה-20 הראשונית s של הסריקה זמן לשגות מודד קרינה פלואורסצנטית ב cuvette ריק. בגיל 20 s, להשהות את הסריקה ולהוסיף 10 µL של תגובת שיקוע עיקור מסנן cuvette. לערבב את cuvette על ידי היפוך ולאחר מכן מקם חזרה spectrofluorimeter.
      6. לחדש את הסריקה מבוססי-זמן, רכישת ה-40 הסופי s של נתונים.
      7. עם סיום הסריקה זמן לשגות, בצע סריקה ספקטרום פליטה פלורסצנטיות הסופי באמצעות הגדרות זהות, כמפורט 2.1.5.3.

תוצאות

Assay פשוטה במבחנה פותחה כדי assay לנוכחות של cytotoxins ב supernatants של תאים נגועים החיידק aeruginosa פ. בעיקרון, האמצעי התרבות תאים נגועים נאסף 4 שעות לאחר תוספת חיידקים, החיידקים יוסרו על ידי מסנן עיקור של התרבות supernatant, ואז תגובת שיקוע סטרילי מתווסף אוכלוסיה חדשה של תאים. התאים ?...

Discussion

. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277