방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

요약

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

초록

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

서문

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전^1,을 따르는 달에서 사망률 높은^2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기^5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.

폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀^7,8의 세포질에 직접 되 나 다양 한 이펙터 분자 전송 유형 III 분 비 시스템을 사용 하는 그램 음성 유기 체 이다. 폐 내 피 세포의 감염, 동안에 exoenzymes 대상 microtubule 관련 단백질 타우^{9,,1011,12의 내 피 형태를 포함 하 여 다양 한 세포내 단백질} , 폐 기능 그리고, 때때로, 죽음 감소 심각한 폐 부 증의 결과로 내 피 장벽 붕괴에 지도.

앞에서 설명 했 듯이, 초기 폐 렴을 생존 하는 환자의 병원 방전에 따라 첫 12 개월에 사망률 높은 있다. 이 현상을 설명 하는 잠재적인 메커니즘은 빈약한 장기 결과 리드 초기 감염 시 생성 되는 장 독 소의 일부 형식을. 두 가지 관찰이이 가능성을 지원합니다. 첫째, 교양 폐 내 피 세포 처음 P. 농 균 으로 취급 되는 박테리아는 항생제¹³에 의해 사망 후 주일 대에 실패 합니다. 둘째, 수명이 긴 prions 및 에이전트 프리온 특성을 가진 다양 한 인간과 동물 질환, 신 경계^14,15와 관련 된 질병 특히 입증 되었습니다.

폐 감염 시 수명이 긴 세포 독성 대리인의 잠재적인 생산을 조사 하기 위한 방법 적 설명 했습니다. 일련의 간단한 체 외에서 분석 설명 되어 있습니다 여기 cytotoxin 생산 및 사용 하는 일반적인 폐 렴 원인이 에이전트, P. 녹 농 균감염 다음 활동 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 실험 조사 가능한 cytotoxin 유도 감염 원인이 폐 렴, 다른 에이전트를 사용 하 여 다음에 쉽게 적응할 수 있어야 하 고 또한 생성 된 supernatants 전체에서 cytotoxins의 효과 조사 하는 데 유용 해야 기관 또는 동물입니다. 마지막으로,는 여기에 설명 된 가능성이 가장 분석 실험 동물 및 인간의 생물 학적 체액 폐 렴 중 cytotoxins의 생산을 위한 테스트에 적응할 수 있을 것입니다.

프로토콜

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차¹⁶를 사용 하 여 준비 되었다.

1입니다. 세포 독성 Supernatants의 세대

참고: 여기, 우리가 피 녹 농 균의 두 가지 변종이 사용: PA103 그대로 유형 III 분 비 시스템이 감염, 및 ∆PcrV는 유형 III 분 비 체계 부족 하는 동안 대상 셀에 ExoU 및 ExoT exoenzymes를 전송할 수 있는 접종을 다음 대상 셀에 exoenzymes 전송의 능력이.

1. 보 글 보 너 (VB) 한 천 격판덮개¹⁷ 에 박테리아를 행진 하 고 37 ° c.에 하룻밤 성장
   1. 접시를 준비 하려면 확인 다음 재고 솔루션 (보 글 보 너 염; 10 x 주식): 2 세대 MgSO₄, 20 g 구 연산 (자유로운 산), 100 g K₂포₄및 35 g NaH₂포₄측정. 1 L와 느린 배기 15 분 압력솥 ddH₂O를 추가 합니다.
   2. 450 mL ddH₂O 한 천 7.5 g와 압력솥 위와 같이 배치 합니다.
   3. 압력가 마로 소독, 다음 두 솔루션을 50 ° C 물 목욕으로 놓습니다.
   4. 천 하 10 x VB 재고 소금 솔루션 50 mL를 추가 합니다.
   5. 400 µ g/l (사용 중인 피 녹 농 균 의 변종)에 carbenicillin를 추가 하 고 플라스 크를 소용돌이로 잘 섞어.
   6. 장소 5 mL 개별 멸 균 문화 요리에 VB agar 솔루션의 응고, 및 다음 세균성 시드의 날 때까지 4 ° C에서 저장 한을 수 있습니다.
   7. 세균성 시드 날, 미리 37 ° C에 접시를 따뜻하게 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 격판덮개에 박테리아를 행진 합니다. 장소는 37 ° C 배양 기에서 접시 하룻밤.
2. 형광 Griffonia simplicifolia 와 긍정적인 얼룩에 의해 PMVEC 순도 확인 lectin 및 형광으로 부정적인 얼룩이 지기 나선 pomatia lectin (동맥 내 피 세포에 대 한 표식). Aliquot 세포와 동결에 액체 질소입니다.
3. 실험, 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10% 태아 둔감 한 혈 청, 보충을 유지 하 고 5% CO₂를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 세포 성장. 세포를 사용 하 여 구절 5-15에서.
   1. 세포 독성 supernatants의 생성, 2 x 10⁶ 셀 개별 150 cm 요리에 접시 및 합류 달성 될 때까지 3-4 일에 대 한 성장. 실험 (아래 참조) 당 두 접시를 사용 합니다.
   2. 세포 독성 supernatants의 분석, 대 한 6-잘의 개별 우물으로 플레이트 1 x 10⁵ 셀 접시 하 고 4 일 합류 달성 될 때까지 성장 한다.
4. 상쾌한 생산, 세척 단계 1.3.1 인산 염 버퍼 염 분에서에서 PMVECs의 두 150 cm 요리 중 하나, trypsinize, 및 다음 셀 계산 (우리는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라; 테이블의 자료를 참조). PMVECs와 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 다른 접시를 세척 하 고 중 긴장 20: 1의 감염 (MOI)의 다양성에 피 녹 농 균 의 감염. 이것은 다음과 같이 얻을 수 있습니다:
   1. P. 녹 농 균,₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL 명이. 이 희석을 준비 하려면 1 mL HBSS 1 mL 일회용 cuvette을 추가 합니다. 0.25의 OD₅₄₀ 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 달성 될 때까지 단계 1.1에서에서 준비 된 접시의 충분 한 박테리아를 다쳤어요. 다음 단계는 박테리아를 필요 합니다 얼마나 많은 계산을 제공할 것입니다.
   2. 문화 접시에 있는 PMVECs의 수 결정 되 면 (1.4 위의 단계), 박테리아는 PMVECs를 포함 하는 두 번째, 비 trypsinized 문화 접시에 추가 수 수 확인. 예를 들어 결정 되는 PMVECs의 문화 접시 10⁷ 셀 x 1.3를 포함 다음 준비 10⁷ 셀 x 20 박테리아/셀 x 1 mL/2 x 10⁸ CFUs x 1.3 = 1.3 mL 박테리아.
   3. 희석 박테리아의 1.3 mL HBSS로 20 mL의 최종 볼륨을 150 cm 접시의 전체 표면 액체, 커버 될 수 있다 다음 PMVECs의 접시에 희석된 박테리아를 추가.
   4. PMVECs 간격 셀 단층에 형성 하는 접시를 현미경으로 관찰 하면 볼 수 있습니다 때까지 4-5 시간, 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 박테리아와 주사 (참조 그림 1 갭 형성의 적절 한 수준에 대 한)를 품 어.
   5. 상쾌한, 수집 다음 세포 파편을 제거 하는 탁상 원심 분리기에서 2000 x g에서 10 분 원심.
      참고: 모든 탁상용 원심 분리기 생성 충분 한 g 수 강제 작은 unlysed 세포와 큰 세포 파편이이 단계에 사용할 수 있습니다.
   6. 박테리아를 제거 하는 필터에 통과 상쾌한 다음 그것의 끝에 연결 된 0.2 µ m 필터 주사기에는 상쾌한 하 거 라.
   7. 메 마른 상쾌한의 약 수를 사용 하 여 세포 독성 시험 (2.1 참조) 나중에 사용-80 ° C에서 상쾌한의 나머지 부분을 고정 하 고.

2입니다. 세포 독성 Supernatants의 분석

1. 세포 독성 분석 실험
   1. 6 잘 요리에서 PMVECs 합류까지 성장. 워시 우물 한번 HBSS, 다음 추가할 필터 소독 상쾌한 (어느 PA103 또는 ∆PcrV 주사 셀에서 수집)의 1.5 mL 개별 웰 스. 부정적인 통제로 또 다른 우물을 메 마른 HBSS를 추가 합니다.
   2. 21-24 h에 대 한 CO₂ 인큐베이터에 접시에 놓은 다음 셀 살인/세포 독성에 대 한 관찰 (다음 단계 참조). 추가 실험에 대 한 세포 독성을 전시 supernatants 사용 하 고 그 셀 죽이 표시 되지 않는 삭제.
   3. 셀 죽의 정량
      1. 상용 LDH 시험 키트와 제조 업체의 사용 하 여 죽은 세포에서 측정 젖 산 효소 (LDH) 릴리스 절차를 권장 합니다.
      2. 또는, 계량 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 현미경으로 세포 살해. 이 위해, 미세한 이미지와 그대로 셀을 포함 하는 문화 접시의 영역 기록 다음 셀 (지표는 단층에 세포 죽음의) 부족 한 영역을 계량 사용자 지정 ImageJ (국립 보건원) 매크로 (참조 보충 코딩 파일을 사용 하 여 ). 원하는 경우 매크로 단계 다음과 같이 수동으로 수행:
         1. 매크로에 이미지 (RGB 또는 Tiff 형식)을 입력 하 고 15% 포화 픽셀 대비를 조정 합니다. 대비 조정 이미지를 복제 하 보기의 필드 내에서 세포와 간격 영역의 높은 콘트라스트 이미지를 "배경 빼기" 명령을 수행 합니다.
         2. 이 이미지는 원래 이미지에서 빼기 하 고 이미지 계산기 "AND" 함수를 사용 하 여 원본 이미지와 결과 이미지를 결합. 블랙 (간격) 및 임계값 기능 (최소 0, 최대 5 개), 화이트 (셀) 마스크 결과 이미지를 변환 하 고 "이진 침식" 함수를 사용 하 여 이미지에서 노이즈를 제거.
         3. "지역 분수" 측정을 사용 하 여 결과 이미지에서 흰색 픽셀을 검정의 비율을 측정 합니다. 줄거리와 각 치료 시간에 대 한 익스프레스 소수 지역 최대 간격 영역의 % 포인트.
         4. 계산 방법 및 Tukey의 포스트 hoc 테스트, p 값이 0.05 중요 하 게 고려 보다 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 비교 합니다.
   4. 문화 supernatants에 아 밀 로이드, oligomeric 타우, 및 Aβ의 존재를 확립 immunoblot 분석을 사용 합니다. Immunoblot 분석 표준 절차^10,11,12, 전기 이동 법 전에 적어도 10 문화 supernatants 집중 제외를 사용 하 여 수행 합니다.
      1. 상쾌한 집중, 상쾌한의 1-2 mL 인 막 10 kDa의 분자량 컷오프는 원심 필터 단위에 배치 합니다. 그런 다음 필터 단위 배치 탁상용 원심 분리기 및 원심 분리기 2000 x g 필요한 정도의 농도가 될 때까지 (보통 45-60 분)를 달성.
      2. 집중 되어 표면에 뜨는¹¹ 에서 단백질의 양을 결정 하 고 젤의 개별 우물으로 동일한 양의 샘플을 로드 합니다.
      3. 니트로, 단백질 전송 다음 A11 안티 아 밀 로이드 항 체, T22 안티 oligomeric 타우 항 체, 또는 뒤에 적절 한 2 차 항 체는 MOAB2 안티-Aβ 항 체도 말 프로브 젤을 실행 합니다. 개발 표준 화학 절차를 사용 하 여도 말.
   5. Thioflavin T 시험을 하기 위해 계량 supernatants에서 amyloids thioflavin T 형광 (ThT)를 사용 합니다. 이러한 측정 supernatants 살 균 하는 필터를 사용 합니다.
      1. 10 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 8 mg thioflavin T (ThT)를 일시 중단 하 여 재고 솔루션 (50 x) thioflavin T 준비 합니다. 혼합 후, 0.22 μ m 필터 입자 제거를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
      2. 측정을 위해 1 mL 분 광 광도 계 베트에 PBS의 1 mL를 ThT 주식의 20 µ L를 추가 합니다. 장소는 spectrofluorimeter로 희석된 샘플입니다.
      3. 측정 기준 형광 방출 425 nm 여기를 사용 하 여 및 2 nm 단위로 450-575 nm에서 형광 방출 스캔 합니다.
      4. 425 nm 여기를 사용 하 여 시간 경과 검사 수행 및 482 nm 방출, 데이터 취득 모든 0.2의 60에 대 한 s.
      5. 초기 20 시간 경과 검사의 측정 빈 베트에 형광. 20 s, 검사를 일시 중지 하 고는 베트에 필터 살 균 상쾌한의 10 µ L를 추가. 반전으로는 베트를 혼합 하 고는 spectrofluorimeter로 다시 다음 장소.
      6. 최종 40 획득 시간을 기준으로 검색을 다시 시작 데이터의 s.
      7. 완료 되 면 시간 경과 스캔, 2.1.5.3에 같이 동일한 설정을 사용 하 여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행 합니다.

결과

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량.

...

토론

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 및 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277