Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Riepilogo

Metodi semplici sono descritti per la dimostrazione della produzione di citotossici amiloidi che segue infezione dell'endotelio polmonare da Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevati tassi di mortalità nei mesi successivi alla dimissione dall'ospedale. È stato ipotizzato che l'infezione del tessuto polmonare durante la polmonite provoca la produzione di citotossine longeve che può condurre a guasto dell'organo fine successive. Abbiamo sviluppato le analisi in vitro per verificare l'ipotesi che citotossine sono prodotte durante l'infezione polmonare. Cellule endoteliali polmonari isolati del ratto e il batterio Pseudomonas aeruginosa sono utilizzati come sistemi modello, e la produzione di cytoxins dopo l'infezione delle cellule endoteliali dai batteri è dimostrata mediante coltura cellulare seguita da quantificazione diretta utilizzando dosaggi di lattato deidrogenasi e un nuovo metodo al microscopio che utilizza la tecnologia di ImageJ. La natura dell'amiloide di queste citotossine è stata dimostrata dalle analisi obbligatorie di tioflavina T e di immunoblotting e immunodepletion usando l'anticorpo dell'anti-amiloide A11. Ulteriori analisi mediante immunoblotting ha dimostrato che oligomerici tau e Aβ erano prodotte e rilasciate dalle cellule endoteliali dopo l'infezione da p. aeruginosa. Questi metodi dovrebbero essere facilmente adattabili alle analisi di campioni clinici umani.

Introduzione

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevato i tassi di mortalità nei mesi successivi ospedale scarico^1,2,3,4,5,6. Nella maggior parte dei casi, la morte si verifica da qualche tipo di organo di estremità guasto tra cui renale, polmonare, cardiaca, o eventi del fegato, come pure colpo^5,6. Il motivo per l'elevato tasso di mortalità in questa popolazione di pazienti non è mai stato stabilito.

Polmonite è classificato come sia essere acquisita in comunità o nosocomiali (nosocomial) e gli agenti che possono causare la polmonite includono batteri, virus, funghi e sostanze chimiche. Una delle principali cause di polmonite nosocomiale è il batterio Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa è un organismo gram-negativo che utilizza un sistema di secrezione di tipo III per trasferire varie molecole effettrici, definite ESOENZIMI, direttamente al citoplasma delle cellule bersaglio^7,8. Durante l'infezione di cellule endoteliali polmonari, gli ESOENZIMI destinazione varie proteine intracellulari, compreso un modulo endoteliale del microtubule-collegata della proteina tau^9,10,11,12 , che conduce alla rottura di barriera endoteliale con conseguente edema polmonare severo, diminuita funzione polmonare e, spesso, la morte.

Come affermato in precedenza, i pazienti che sopravvivono la polmonite iniziale hanno elevati tassi di mortalità nei primi 12 mesi dopo la dimissione dall'ospedale. Un potenziale meccanismo per spiegare questo fenomeno è che qualche tipo di tossina longeva viene generato durante l'infezione iniziale che conduce al risultato a lungo termine difficile. Due osservazioni supportano questa possibilità. Prime, coltivate cellule endothelial polmonare che sono trattate inizialmente con p. aeruginosa non riescono a proliferare per fino ad una settimana dopo i batteri vengono uccisi da antibiotici¹³. I prioni secondo, lunga vita e agenti con caratteristiche da prioni sono stati dimostrati in varie malattie umane e animali, in particolare le malattie connesse con il sistema nervoso^14,15.

Non sono mai stati descritti metodi per esaminare il potenziale di produzione di agenti citotossici longevi durante l'infezione polmonare. Qui sono descritte una serie di saggi di semplice in vitro che può essere utilizzato per indagare la citotossina produzione e attività che segue infezione usando un agente comune che causa polmonite, p. aeruginosa. Queste analisi devono essere facilmente adattabile per indagare induzione citotossina possibili dopo l'infezione con altri agenti che causano la polmonite, e i surnatanti generati anche dovrebbero essere utili per investigare gli effetti di citotossine in tutto gli organi o gli animali. Infine, i saggi che sono descritte qui molto probabilmente sarà adattabili per testare fluidi biologici umani e animali per la produzione di citotossine durante la polmonite.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state esaminate e approvati dal comitato di cura di animale della University of South Alabama e istituzionale e sono state eseguite in conformità con tutte le normative federali, statali e locali. Colture primarie di cellule endoteliali microvascolari polmonare del ratto (PMVECs) sono stati ottenuti dall'impianto di Core di cultura cellulare presso la University of South Alabama di centro per biologia del polmone. Le cellule sono state preparate utilizzando le procedure precedentemente descritte¹⁶.

1. generazione di citotossici surnatanti

Nota: Qui, usiamo due diversi ceppi di p. aeruginosa: PA103, che ha un sistema di secrezione di III tipo intatto in grado di trasferire gli ESOENZIMI ExoU ed ExoT cellule bersaglio durante l'infezione e ∆PcrV, che manca un tipo sistema di secrezione di III ed è incapace di trasferimento ESOENZIMI alle cellule bersaglio dopo l'inoculazione.

1. Striscia di batteri sul Vogel-Bonner (VB) agar piastre¹⁷ e crescere durante la notte a 37 ° C.
   1. Per preparare i piatti, fare la seguente soluzione di riserva (sali Vogel-Bonner; 10 stock di x): misurare 2G MgSO₄, 20 g acido citrico (acido libero), 100 g K₂PO₄e 35 g NaH₂PO₄. Aggiungere ddH₂O 1 L e autoclave per 15 min con scarico lento.
   2. Posto 7,5 g di agar in 450 mL ddH₂O ed autoclave come sopra.
   3. A seguito di sterilizzazione in autoclave, inserire entrambe le soluzioni in bagnomaria a 50 ° C per raffreddare.
   4. Aggiungere 50 mL della soluzione 10 x VB madre sale in agar.
   5. Aggiungere carbenicillina a 400 µ g/mL (per i ceppi di p. aeruginosa in uso) e miscelare bene agitando la beuta.
   6. Posto 5 mL della soluzione di agar VB in piastre di coltura sterile individuali, consentire l'agar solidificare e quindi conservare a 4 ° C fino al giorno di semina batterica.
   7. Il giorno della semina batterica, pre-riscaldare un piatto fino a 37 ° C e poi rigare i batteri sulla piastra con un'ansa sterile. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C durante la notte.
2. Verificare PMVEC purezza dalla macchiatura positiva con fluorescente Griffonia simplicifolia lectina e macchiatura negativa con fluorescenti Helix pomatia lectin (un indicatore per cellule endoteliali arteriose). Aliquotare cellule e congelamento in azoto liquido.
3. Per esperimenti, mantenere le cellule dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale e crescere le cellule in un incubatore a 37 ° C contenente 5% CO₂. Utilizzare le celle a passaggi 5-15.
   1. Per la generazione dei surnatanti citotossici, piastra 2 x 10⁶ cellule in piatti individuali 150cm e crescere per 3-4 giorni fino a quando non viene raggiunto la confluenza. Utilizzare due piastre per esperimento (Vedi sotto).
   2. Per l'analisi dei surnatanti citotossici, cellule⁵ piastra 1 x 10 nei singoli pozzetti di un 6-Pozzo piatto e crescono per quattro giorni fino a quando non viene raggiunto la confluenza.
4. Per produrre il surnatante, lavare uno dei piatti dal punto 1.3.1 con tampone fosfato salino due 150 cm di PMVECs, tripsinizzano e poi contare le celle (utilizzare un contatore di cellule automatizzato e seguire il protocollo del produttore; Vedi Tabella materiali). Lavare l'altro piatto di PMVECs con di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) e quindi infettare con uno sforzo di p. aeruginosa ad una molteplicità di infezione (MOI) di 20:1. Ciò si ottiene come segue:
   1. Per p. aeruginosa, OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFU/mL. Per preparare questa diluizione, aggiungere 1 mL HBSS una cuvetta monouso da 1 mL. Raschiare abbastanza batteri fuori la piastra che è stato preparato nel passaggio 1.1 fino ad ottenere un OD₅₄₀ di 0,25 quando misurata con uno spettrofotometro. Il passo successivo fornirà un calcolo di quanto i batteri saranno necessari.
   2. Una volta determinato il numero di PMVECs nella piastra di coltura (passaggio 1.4 sopra), determinare il numero appropriato di batteri da aggiungersi alla piastra di coltura in secondo luogo, non tripsinizzate contenente il PMVECs. Ad esempio, se è accertato che la piastra di coltura del PMVECs contiene 1.3 x 10⁷ cellule, quindi preparare 1.3 x 10⁷ cellule x 20/cellula dei batteri x 1 mL/2 x 10⁸ CFU = 1,3 mL batteri.
   3. Diluire i 1,3 mL di batteri in HBSS ad un volume finale di 20 mL, affinché tutta la superficie di un piatto di 150 cm può essere coperto con il liquido, quindi aggiungere i batteri diluiti alla piastra di PMVECs.
   4. Incubare il PMVECs inoculati con i batteri a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ per 4-5 h, fino a quando le lacune possono essere visto che formano in strato monomolecolare della cellula quando la piastra è osservata microscopicamente (Vedi Figura 1 per un livello adeguato di formazione di spacco).
   5. Raccogliere il surnatante, poi Centrifugare per 10 min a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo per rimuovere i detriti cellulari.
      Nota: Qualsiasi centrifuga piano tavolo capace di generare sufficiente g forzare a pellet generare cellule e a grandi cellule frammenti possono essere utilizzati per questo passaggio.
   6. Versare il surnatante in una siringa che ha un filtro da 0,2 µm collegato alla sua estremità, quindi passare il surnatante attraverso il filtro per rimuovere i batteri.
   7. Utilizzare un'aliquota del surnatante sterile per test di citotossicità (Vedi 2.1) e congelare il resto del surnatante a-80 ° C per un uso futuro.

2. analisi dei surnatanti citotossici

1. Analisi di citotossicità
   1. Crescere PMVECs in piatti 6 pozzetti fino alla confluenza. Pozzi di lavare una volta con HBSS, quindi aggiungere 1,5 mL di surnatante filtro-sterilizzato (raccolti da entrambi cellule PA103 - o ∆PcrV-inoculato) singoli pozzetti. Aggiungere HBSS sterile ad un altro pozzo come controllo negativo.
   2. Posizionare la piastra nell'incubatrice di CO₂ per 21-24 h, quindi osservare per uccisione/citotossicità delle cellule (Vedi punto successivo). Utilizzare i surnatanti che esibiscano una citotossicità per ulteriori sperimentazioni e scartare quelli che non mostrano uccisione delle cellule.
   3. Quantificazione di uccisione delle cellule
      1. Rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) misura dalle cellule morte usando i corredi di analisi disponibili nel commercio di LDH e di produttore procedure raccomandate.
      2. In alternativa, quantificare uccisione delle cellule microscopicamente utilizzando software ImageJ. Per questo, registrare immagini microscopiche e zone della piastra di coltura contenenti cellule intatte, quindi quantificare regioni mancano cellule (indicative della morte delle cellule in un monostrato) utilizzando una macro personalizzata di ImageJ (National Institutes of Health) (Vedi File di codifica supplementare ). Se lo si desidera, eseguire i passaggi di macro manualmente come segue:
         1. Inserire immagini (in formato RGB o Tiff) la macro e regolare il contrasto a 15% saturata pixel. Duplicare immagini regolare contrasto ed eseguire il comando "sottrarre sfondo" per ottenere un'immagine ad alto contrasto della zona sia in cella e gap all'interno del campo visivo.
         2. Sottrarre questa immagine dall'immagine originale e combinare l'immagine risultante con l'immagine originale usando il calcolatore di immagine funzione "AND". Convertire l'immagine risultante in maschera bianca (celle) con la funzione di soglia (0 minimo, massimo 5) e nero (lacune) e utilizzare la funzione «erosione di binario» per rimuovere il rumore dall'immagine.
         3. Misurare il rapporto di nero al bianco pixel all'interno dell'immagine risultante utilizzando la misurazione "frazione di zona". Trama ed esprimono frazionari aree per ogni punto del tempo di trattamento come per cento della superficie massima gap.
         4. Mezzi di calcolare e confrontare con One-way ANOVA test post-hoc di Tukey, con valori di p meno di 0,05 considerato significativo.
   4. Utilizzare l'analisi di immunoblot per stabilire la presenza di amiloide, tau oligomerici e Aβ in surnatanti della cultura. Effettuare l'analisi di immunoblot usando^11,10,procedure standard¹², ad eccezione di concentrazione surnatanti almeno 10 volte prima dell'elettroforesi.
      1. Per concentrare il surnatante, inserire 1-2 mL di surnatante in un'unità filtrante di centrifugazione cui membrana ha un peso molecolare di cut-off di 10 kDa. Quindi, posizionare l'unità filtro in una centrifuga di piano d'appoggio e centrifugare a 2.000 x g fino a quando il grado di concentrazione richiesto è raggiunto (solitamente 45-60 min).
      2. Determinare la quantità di proteine nel surnatante concentrato¹¹ e uguale quantità di campioni di carico nei singoli pozzetti del gel.
      3. Eseguire gel, le proteine di trasferimento alla nitrocellulosa, quindi le macchie con anticorpo anti-amiloide A11, anticorpo anti-oligomerici tau T22 o con anticorpo anti-Aβ MOAB2 seguita da appropriati anticorpi secondari della sonda. Sviluppare le macchie utilizzando le procedure standard di chemiluminescenza.
   5. Per fare un Tioflavina T test, utilizzare Tioflavina T fluorescenza (ThT) per quantificare amiloidi nei surnatanti. Per queste misurazioni, utilizzare surnatanti filtro-sterilizzato.
      1. Preparare una soluzione di riserva (50x) della Tioflavina T sospendendo 8mg Tioflavina T (ThT) in salino 10 mL tamponato fosfato (PBS). Dopo la miscelazione, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm per rimuovere il particolato.
      2. Per misurazioni, aggiungere 20 µ l di brodo di ThT ad 1 mL di PBS in una cuvetta spettrofotometro di 1 mL. Inserire il campione diluito in un spettrofluorimetro.
      3. Misurare l'emissione di fluorescenza della linea di base con 425 nm eccitazione e scansione l'emissione di fluorescenza da 450-575 nm in incrementi di 2 nm.
      4. Eseguire una scansione di time-lapse con 425 nm eccitazione e 482 nm emissione, con dati acquisiti ogni 0.2 s per 60 s.
      5. L'iniziale 20 s della scansione time-lapse misura fluorescenza nella provetta vuota. 20 s, mettere in pausa la scansione e aggiungere 10 µ l del surnatante filtro-sterilizzati per la cuvetta. Mescolare la cuvetta di inversione e quindi inserire nuovamente lo spettrofluorimetro.
      6. Riprendere la scansione basata sul tempo, acquisendo il finale 40 s di dati.
      7. Al termine della scansione time-lapse, eseguire una scansione di spettro di emissione di fluorescenza finale utilizzando impostazioni identiche, come dettagliato nel 2.1.5.3.

Risultati

Un test semplice in vitro è stato sviluppato per analizzare la presenza di citotossine in surnatanti delle cellule infettate dal batterio p. aeruginosa. Fondamentalmente, terreno di coltura da cellule infette sono raccolti 4 h dopo aggiunta batterica, i batteri sono stati rimossi da sterilizzazione filtro del surnatante della cultura, e quindi il surnatante sterile viene aggiunto a una nuova popolazione di cellule. Le cellule sono poi osservate 21-24 h dopo l'aggiunta d...

Discussione

Qui, metodi semplici in vitro sono delineati che consentono la dimostrazione della generazione di citotossici amiloidi durante l'infezione con una polmonite causando organismo. Questi metodi includono analisi di citotossicità di cultura cellulare, immunoblotting, quantificazione dell'utilizzo un metodo novello al microscopio e dell'associazione ThT di uccisione delle cellule. Analisi degli agenti citotossici hanno dimostrato che sono amiloide in natura (Figura 2 e

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277