מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

Abstract

כימות של מתילציה DNA יכולה להיות מושגת באמצעות רצף ביסולפאט, אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל, בהקשר דנ א חד גדילי. רצף ביסולפאט יכול להיות ממוקד (באמצעות PCR) או לבצע על הגנום כולו ומספק כימות מוחלטת של ציטוזין מתילציה ברזולוציה-הבסיס יחיד. בהתחשב באופי ברורים של DNA גרעיני - ו מיטוכונדריאלי, ובייחוד במבנה משני, adaptions של ביסולפאט שיטות רצף על חקירת ציטוזין מתילציה ב mtDNA צריכה להיעשות. מבנה משניות ושלישוניות mtDNA יכול בהחלט להוביל ביסולפאט רצף חפצים שמוביל שווא-תוצאות חיוביות בשל גישה המסכן דנטורציה לא שלם של ביסולפאט ל- DNA חד-גדילי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות עיכול אנזימטי של ה-DNA BamHI יחד עם bioinformatic ניתוח צינור כדי לאפשר כימות מדויק של ציטוזין מתילציה רמות ב mtDNA. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לעיצוב תחל רצף ביסולפאט ספיציפית mtDNA, כדי להימנע מיקוד מקטעי הגרעיני מיטוכונדריאלי לא רצויים (NUMTs) מוכנס לתוך הגנום הגרעיני.

Introduction

גנום מיטוכונדריאלי הוא מבנה כפול גדילי מעגלית של-16.5-קילו base (kb), המהוות של כבד, ופיסה אור. גנום מיטוכונדריאלי נוכח מספר עותקים בתוך כל תא, maternally-בירושה, ו מקודד מרכיבים חיוניים של קומפלקסי שרשרת הנשימה¹. בדומה הגנום חיידקי, בניגוד הגנום הגרעיני, גנום מיטוכונדריאלי מאורגן במבנים רבים משניות ושלישוניות, כגון מבנים מפותל supercoiled², אשר יכול לגמול גישה קשה במהלך רצף ניסויים³.

בגרעין, מתילציה של הדנ א היא סימן epigenetic בהרחבה למדה משחק תפקיד בתהליכים רבים, ובמיוחד בוויסות של ביטוי גנים. מתילציה DNA הגנום יונקים, מתרחשת בעיקר על 5-מיקום הטבעת פירימידין של deoxycytidines, בעיקר על CG dinucleotides (או CpG). מתילציה ציטוזין נמצא ב-70% של CpG כל הגנום של תאים סומטיים וחשבונות ~ 1% של סך שה-DNA בסיסים⁴. ה-DNA methylations בכללותה תוארה גם בהקשרים שאינם-CpG, כגון רו ח, CpT עלות לקליק, קיים בכמויות שונות ב- DNA גרעיני, עם ערכים עד 25% של כל cytosines מפוגל בתאי גזע עובריים^5,6,7.

בעוד ציטוזין מתילציה של הגנום הגרעיני מקובל, קיום מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA) הוא עדיין שנוי במחלוקת. המחקר הראשון מתילציה חוקר mtDNA בוצעה בתאים בתרבית איפה mtDNA מתילציה זוהה בקלות, למרות ברמות נמוכות בהשוואה ל- DNA גרעיני⁸. בתאים אנושיים וטכנולוגיים מאתר, mtDNA מתילציה זוהה גם ברמות נמוכות (2-5%). באמצעות מבחני להסתמך על לכידת 5 methylcytosine כגון מפוגל immunoprecipitation דנ א (MeDIP) ואחריו PCR כמותי, mtDNA מתילציה זוהה גם מגוון העכבר של האדם ואת תאי שורות^{9,10, 11,12}. באמצעות נוגדנים נגד 5-methylcytosine assay אליסה או ספקטרומטר מסה, רמות משמעותי של מתילציה DNA אובחנו שברים מיטוכונדריאלי מטוהרים^{13,14,15, 16}. עם זאת, רוב מבחני במחקרים הנ ל משמש טכניקות לא תוכננו כדי לספק כימות מוחלטת של מתילציה DNA ברזולוציה-הבסיס יחיד.

ניתוח מתילציה של הדנ א resolutive וסטטיסטי יכולה להיות מושגת על ידי טכניקה בשם "ביסולפאט רצף", אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל חד גדילי הדנ א בהקשר¹⁷ . באמצעות רצף ביסולפאט, מערך של מחקרים זיהה את הנוכחות של ציטוזין מתילציה ברמות שונות. מתילציה mtDNA באזור D לופ, את 12S או האזור מטוסי אף-16 זוהה ברצון האנושי^{18,19,20,21,22,23} ו העכבר²⁴ רקמות ותאים, לעומת זאת, עם השתנות מסקרן, 1-20% של סך cytosines על פני לימודי.

לעומת אלה מחקרים רבים, יש רק מעט מחקרים, כולל הקבוצה שלנו, השנויות במחלוקת על הימצאות mtDNA מתילציה^3,25,26,27 או חקרו את הרלוונטיות הביולוגי של רמות נמוכות מאוד של רמות (להלן 2%) mtDNA²⁸. לאחרונה, דווח כאן את ההתבוננות חפץ ביסולפאט-רצף פוטנציאליים ביסולפאט מיטוכונדריאלי כל רצף³. סיפקנו ראיות מבנה שניוני של דנ א מיטוכונדריאלי יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות ב רצף ביסולפאט, ובכך מפריז מתילציה רמות. אנו מספקים כאן פרוטוקול כדי למנוע חפץ של ביסולפאט-המרה של mtDNA. פרוטוקול זה משתמש של עיכול אנזימטי פשוטה של ה-DNA כדי לשבש mtDNA משני מבנים ולאפשר גישה מלאה ביסולפאט בעקבות ביסולפאט רצף פרוטוקול. בנוסף, אנו מספקים של צינור bioinformatic הנלווים לניתוח של רצף ביסולפאט.

Protocol

1. טיפול אנזים הגבלה

1. Linearize mtDNA על ידי טיפול הכולל דנ א אנושי עם האנזים הגבלה BamHI, שחותך במיקום 14258 ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי.
   הערה: עכבר ה-DNA, לשימוש של אנזים הגבלה BglII בתנאים זהים להלן.
2. לכל אחד לטעום איפה mtDNA מתילציה כדי להיות מוערך, להכין שפופרת אחת של התגובה 0.2 מ"ל ולהוסיף את הבאים מערבבים: 3 μg הדנ א (לכמת על-ידי fluorometry), 15 μL מאגר 3, 3 μL BamHI ומים עד 150 μL
3. מניחים צינורות הצנטרפוגה תרמי במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.

2. ביסולפאט ההמרה

1. להמיר דנ א BamHI שטופלו באמצעות ביסולפיט כמתואר²⁹.
2. השתמש 200-500 ng שטופלו BamHI DNA עבור כל תגובה ההמרה הנפח הכולל של 20 μL. ההתאוששות הדנ א הוא 50-70%.
3. Elute ה-DNA המרה ביסולפאט במאגר • תנאי μL 10.
4. לכמת חד גדילי הדנ א על-ידי fluorometry.
5. אופציונלי: חנות המרה ביסולפאט DNA ב-20 ° C לפני שתמשיך את הנותרים של הפרוטוקול. לאחסון לטווח ארוך, לאחסן המרה ביסולפאט DNA ב-80 מעלות צלזיוס

3. עיצוב של ביסולפאט רצף תחל

1. עיצוב צבעי יסוד רצף ביסולפאט באמצעות כלים מקוונים Methprimer³⁰ BiSearch^31,32.
   הערה: Methprimer BiSearch מאפשרות לחפש רצפים מחייב פריימר על רצף גנומית איפה cytosines מומרים thymines, בדומה לטיפול פוסט-ביסולפאט.
2. עבור הגברה מיטבי, לא משוחד, להימנע CpG dinucleotides ב תחל ולעצב את גודל אמפליקון בין 100-300 bp.
3. ודא תחל בעיצוב ספציפי ל- DNA מיטוכונדריאלי באמצעות הפונקציה של BiSearch חיפוש פריימר. להוסיף את תחל כבר מעוצב ביסולפאט המרה, סמן את התיבה ביסולפאט וכוללים גנום הפניה ופרמטרים PCR.
   הערה: רשימת מוצרים PCR אפשרי יוצג.
4. להעתיק העליון רצפים פריימר 1-5, הדבק אותם בטופס ההזמנה של סינתזה oligonucleotide.
   הערה: רשימה של האדם רצפי פריימר mtDNA העכבר אשר אומתה במעבדה מוצגת בטבלה1.
5. הבדיקה תחל תוך שימוש ביסולפאט המרה PCR בעקבות agarose בג'ל כפי שמתואר בשלב 4. מבחן למטב כל זוגות פריימר בנפרד, להבטיח שגודל אמפליקון הנכון מופיע על הג'ל agarose.
   הערה: אם תחל ריבוב נדרשים, להוסיף primers רבים לאחד יחיד PCR התגובה והמחש את המוצרים PCR agarose בג'ל או, שיטה יותר resolutive כגון לזיהוי בג'ל, כדי להבחין בין מוצרים דומים גודל.

4. ביסולפאט המרה PCR והפקת ג'ל

1. כדי להגביר את האזורים של הריבית, לבצע PCR באמצעות אנזימים להתחיל חם. בקצרה, לערבב 100 ng המרה DNA 500 תחל חוש וחוש אנטי-מיקרומטר, 1 µL dNTP מיקס (10 מיקרומטר של כל dNTP), פולימראז ב- U-תגובה 7.5 בהנפח הכולל של µL 50. להפעיל את ה-PCR עם התנאים הבאים: 5 דקות ב 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס. השתמש תחל גם בנפרד או מרובב.
2. אופציונלי: כאשר ריבוב תחל, שימוש 200 ng המרה DNA ו אופניים התנאים הבאים: 5 דקות 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס.
   הערה: טמפרטורה עשוי להשתנות בהתאם טמפרטורת ההיתוך של צבעי יסוד.
3. נושא ה-PCR מוצרי ג'ל אלקטרופורזה על 2% agarose ב100 וולט.
4. תחת אור UV עדין, לחלץ את מוצרי ה-PCR עם איזמל ולהוסיף microtubes. אל תחשוף PCR מוצרים לאור UV מופרז כדי למנוע נזק לדנ א. להימנע זמן החשיפה מעל גיל 30 s.
5. לטהר את המוצרים PCR באמצעות ג'ל לטיהור כפי שתואר לעיל³.
6. לכמת את ה-DNA מטוהרים מהשלב 4.5 באמצעות fluorometry. המשך שלב 5 או מאגר דגימות ב-20 ° C.

5. רצף ספריית הכנה ביסולפאט

1. לבצע הכנה ספריה של המרה ביסולפאט מוצרי ה-PCR.
   אופציונלי: מגה-פלקס PCR מוצרים בשלב זה.
2. לבצע סוף-תיקון באמצעות עד 100 ננוגרם של מוצר ה-PCR. מוסיפים 3 µL סיום ההכנה אנזים 6.5 µL סוף תיקון התגובה מאגר (10 x) למוצר ה-PCR µL 55.5 בשפופרת 0.2 מ"ל. למקם, דגירה צינור הצנטרפוגה תרמי למשך 30 דקות ב- 20 ° C ואחריו 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס.
3. מאתרים ומפסיקים מתאמים רצף על ידי ערבוב ה-DNA לתקן-סוף עם 15 µL בלאנט/ת א ליגאז מיקס, 2.5 µL מתאם, משפר מצדו µL 1. אם משתמש < 100 מוצר ה-PCR ng כקלט, לדלל מתאם 10 פעמים.
4. מניחים את התערובת (שלב 5.3) הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 20 º C. להשהות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף 3 µl משתמש אנזים ברכבת התחתית. לערבב, למקם את הצינור בחזרה הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 37 º C.
5. גודל לבחור את ה-DNA ובין אם-לא מתאם באמצעות חרוזים מוצק שלב הפיך הנייח (אלוהים אדירים) עם יחס בדרגות שונות של חרוזים ל- DNA בהתאם לגודל המוצר ה-PCR.
6. הוסף 13.5 µL H₂O ל- DNA ובין אם-לא מתאם שלב 55 ו 5.4 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומקום צינור על דוכן מגנטי. כאשר הפתרון ברור, להעביר את תגובת שיקוע צינור ולמחוק את שפופרת המכילה את החרוזים.
   הערה: תגובת שיקוע מכיל את ה-DNA ובין אם-לא מתאם, חלקים לא רצויים גדול מאוגדים החרוזים שהושלכו.
7. להוסיף 25 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים תגובת שיקוע מהשלב 5.6, לערבב, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר הפתרון ברור.
   הערה: תגובת שיקוע שהושלכו מכיל DNA לא רצויים, ואילו ה-DNA ובין אם-לא מתאם מאוגד חרוזים.
8. בעוד הצינורית על הדוכן מגנטי, הוסף 200 µL 80% אתנול (הטרי) לשטוף את החרוזים. דגירה 30 s, הסרה, להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף.
9. חרוזים אוויר יבש במשך 5 דקות תוך הצינור הוא מעמד מגנטי עם מכסה פתוח.
10. הסר את הצינורית של המגנט, elute ה-DNA במאגר • תנאי 23 µL ומערבבים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
11. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי, כאשר הפתרון ברור, להעביר 2 µL צלחת PCR 96-ובכן עבור הגברה טרום-PCR (שלב 5.14).
12. להעביר את µL 21 כ השאר צינור 0.2 מ"ל עבור הגברה PCR (שלב 5.17).
    הערה: הקפד לא להעביר כל חרוזים כמו חרוזים יכול לעכב תגובות אנזימטיות של הצעדים הבאים.
13. המשך שלב 5.14 או מאגר דגימות ב-20 ° C.
14. בצע קדם-PCR ההגברה ידי RT-qPCR כדי להעריך את מספר מחזורי הדרושים כדי להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם. לכל תגובה, להוסיף הפעולות הבאות ב- PCR 96-ובכן צלחת 2 µL המכילה DNA (שלב 5.11): פריימר אינדקס µL 0.4 0.4 µL אוניברסלי PCR פריימר, 7.2 µL H₂O, מיקס מאסטר RT-qPCR 10 µL.
15. מקם את הצלחת במכונת ה-PCR בזמן אמת ונושא את הצלחת לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 מחזורים; 5 דקות 65 ° C.
16. להעריך את מספר מחזורי הגברה הדרושים עבור כל דגימה על-ידי חיסור Ct-ערך אחד ערך ה-Ct קדם הגברה RT-qPCR התואם לסוף השלב הליניארי של תגובת ה-PCR.
17. להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם מ שלב 5.12 על ידי ערבוב: 21 µL DNA, 25 µL PCR מיקס מאסטר, פריימר אינדקס µL 1, פריימר PCR אוניברסלי µL 1 ו 2 µL H₂O. ב הצנטרפוגה תרמי, נושא כל מדגם לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [מחושב Ct משלב 5.16] מחזורי; 5 דקות 65 ° C.
    הערה: זכור להשתמש רק אחד פריימר אינדקס עבור דגימה כדי לאפשר ריבוב. המדד נוסף במהלך PCR.
18. לטהר את החרוזים DNA אלוהים אדירים מוגבר, elute במאגר • תנאי µL 22.
19. לשלוט באיכות הספרייה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה או חלופה בשיטה. חפשו גדלים שיא הספריה המתאימה (PCR מוצרים בגודל בתוספת מתאם).
20. לאמוד את גודל בסיס-זוג ממוצע של המוצרים ספריה על ידי השמצות ניתוח: הגדרות כלליות מתקדם, לחץ פעמיים על "השולחן" תחת השמצות ניתוח. הגדרת האזור מ- 100-1000 bp ' ולחץ על ' אישור'. תחת אזור שולחן, האזור שהוגדר מופיע, ספריית גודל ממוצע (bp) מחושבת.
21. לכמת ספריות על-ידי fluorometry. המשך שלב 6 או חנות ספריות ב-20 ° C.

6. רצף הדור הבא

1. לחשב את הריכוז nM של ספריות באמצעות הנוסחה:
   
2. לדלל ספריות nM ריכוז למשל 2 ננומטר אותו (לבחור 4 nM, 2 ננומטר, 1 ננומטר, או 0.5 ננומטר בהתאם ספריית ריכוזים). מאגר כל ספריות להשגת מאגר של 2 ספריות ננומטר.
3. Denature ו לדלל ספריות בעקבות המדריך כלי עריכה ברצף. בקיצור: Denature הבריכה 2 ננומטר על-ידי הוספת 0.2 N NaOH, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק Dilute הבריכה denatured לדילול הסופי 10 בלילה. Denature ו לדלל ספריה שליטה זמינים מסחרית לדילול הסופי ו־12-5 בערב. אל צינור חדש, מערבבים הבריכה 10 בלילה עם 20% ו־12-5 pM בקרת ספרייה.
   הערה: המרה ביסולפאט מציג את מורכבות נמוכה מאוד. 20% בקרת ספרייה ספייק בתגרום רצף באיכות טובה יותר.
4. להפעיל לחץ דם 150 לזווג-קצה רצף שימוש בכלי רצף עמוק.

7. חישובית ניתוח - אומדן מתילציה רמות

1. ליצור קבצי .fastq (המכונה כאן sample1_R1.fastq.gz ו- sample1_R2.fastq.gz), ליצור אינדקס ביסמרק של הגנום כולו עניין (כאן בתיקיה בשם bismarkIndex) ולוודא כי רצף גנומית של chrM זמין ב- fasta תבנית (כאן בתיקיה בשם chrM).
2. לעבד מראש קריאות כדי להסיר מתאמים ודעות קדומות שהציג את צבעי יסוד: השתמש בכלי Trim_galore³³. הסר את שני נוקלאוטידים 5' סוף שתי קריאות ואחורה.
   trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o.... / trim1 - לזווג sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
3. ליישר קריאות מעובד מראש כדי הגנום כולו באמצעות ביסמרק³⁴
   ביסמרק, dovetail - באם -o-/-/ bismarkIndex /-1./sample1_R2_val_2.fq.gz./sample1_R1_val_1.fq.gz-2
   הערה: אם aligner אחר, ודא כי מושמטות קריאות זה לא יכול להיות מיושרים באופן ייחודי.
4. תמצית קורא מיפוי כרומוזום ה M, כאן על ידי שימוש Samtools³⁵
   samtools למיין - O -l 0 BAM -o sample1_sorted.bam
   sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
   samtools מדד sample1_sorted.bam
   samtools להציג -u sample1_sorted.bam chrM | samtools למיין - n - O BAM -o sample1_chrM.bam
5. לחלץ את המידע מתילציה
   bismark_methylation_extractor -p - CX-- מקיף - cytosine_report genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam
6. השתמש את .bedGraph, את עמודי או הקבצים CX_report.txt לניתוח נוסף. השתמש בקובץ sample1_chrM.CX_report.txt ויזואליזציה ולבדיקה.
7. לבצע חיתוך נוסף בשלב preprocessing, אם אזורים מרובים הם נחקר, דעה קדומה פריימר עשויים להיות גלויים ב- M-הטיה החלקות שנוצרו במהלך המיפוי. עיין בתיעוד של ביסמרק לקבלת מידע נוסף.

8. חישוב ניתוח - מבחן של הבדלים

1. ודא כי קובץ ה-CX_report.txt מכיל 7 עמודות, כרומוזום (כאן chrM), עמדה, סטרנד, מספר הקריאות מפוגל, מספר קריאות unmethylated, הקשר C רצף שמסביב, עבור כל C על כרומוזום מ'.
2. כפי CX_report מכסה chrM בשלמותו, בדוק את תת-הקבוצה כדי region(s) אשר מוגבר.
3. השתמש במבחני ללא פרמטרי להבדלים בין מדגמים, כגון מבחן המדויק של דייגים של בודדות או מבחן השלט של האזור כולו.
   הערה: כימות לעיתים קרובות תהיו קרובים מתילציה 0%, וזו הסיבה מדוע בהנחה נורמליות אינה הולמת.
4. באופן דומה, להמחשת, לדמיין quantiles או לחשב מרווחי הביטחון בינומי פרופורציה.

תוצאות

שני צעדים של פרוטוקול זה מכריעים כאשר חוקרים mtDNA מתילציה. 1) פתיחת המבנה משני ועיצוב 2) של צבעי בסיס ספציפי דנ א מיטוכונדריאלי.

על ידי ה-DNA הגנומי האנושי עם האנזים הגבלת BamHI (איור 1), יהיה לחתוך את מבנה ה-DNA מיטוכונדריאלי במיקום ?...

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול ביסולפאט-רצף אשר היא תוכננה במיוחד כדי לחקור mtDNA מתילציה. ההבדלים עם ביסולפאט-רצפי פרוטוקולים המשמשים עבור הדנ א טמון הניצול של צעד עיכול אנזים הגבלה מוקדמת, ניתוח bioinformatic פסק דין החוצה שווא חיוביים. הנובעות NUMT רצפים.

אנו מספקים פרוטוקול כדי להימנע ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA methylation-lightning kit	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
High Sensitivity DNA chip	Agilent	# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
Sodium hydroxide	Sigma	# S5881
Thermal cycler C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	#1855195
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq instrument	Illumina	# SY-410-1003