ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

要約

ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説明します。

要約

DNA のメチル化の定量は、重亜硫酸塩の配列は、非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA のコンテキストでを変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用を使用して達成することができます。重亜硫酸塩の配列をすることができます (PCR を使用して) を対象とした全ゲノム上で実行やシトシンのメチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供します。特に二次構造の核およびミトコンドリア DNA の異なる性質を考えると、ミトコンドリア Dna のシトシンのメチル化を調査するための重亜硫酸塩の配列方法の adaptions が行われなければなりません。MtDNA の二次および第三構造は確かに不完全な変性の単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスの悪さのため偽陽性につながる成果物を配列する重亜硫酸塩につながることができます。ここでは、シトシンの正確な定量化にミトコンドリア Dna のメチル化レベルを許可する DNA の酵素消化による病原バイオ情報解析パイプラインと相まってプロトコルについて述べる。加えて、我々 は mtDNA に固有重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計のガイドラインを提供、望ましくない核ミトコンドリア セグメントをターゲットを避けるために (NUMTs) は、核ゲノムに挿入されました。

概要

ミトコンドリアのゲノムは約 16.5 キロ ベース (kb) の円形、二本鎖構造長い、重いと光の鎖を構成します。ミトコンドリアゲノムは母性継承、各セル内の複数のコピーに存在し、呼吸鎖複合体¹の基本的なコンポーネントをエンコードします。同様に核ゲノムとは異なり、細菌のゲノムに、ミトコンドリアのゲノムは組織された多数の二次および第三構造などコイルとスーパーの構造²、アクセス困難なシーケンス処理中に表示することができます。実験³。

核内 DNA のメチル化、遺伝子発現の調節に特に多数のプロセスの役割を果たしている広範囲に研究エピジェネティックなマークです。哺乳類のゲノムの DNA のメチル化は deoxycytidines、主に CG ジヌクレオチド (CpG) のピリミジン環の 5 の位置に主に発生します。シトシンのメチル化は、DNA 塩基⁴体細胞と合計の ~ 1% のゲノムのすべての CpG の 70% で発見されます。DNA メチル化はまた公認会計士、CpT、クリック単価などの非 CpG のコンテキストに記載されているし、胚性幹細胞^5,6,7ですべてのメチル化シトシンの 25% までの値と、核の DNA にさまざまな量で存在します。

核ゲノムのシトシンのメチル化は、広く、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の存在はまだ論争を呼びます。最初研究調査ミトコンドリア Dna メチル化は、核の DNA⁸と比較して低いレベルで培養細胞でミトコンドリア Dna のメチル化が検出されたで行われました。人間とマウスの細胞でミトコンドリア Dna のメチル化は低レベル (2-5%) も検出されました。メチル化 DNA 免疫沈降 (MeDIP) を定量的 PCR によって続いたなど 5 メチルシトシン キャプチャに頼るの試金を使用して、ミトコンドリア Dna メチル化様々 なマウスと人間にも認められた、細胞ライン^{9,10, 11,12}。5-メチルシトシン ELISA の試金の質量に対する抗体を用いて、DNA のメチル化の実質的なレベルが検出された精製ミトコンドリア分画^13,14,15,16します。 ただし、前述の調査の試金のほとんどは DNA メチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供するために設計されていない技術を使用します。

非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA コンテキスト¹⁷を変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用する「重亜硫酸塩の配列」という手法により定量的および resolutive の DNA メチル化解析が可能します。.重亜硫酸塩の配列を使用して、研究の方角は、さまざまなレベルにおけるシトシンのメチル化の有無を検出しました。人間^{18,19,20,21,22,23}マウス²⁴で検出された 16S 領域や、12 D ループ領域のメチル化 mtDNA組織・細胞研究にわたって合計シトシンの 1 ~ 20% の魅力的な変動でただし、します。

これらの数多くの研究と比較して私たちのグループからを含むのみいくつかの研究がミトコンドリア Dna メチル化^3,25,26,27の存在を論じられるまたはの生物学的妥当性を疑問視ミトコンドリア Dna (2%) 以下のレベル²⁸の非常に低レベル。最近、ミトコンドリア全重亜硫酸塩の配列³の潜在的な重亜硫酸塩の配列項目の観測を報告しました。我々 はそれによりメチル化レベルを過大評価してミトコンドリア DNA の二次構造は重亜硫酸塩の配列で、偽陽性につながる証拠を提供しました。MtDNA の重亜硫酸塩の変換のアーティファクトを防ぐためにプロトコルを示します。このプロトコルは、ミトコンドリア Dna の二次構造を混乱させると次の重亜硫酸塩の配列プロトコルの重亜硫酸塩へのフル アクセスを許可する DNA の簡単な酵素の消化力を使用します。さらに、重亜硫酸塩の配列の解析に伴うバイオ情報パイプラインを提供します。

プロトコル

1 制限酵素処理

1. 病原位置 14258 人間のミトコンドリア dna を切る制限の酵素と全人間 DNA を扱うことによってミトコンドリア Dna をリニア化します。
   注: マウス DNA を以下のように同一の条件の下で制限酵素 BglII を使用します。
2. それぞれのサンプルがミトコンドリア Dna メチル化は、評価に 1 つ 0.2 mL 反応管を準備、(蛍光分析による定量化) 次ミックス: 3 μ g ゲノム DNA を追加の 15 μ L バッファー 3、3 μ L 病原とを 150 μ L の水
3. 37 ° C で 4 時間サーマルサイクラーにチューブを配置します。

2. 重亜硫酸塩の変換

1. 病原治療 DNA 亜硫酸水素ナトリウム²⁹を他の場所で説明されているように変換します。
2. 各変換反応 20 μ L の容量で 200-500 ng 病原治療 DNA を使用します。DNA の回復は 50-70% であります。
3. 10 μ L の溶出バッファーの重亜硫酸塩の変換された DNA を溶出します。
4. 蛍光分析による単一座礁させた DNA を定量化します。
5. 省略可能: プロトコルの残りを進む前に-20 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換を格納します。長期保存用保存-80 ° C で DNA を重亜硫酸塩の変換

3. 重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計

1. オンライン ツール Methprimer³⁰と BiSearch^31,32を使用して重亜硫酸塩の配列のプライマーを設計します。
   注: Methprimer と BiSearch を許可するゲノム配列のプライマー結合塩基配列を検索する、シトシン、チミン、後重亜硫酸塩の処置と同様に変換されます。
2. 最適な増幅用プライマーの CpG のジヌクレオチドを回避し、100-300 bp 間増幅サイズをデザインします。
3. 設計されたプライマーを関数 BiSearch のプライマー検索を使用してミトコンドリア DNA を特定を確認します。既に設計されていた重亜硫酸塩の変換プライマーを挿入、重亜硫酸塩ボックスをチェックして、参照ゲノムと PCR パラメーターを含めます。
   注: 可能な PCR の製品の一覧が表示されます。
4. 上の 1-5 のプライマー シーケンスをコピーし、オリゴヌクレオチド合成用注文フォームに貼り付けます。
   注: 人間のリスト、表 1に実験室で検証されているマウス mtDNA のプライマー シーケンスが表示されます。
5. 重亜硫酸塩を使用してテスト プライマー PCR 次 agarose のゲルの電気泳動のステップ 4 で説明したように変換。テストおよび個別にすべてのプライマー対を最適化し、正しい私アンプリコン サイズ agarose のゲルに表示されることを確認します。
   注: 多重プライマーが必要な場合追加 1 つに複数のプライマー PCR の反作用が単一し、PCR の製品 agarose のゲルの電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動法、類似の製品を区別するなどより resolutive 法に可視化サイズ。

4. 重亜硫酸塩 PCR およびゲルの抽出の変換

1. 興味の地域を増幅するには、ホット スタート Taq ポリメラーゼを用いた PCR を実行します。ミックス 100 ng 変換 DNA、500 μ M と反感覚プライマー、1 μ L dNTP ミックス (各 dNTP の 10 μ M)、およびポリメラーゼ 7.5 U/総量が 50 μ L の反応で簡単に言えば、以下の条件で PCR を実行: 95 ° C で 5 分間 (60 秒 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s72 ° C) 35 サイクル10 分 72 ° c.別々 にどちらかのプライマーを使用または多重化します。
2. 省略可能: プライマーを多重化、200 ng を使用変換 DNA および次のサイクリング条件: 5 分 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 サイクル10 分 72 ° c.
   注: 温度はプライマーの溶ける温度に応じて異なる場合があります。
3. 100 ボルトで 2% アガロースゲル電気泳動のゲルに主題の PCR の製品。
4. 穏やかな紫外線の下でメスと PCR の製品を抽出し、マイクロ チューブに追加。Pcr は DNA の損傷を避けるために過剰な紫外線には公開されません。30 以上の露光時間を避ける s。
5. ³を前述のようにゲルの浄化を使用して PCR の製品を浄化します。
6. 4.5 の手順から精製した DNA の定量化法を使用して。ステップ 5 または-20 ° C でストアのサンプルに進みます

5. ライブラリの準備をシーケンス処理重亜硫酸塩

1. 重亜硫酸塩の変換された PCR の製品のライブラリの準備を実行します。
   オプション: この段階で PCR の製品を多重化します。
2. 最後修復まで 100 を使用してを実行 PCR の製品の ng。0.2 mL チューブで 55.5 μ L PCR の製品に 3 μ L 終わり準備酵素と 6.5 μ L 終わり修復反応バッファー (10 倍) を追加します。孵化後 65 ° C で 30 分に 20 の ° C で 30 分間熱 cycler でチューブを置き、
3. 15 μ L ブラント/TA リガーゼ ミックス、2.5 μ L と終わり修理 DNA を混合することによりシーケンス アダプターを縛るアダプターと 1 μ L 結紮エンハンサー。使用して場合 < 入力として 100 ng の PCR の製品を希釈アダプター 10 倍。
4. サーマルサイクラーにミックス (ステップ 5.3) を置き、20 ° C で 15 分間加温熱 cycler を一時停止し、ユーザー 3 μ l 添加チューブに酵素。ミックスし、サーマルサイクラーに戻って、チューブを置き、37 ° C で 15 分間加温
5. サイズは、PCR の製品のサイズによって DNA にビーズの比を変化させた固体可逆的相固定 (スプリング) ビーズを使用してアダプター結紮 DNA を選択します。
6. ステップ 5.4 と 55 μ L 再停止 SPRI ビーズからアダプター結紮 DNA に 13.5 μ L H₂O を追加します。マグネット スタンドに 5 分と場所の管の室温で孵化させなさい。ソリューションが明確な上清を新しいチューブに転送し、ビーズを含むチューブを破棄します。
   メモ: 上清に含まれるアダプター結紮 DNA と大きい不要なフラグメントは破棄されたビーズにバインドされます。
7. ステップ 5.6 から上澄みを 25 μ L 再停止 SPRI ビーズを追加、ミックス、室温で 5 分間インキュベートします。マグネット スタンドにチューブを置き、解決策が明確なときに上澄みを廃棄します。
   注: 破棄された上澄みの不要な DNA はアダプター結紮 DNA がビーズにバインドされているに対しに含まれています。
8. チューブは、マグネット スタンドには、ビーズを洗浄する (新鮮な) 200 μ L 80% エタノールを追加します。孵化 30 s と削除および破棄上清。2 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。
9. 空気乾燥ビーズ チューブ中 5 分オープンふた付きのマグネット スタンドです。
10. 磁石からチューブを削除、23 μ L の溶出バッファーで DNA を溶出してミックスします。2 分間室温でインキュベートします。
11. マグネット スタンドにチューブを置き、明確なソリューションでは、2 μ L 前 PCR 増幅 (ステップ 5.14) のための 96 ウェル PCR プレートに転送します。
12. 残り約 21 μ L を新しい 0.2 mL チューブ pcr (ステップ 5.17) に転送します。
    注: するビーズは、次のステップの酵素反応を抑制することが、すべてのビーズを転送しないようにしてください。
13. 5.14 のステップまたは-20 ° C でストアのサンプルに進みます
14. アダプター結紮 DNA を増幅するために必要なサイクルの数を推定する RT qPCR による事前 PCR 増幅を実行します。反応あたり 96 ウェル PCR で次プレート含む 2 μ L の DNA (ステップ 5.11) 追加: 0.4 μ L インデックス プライマー、0.4 μ L 普遍的な PCR プライマー、7.2 μ L H₂O、10 μ L RT qPCR マスター ミックス。
15. リアルタイム PCR マシンでプレートを置き、プレートを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 秒 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 サイクル5 分 65 ° C
16. 1 つの Ct 値の中古増幅 Rt-qpcr PCR の反作用のリニア フェーズの終了に対応する Ct 値を差し引くことによって各サンプルに必要な増幅サイクル数を推定します。
17. 混合することによってステップ 5.12 からアダプター結紮 DNA を増幅する: 21 μ L の DNA、25 μ L の PCR マスター ミックス、1 μ L インデックス プライマー、1 μ L の普遍的な PCR のプライマー、2 μ L H₂o.熱 cycler で各サンプルを次の条件に対象: 30 98 ° c s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C)サイクルの [ステップ 5.16 から計算される Ct];5 分 65 ° C
    注: はのみを可能にする多重サンプルあたり 1 つのインデックスのプライマーを使用してください。インデックスは、PCR の間に挿入されます。
18. 増幅された DNA SPRI ビーズを浄化し、22 μ L の溶出バッファーで溶出します。
19. ゲル電気泳動法または代替法によるライブラリの品質を制御します。正しいライブラリ ピーク サイズ (PCR の製品のサイズおよびアダプター) を探します。
20. 塗抹標本によるライブラリ製品の平均塩基対サイズを予測: 高度なグローバル設定で塗抹標本分析の下で「テーブル」をダブルクリックします。100-1000 bp から地域を定義し、 [ok]をクリックします。地域の表で、[定義された領域が表示され、ライブラリの平均サイズ (bp) が計算されます。
21. 蛍光分析によるライブラリを定量化します。ステップ 6 または-20 ° C にてストア ライブラリに進みます

6. 次世代シーケンシング

1. 数式を使用してライブラリの nM 濃度を計算します。
   
2. 同じ nM 濃度など 2 nM にライブラリを希釈 (4 を選択する nM、2 nM、1 nM、または 0.5 nM ライブラリ濃度に応じて)。2 nM ライブラリのプールを達成するためにすべてのライブラリをプールします。
3. 変性し、シーケンス楽器ガイドに従ってライブラリを希釈します。一言で言えば: 2 nM プールを 0.2 N 水酸化ナトリウムを追加することによって変性し、5 分 Dilute 22 の最終希釈する変性のプールの室温で孵化させなさい。変性し、12:05 の最終希釈する市販コントロール ライブラリを希釈します。新しいチューブ 20 %12: 05 コントロール ライブラリと 22 プールを混ぜます。
   注: 重亜硫酸塩の変換は、非常に低い複雑さを紹介します。20% コントロール ライブラリ スパイクより良い品質になります。
4. ディープ シーケンス器具を使用して 150 bp ペアエンド シーケンスを実行します。

7. 解析 - 見積もりのメチル化レベル

1. (ここで、sample1_R1.fastq.gz と sample1_R2.fastq.gz と呼ばれる) .fastq ファイルを生成、関心の全体のゲノムのビスマルクのインデックスを生成する (ここではbismarkIndexと呼ばれるフォルダー) しているのゲノム配列を fasta で利用可能に形式 (ここでいるという名前のフォルダー)。
2. アダプターおよびプライマーによって導入された先入観を削除する読み取り前処理: Trim_galore³³] ツールを使用します。前方および逆引きの両方の読み取りの 5' 末端からヌクレオチドの 2 つを削除します。
   trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o--trim1 - ペア/sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz。
3. ビスマルク³⁴を使用して全体のゲノムにあらかじめ処理された読み取りを配置します。
   ビスマルク - 蟻 - bam o/./bismarkIndex/-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz。
   注: 別アライナを使用する場合は、一意に配置することはできません読み取りが破棄されることを確認します。
4. 抽出読み取り M、ここでSamtools³⁵を使用して染色体へのマッピング
   samtools ソート l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
   sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
   samtools インデックス sample1_sorted.bam
   samtools -u sample1_sorted.bam いるを表示 |samtools ソート-n-o BAM -o sample1_chrM.bam
5. メチル化情報を抽出します。
   bismark_methylation_extractor -p-CX ― cytosine_report ― ― 包括的な genome_folder./いる./sample1_chrM.bam
6. さらなる分析のため、.bedGraph や、.cov CX_report.txt ファイルを使用します。Sample1_chrM.CX_report.txt ファイルを使用して、可視化とテストします。
7. 複数の領域を尋問し、プライマーのバイアスは、マッピング中に生成された M バイアス プロットで表示ことがある場合、前処理の段階でさらにクリッピングを実行します。詳細についてはビスマルクのマニュアルを参照してください。

8. 解析 - 違いのテスト

1. CX_report.txt ファイルがすべて C M 染色体上の 7 列、染色体 (ここでいる)、位置、ストランド、メチル化された読み取りの数、非メチル化読み取り、C コンテキストおよび周囲のシーケンスの数含まれていることを確認します。
2. CX_report は、そのままの状態でいるをカバーして、サブセットは増幅される領域をチェックしてください。
3. 個々 の c さんのフィッシャーの正確なテストまたは地域全体の符号テストなどのサンプル間の差は非パラメトリック テストを使用します。
   注: 定量化頻繁に近くなります 0% メチル化、正規性の仮定が適切な理由であります。
4. 同様に、可視化、分位数を視覚化または二項割合の信頼区間を計算します。

結果

ミトコンドリア Dna のメチル化を調査する場合に、このプロトコルの 2 つのステップが重要です。1) 二次構造と 2) ミトコンドリア DNA 特異プライマーの設計の開口部。

制限酵素病原 (図 1) ヒトのゲノム DNA を消化によってミトコンドリア DNA の構造は塩基位置 14,258 カットされ、二次構造が表示されま...

ディスカッション

ここでは、ミトコンドリア Dna のメチル化を尋問するとりわけ設計されている重亜硫酸塩シーケンス プロトコルを提供します。重亜硫酸塩の配列使用プロトコルの DNA との違いは NUMT シーケンスから偽陽性発生して事前の制限の酵素の消化手順とバイオ情報解析の活用にあります。

ミトコンドリア Dna メチル化を調査するとき、重亜硫酸塩の配列のアーティファクトを除?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA methylation-lightning kit	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
High Sensitivity DNA chip	Agilent	# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
Sodium hydroxide	Sigma	# S5881
Thermal cycler C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	#1855195
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq instrument	Illumina	# SY-410-1003