Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.

Resumen

Cuantificación de la metilación del ADN puede lograrse utilizando secuenciación de bisulfito, que aprovecha la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo, en un contexto de ADN monocatenario. Secuenciación de bisulfito puede ser dirigida (mediante PCR) o en todo el genoma y proporciona la cuantificación absoluta de la metilación de la citosina en la sola base-resolución. Dada la naturaleza distinta del ADN nuclear y mitocondrial, en particular en la estructura secundaria, deben realizarse adaptaciones de métodos de secuenciación de bisulfito para la investigación de metilación de citosina en el ADNmt. Estructura secundaria y terciaria del mtDNA puede de hecho conducir a bisulfito de secuenciación artefactos llevando a falsos positivos debido a la deficiente acceso desnaturalización incompleta de bisulfito a ADN monocatenario. Aquí, describimos un protocolo con una digestión enzimática del ADN BamHI juntada con tubería de análisis bioinformáticos para permitir la cuantificación exacta de la citosina niveles de metilación en el ADNmt. Además, proporcionamos las pautas para el diseño de los cebadores de secuencia de bisulfito específicos de mtDNA, para evitar dirigidos a segmentos NUclear mitocondrial indeseables (NUMTs) insertan en el genoma nuclear.

Introducción

El genoma mitocondrial es una estructura circular, doble cadena de aproximadamente 16,5 kilos base (kb), lo que constituye de un pesado y un filamento de la luz. El genoma mitocondrial está presente en múltiples copias en cada célula, maternal heredado y codifica componentes esenciales de la cadena respiratoria complejos¹. Similar a los genomas bacterianos y a diferencia del genoma nuclear, el genoma mitocondrial se organiza en numerosas estructuras secundarias y terciarias, como en las estructuras en espiral y superenrollado², que puede hacer que acceso difícil durante la secuencia experimentos³.

En el núcleo, la metilación del ADN es una marca epigenética ampliamente estudiada que interviene en numerosos procesos, en particular en la regulación de la expresión génica. En genomas mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición 5 del anillo de pirimidina de deoxycytidines, sobre todo en los dinucleótidos CG (o CpG). Metilación de la citosina se encuentra en el 70% de los CpG en el genoma de las células somáticas y ~ 1% del total que bases de ADN⁴. Metilaciones del ADN se ha descrito también en contextos no-CpG, CpC, CpA y CpT y existen en cantidades diferentes en el ADN nuclear, con valores de hasta un 25% de todos los cytosines metilados en células madre embrionarias^5,6,7.

Mientras que la metilación de la citosina del genoma nuclear es ampliamente aceptada, la existencia de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial es aún controversial. La metilación de mtDNA investigadora primer estudio fue realizada en células cultivadas donde mtDNA metilación fue detectada fácilmente, aunque en niveles más bajos en comparación con el ADN nuclear⁸. En las células humanas y murinas, metilación del mtDNA también fue detectada en niveles bajos (2-5%). Usando análisis basándose en 5 METILCITOSINA captura como inmunoprecipitación de ADN metilada (MeDIP) seguida de PCR cuantitativa, metilación del mtDNA también fue detectada en varios ratón y humanos y células líneas^{9,10, 11,12}. Usando los anticuerpos contra 5-METILCITOSINA en un ensayo ELISA o espectrometría de masas, niveles considerables de metilación del ADN fueron detectados de fracciones purificadas mitocondriales^{13,14,15, 16}. sin embargo, la mayoría de los ensayos en los estudios antes mencionados utiliza técnicas que no fueron diseñadas para proporcionar la cuantificación absoluta de la metilación del ADN en la sola resolución de base.

Análisis de metilación de DNA cuantitativo y resolutivo puede lograrse mediante una técnica llamada "bisulfito de secuenciación", que se aprovecha de la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo en single-stranded DNA contexto¹⁷ . Mediante secuenciación de bisulfito, una constelación de estudios ha detectado la presencia de metilación de citosina en los distintos niveles. MtDNA de la metilación de la región D-loop, el 12S o la región 16S fue detectado fácilmente en humanos^{18,19,20,21,22,23} y ratón²⁴ tejidos y células, sin embargo, con una variabilidad intrigante, de 1-20% del total cytosines en estudios.

En comparación con estos numerosos estudios, sólo unos pocos estudios, como de nuestro grupo, han disputado la presencia de mtDNA metilación^3,25,26,27 o cuestionado la importancia biológica de niveles muy bajos de mtDNA (por debajo de 2%)²⁸. Recientemente, informó de la observación de un artefacto de bisulfito de-secuencias posibles en todo mitocondrial bisulfito secuencia³. Proporcionamos evidencia que la estructura secundaria del ADN mitocondrial podría dar lugar a falsos positivos en secuenciación de bisulfito, así sobreestimar los niveles de metilación. Aquí proporcionamos un protocolo para evitar que un artefacto de bisulfito-conversión del ADNmt. Este protocolo utiliza una simple digestión enzimática del ADN para desarticular estructuras secundarias de mtDNA y permitir un acceso completo a siguiendo un protocolo de secuencia de bisulfito bisulfito. Además, ofrecemos un acompañamiento pipeline bioinformática para el análisis de secuenciación de bisulfito.

Protocolo

1. tratamiento enzimático de la restricción

1. Alinear el mtDNA por tratar el DNA humana total con la enzima de restricción BamHI, que corta en la posición 14258 en el ADN mitocondrial humano.
   Nota: Para ADN de ratón, utilice la enzima de restricción BglII en condiciones idénticas como abajo.
2. Para cada muestra donde metilación del mtDNA es evaluarse, preparar un tubo de reacción de 0.2 mL y añadir el siguiente mezcla: 3 μg ADN genómico (cuantificado por fluorometría), 15 μL tampón 3, 3 μL BamHI y agua hasta de 150 μL
3. Colocar los tubos en un termociclador durante 4 h a 37 ° C.

2. bisulfito conversión

1. Convertir el ADN BamHI-tratado con bisulfito de sodio como se describe en otra parte²⁹.
2. Utilizar 200-500 ng de ADN tratados con BamHI para cada reacción de conversión en un volumen total de 20 μL. La recuperación de ADN es 50-70%.
3. Eluir la DNA bisulfito-convertido en tampón de elución de 10 μL.
4. Cuantificar el ADN por fluorometría.
5. Opcional: Almacenar DNA bisulfito-convertido a-20 ° C antes de continuar el resto del protocolo. Para el almacenamiento a largo plazo, almacenar DNA bisulfito-convertido a-80 ° C

3. diseño de bisulfito de cebadores de secuencia

1. Diseño de iniciadores para la secuenciación de bisulfito usando las herramientas en línea Methprimer³⁰ y^31,de BiSearch³².
   Nota: Methprimer y BiSearch permiten para buscar secuencias de primer enlace en secuencias genómicas donde cytosines se convierten en thymines, semejantemente al bisulfito post tratamiento.
2. Para la amplificación óptima e imparcial, evitar dinucleótidos CpG en las cartillas y diseñar el tamaño de amplicón entre 100-300 bp.
3. Que sean diseñados primers específicos para el ADN mitocondrial usando la función de BiSearch Primer búsqueda. Inserte los cebadores ya diseñados bisulfito convertido, marque la casilla de bisulfito e incluyen un genoma de referencia y parámetros de la polimerización en cadena.
   Nota: Se mostrará una lista de posibles productos PCR.
4. Copiar la parte superior de secuencias de la cartilla de 1-5 y pegar en un formulario de pedido para síntesis de oligonucleótidos.
   Nota: Una lista de los humanos y secuencias de la cartilla de mtDNA ratón que ha sido validado en el laboratorio se muestra en la tabla 1.
5. Cartillas de prueba utilizando bisulfito convierten PCR después de electroforesis en gel de agarosa como se describe en el paso 4. Probar y optimizar por separado todos los pares de la cartilla y el tamaño de amplicón correcta aparece en el gel de agarosa.
   Nota: Si necesitan cebadores multiplexación, añadir cartillas múltiples a una sola reacción de PCR y visualizar los productos PCR en electroforesis en gel de agarosa o, un método más resolutivo como electroforesis en gel de poliacrilamida, para distinguir productos de similares tamaño.

4. bisulfito convertido PCR y extracción del Gel

1. Para amplificar las regiones de interés, realizar PCR utilizando una polimerasa de Taq hot start. Brevemente, mezcla 100 ng convertido ADN, 500 μm cebadores sentido y anti-sentido, mezcla de dNTP 1 μl (10 μm de cada dNTP) y polimerasa en 7,5 U reacción en un volumen total de 50 μl. ejecutar PCR con las siguientes condiciones: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Utilizar cebadores ya sea por separado o multiplexados.
2. Opcional: Al multiplexación cartillas, uso 200 ng convierte en ADN y las siguientes condiciones bicicleta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 ciclos; 10 min 72 ° C.
   Nota: La temperatura puede variar dependiendo de la temperatura de fusión de los primers.
3. Productos PCR sujetos a gelificarse electroforesis en agarosa al 2% de 100 voltios.
4. Bajo la suave luz de UV, extraer productos de PCR con un bisturí y añadir a microtubos. No exponga los productos PCR a la luz UV excesiva para evitar daños en el ADN. Evitar el tiempo de exposición de más de 30 s.
5. Purificar los productos PCR usando gel de purificación como se describió anteriormente³.
6. Cuantificar el ADN purificado de paso 4.5 mediante fluorometría. Proceda al paso 5 o del almacén de muestras a-20 ° C.

5. secuencia biblioteca elaboración de bisulfito

1. Realizar la preparación de la biblioteca de productos PCR convertido a bisulfito.
   Opcional: múltiplex productos de PCR en esta etapa.
2. Realizar reparación final con hasta 100 ng del producto de PCR. Agregar 3 μl final preparación enzima y 6,5 μl finales reparación reacción de tampón (10 x) a 55,5 μl del producto de PCR en un tubo de 0.2 mL. Lugar e incubar los tubos en un termociclador durante 30 min a 20 ° C, seguida por 30 min a 65 ° C.
3. Ligan adaptadores de secuencia mezclando el ADN reparado final con 15 μl Blunt/TA ligasa mezclar, 2,5 μl adaptador y potenciador de la ligadura de 1 μl. Si utiliza < 100 producto PCR de ng como entrada, adaptador de diluir 10 veces.
4. Colocar la mezcla (paso 5.3) en un termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Hacer una pausa en el termociclador y agregar 3 μl usuario enzima al tubo. Mezcla y vuelva a colocar el tubo en el termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.
5. Tamaño Seleccione el ADN ligada adaptador usando granos de sólido fase Reversible inmovilización (SPRI) con diferentes proporciones de granos al ADN dependiendo de tamaño del producto PCR.
6. Añadir 13,5 μl de H₂O a ADN ligada adaptador de paso 5.4 y 55 μl resuspendió SPRI granos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lugar el tubo sobre un soporte magnético. Cuando la solución esté clara, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el tubo que contiene los granos.
   Nota: El sobrenadante contiene el ADN ligada adaptador y grandes fragmentos no deseados están limitados a los granos descartados.
7. Añadir 25 μl resuspendió SPRI cuentas al sobrenadante del paso 5.6, mezclar e incube durante 5 min a temperatura ambiente. Coloque el tubo en el soporte magnético y descarte el sobrenadante cuando la solución es clara.
   Nota: El sobrenadante desechado contiene ADN no deseado, mientras que el ADN ligada por el adaptador está enlazado a granos.
8. Mientras el tubo está en el soporte magnético, agregar 200 μL 80% de etanol (recién preparado) para lavar los granos. Incubar 30 s y quite y descarte el sobrenadante. Repita este paso para un total de 2 lavados.
9. Aire seco granos durante 5 minutos mientras que el tubo está en soporte magnético con una tapa abierta.
10. Retirar el tubo del imán, eluir el ADN en 23 μl de tampón de elución y mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
11. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y cuando la solución esté clara, transferir 2 μL en una placa PCR de 96 pocillos para la amplificación de pre-PCR (paso 5.14).
12. Transferir el resto aproximadamente 21 μl a un nuevo tubo 0.2 mL para amplificación por PCR (paso 5.17).
    Nota: No olvide transfiera cualquier granos como granos pueden inhibir reacciones enzimáticas de los próximos pasos.
13. Proceder a paso 5.14 o almacén de muestras a-20 ° C.
14. Realizar la amplificación por RT-qPCR para estimar el número de ciclos necesarios para amplificar el ADN ligada adaptador pre-PCR. Por reacción, añadir lo siguiente en la PCR de 96 pocillos de la placa que contiene de 2 μl ADN (paso 5.11): 0,4 μL índice la cartilla, cartilla PCR universal de 0.4 μL, 7,2 μl de H₂O, 10 μl RT-qPCR master mezclar.
15. Colocar la placa en una máquina PCR en tiempo real y someter la placa a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) 20 ciclos; 5 min 65 ° C.
16. Estimar el número de ciclos de amplificación necesarios para cada muestra al restar un valor de Ct para el Ct-valor de la amplificación previa RT-qPCR correspondiente al final de la fase lineal de la reacción de PCR.
17. Amplificar el ADN ligada adaptador de paso 5.12 mezclando: 21 μl ADN, 25 μl PCR master mix, 1 μl índice la cartilla, cartilla de PCR Universal de 1 μl y 2 μl de H₂O. En un termociclador, tema cada muestra a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) [Ct calculado en el paso 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C.
    Nota: Recuerde utilizar solamente un primer índice por muestra para permitir la multiplexación. El índice se inserta durante la PCR.
18. Purificar las cuentas SPRI ADN amplificadas y eluir en 22 μL de tampón de elución.
19. Control de calidad de la biblioteca por gel electroforesis o alternativa método. Buscar tamaños de pico biblioteca correcta (tamaño de producto PCR más adaptador).
20. Estimar el tamaño promedio de pares de base de los productos de la biblioteca por el análisis de frotis: en avanzada configuración global, haga doble clic en "tabla" bajo análisis de frotis. Definir la región de 100-1000 bp y haga clic en Aceptar. Debajo de la Mesa de la región, la región definida aparece y se calcula el tamaño promedio de la biblioteca (bp).
21. Cuantificar las bibliotecas por fluorometría. Proceda al paso 6 o bibliotecas de tienda a-20 ° C.

6. la siguiente secuencia de generación

1. Calcular la concentración de nM de bibliotecas mediante la fórmula:
   
2. Diluir las bibliotecas para el mismo nM de concentración por ejemplo de 2 nM (elegir 4 nM, 2 nM, 1 nM y 0,5 nM dependiendo de las concentraciones de la biblioteca). Todas las bibliotecas para conseguir una piscina de 2 bibliotecas nM de la piscina.
3. Desnaturalizar y diluir las bibliotecas siguiendo la guía de instrumento de la secuencia. En Resumen: desnaturalizar la piscina nM 2 mediante la adición de 0.2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente durante 5 min diluir la piscina desnaturalizada a una dilución final de 22:00. Desnaturalizar y diluir una biblioteca de Control disponible en el mercado a una dilución final de 12:05. A un tubo nuevo, mezcla de la piscina de 22:00 con la biblioteca de Control 20% 12:05.
   Nota: Conversión de bisulfito presenta muy baja complejidad. 20% control biblioteca spike en resultará en una mejor calidad de la secuencia.
4. Ejecute una secuencia de extremo apareado de 150 bp usando un instrumento de secuenciación profunda.

7. Computación Análisis - niveles de metilación de estimación

1. Generar archivos de .fastq (aquí llamados sample1_R1.fastq.gz y sample1_R2.fastq.gz), generar un índice de bismark de la totalidad del genoma de interés (aquí en una carpeta llamada bismarkIndex) y asegúrese de que la secuencia genomic de chrM está disponible en fasta formato (aquí en una carpeta llamada chrM).
2. Procesamiento previo de Lee para eliminar el sesgo introducido por los iniciadores y adaptadores: utilizar la herramienta Trim_galore³³. Quite dos nucleótidos del extremo 5' de Lee hacia adelante y hacia atrás.
   trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1 - junto sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
3. Alinee el preprocesado lee el genoma entero con Bismark³⁴
   Bismark, cola de pato - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
   Nota: Si se utiliza otro alineador, asegúrese de que dice que no puede ser alineado únicamente se descarta.
4. Extracto de Lee traz al cromosoma M, utilizando aquí Samtools³⁵
   samtools tipo -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
   sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
   samtools índice sample1_sorted.bam
   samtools ve -u sample1_sorted.bam chrM | samtools tipo - n - O BAM -o sample1_chrM.bam
5. Extraer la información de la metilación
   bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--completo--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam
6. Use el .bedGraph, la COV o los archivos de CX_report.txt para su posterior análisis. Utilice el archivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualización y pruebas.
7. Realizar más recortes en el paso de preprocesamiento, si varias regiones son interrogadas y un sesgo de la cartilla puede ser visible en las parcelas M-sesgo generadas durante la asignación. Consulte la documentación de Bismark para obtener más información.

8. computación de análisis - prueba de las diferencias

1. Asegúrese de que el archivo CX_report.txt contiene 7 columnas, cromosoma (aquí chrM), posición, filamento, número de lecturas metilados, el número de lecturas unmethylated, C contexto y secuencia circundante, para cada C en el cromosoma M.
2. Como la CX_report cubre chrM en su totalidad, compruebe el subconjunto a la región o regiones que se amplifica.
3. Utilizar pruebas no paramétricas para las diferencias entre las muestras, como la prueba exacta de pescadores individuales c o una prueba de signo para toda la región.
   Nota: Cuantificación a menudo estará cerca de 0% de metilación, que es la razón por qué no es apropiado asumir normalidad.
4. Del mismo modo, para la visualización, visualizar cuantiles o calcular intervalos de confianza de la proporción binomial.

Resultados

Dos pasos en este protocolo son cruciales al investigar metilación del mtDNA. 1) la apertura de la estructura secundaria y 2) el diseño de iniciadores específicos de ADN mitocondriales.

Por digerir el ADN genómico humano con la enzima de restricción BamHI (figura 1), se reducirá la estructura del ADN mitocondrial en la posición del nucleótido 14.258 y se abrirá la estructura secundaria.

...

Discusión

Presentamos un protocolo de secuenciación del bisulfito que está específicamente diseñado para interrogar a metilación del mtDNA. Las diferencias con la secuenciación del bisulfito de protocolos utilizados para la extracción de ADN genómico se encuentra en la utilización de un paso de digestión de la enzima de la restricción anterior y un análisis Bioinformático predominante hacia fuera falso positivo derivados NUMT secuencias.

Proporcionamos un protocolo para evitar artefactos de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA methylation-lightning kit	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
High Sensitivity DNA chip	Agilent	# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
Sodium hydroxide	Sigma	# S5881
Thermal cycler C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	#1855195
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq instrument	Illumina	# SY-410-1003